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已知蓝斑（LC）等皮层下结构能够调节瞳孔关联的自主神经唤醒，而皮层回路在此过程中的作用仍不明确。研究人员设计了一个闭环光遗传学系统，用于在瞳孔扩张期间实时失活前扣带皮层（ACC）。ACC失活降低了自发瞳孔事件的幅度。与此同时，ACC群体活动的强度与自发发生
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已知蓝斑（LC）等皮层下结构能够调节瞳孔关联的自主神经唤醒，而皮层回路在此过程中的作用仍不明确。研究人员设计了一个闭环光遗传学系统，用于在瞳孔扩张期间实时失活前扣带皮层（ACC）。ACC失活降低了自发瞳孔事件的幅度。与此同时，ACC群体活动的强度与自发发生的瞳孔扩张幅度呈比例关系。除了调节自发唤醒外，ACC对显著感觉刺激的反应也与诱发的瞳孔扩张大小成比例，且ACC失活抑制了显著性关联的瞳孔事件。最后，研究人员发现蓝斑去甲肾上腺素（LC-NE）神经元比ACC更早发出唤醒信号。然而，与ACC不同，LC反应并不随瞳孔扩张幅度成比例变化。综上所述，本实验确定了ACC是维持瞳孔关联唤醒瞬时增加的关键皮层位点。
论文解读：
研究背景与动机
大脑的一个基本特征是其心理生理变化（如自主神经唤醒）能够与内部认知、情感、行为及神经生理状态进行自适应耦合。大量证据表明，多个皮层下结构（如释放去甲肾上腺素的蓝斑和胆碱能基底前脑）参与调节自主神经唤醒。然而，在不同行为及内部情境中，自主唤醒状态的自适应调制还需要来自整合性皮层区域的“自上而下”调控，这些区域能够接收传递外部和内部信息的多种输入。前扣带皮层（ACC）被认为在此过程中扮演关键角色。ACC向多个协调唤醒的神经调制核团提供直接和间接的输出，并与多种子皮层核团（如导水管周围灰质、上丘和下丘脑后部）存在联系。ACC涉及奖励处理、反应选择、错误监控、情绪及费力活动等多种过程。现代ACC功能模型认为，这些多样角色可以通过一个潜在的整合过程来解释，该过程调控认知控制的分配时机、位置和方式，以实现适应性行为。因此，ACC在功能和解剖学上都处于参与特定情境/任务的自主神经唤醒的“自上而下”控制的位置。
任务相关的瞳孔大小变化反映了交感神经自主活动，并与心血管和皮肤电的唤醒指标相关，能够预测多种任务的表现。ACC在自主唤醒与行为表现关系中的参与，在不同任务和物种中均有一致表现。人类神经影像学研究显示，费力的运动或心理活动会募集与ACC激活相关的心血管唤醒。在Stroop任务中，ACC在背侧和吻侧分区的激活与试次间的瞳孔关联自主唤醒变化相关，且部分ACC位点显示出受自主唤醒和表现错误的共同调制。人类病变研究提供了尤其有力的证据，表明ACC损伤会削弱由费力心理活动诱发的自主反应。这些发现证明了ACC对任务特异性自主唤醒状态调制的重大贡献。
自主唤醒和认知状态除了表现出任务依赖性调制外，还会自发波动。在人类中，瞳孔关联的自主唤醒与静息清醒状态下的皮层唤醒脑电图特征相关。小鼠的多项研究同样表明，自发唤醒变化是皮层活动变化的关键决定因素。自发皮层活动的状态依赖性被认为部分源于多种神经调制影响及其他长程输入的汇集，其中许多与ACC存在解剖学上的互连。这表明ACC可能在任务和非任务关联状态下对唤醒进行“自上而下”控制。一项非人灵长类的单单元记录显示，在瞳孔关联唤醒自发增加之前，一小部分背侧ACC神经元活动增强。然而，ACC对自发唤醒的功能贡献在很大程度上仍未得到阐明。
研究目的与技术方法概述
本研究利用头固定小鼠系统，探究ACC对瞳孔关联唤醒自发波动的贡献。许多先前研究已记录到，在无实验刺激或任务关联的情况下，头固定小鼠会自发产生瞳孔大小的变化。与先前工作一致，本研究发现瞳孔增大之前会出现与啮齿类动物探索行为相关的面部运动，表明运动活动驱动了交感神经关联的瞳孔增大。研究人员利用此系统来确定“自上而下”的ACC活动如何促成瞳孔关联唤醒状态的自发变化。
为了测试ACC在唤醒调制中的作用，研究人员设计了一个基于实时瞳孔大小跟踪的闭环ACC抑制系统。在自发瞳孔扩张期间进行光遗传学ACC抑制，显著降低了正在进行扩张事件的幅度和持续时间。与ACC在唤醒调制中的作用一致，更大的自发瞳孔事件与更高的ACC群体钙活动相关。听觉刺激诱发的瞳孔反应在幅度上与ACC活动成比例，并被ACC失活所抑制，表明ACC同时调节自发和显著性关联的唤醒反应。最后，比较ACC和去甲肾上腺素能LC（LC-NE）活动表明，唤醒相关的LC活动先于ACC激活。虽然ACC活动与瞳孔扩张事件的幅度成比例，但LC活动未显示出这种调制。这些实验共同表明，ACC活动调节了运动驱动和显著性关联唤醒状态的强度，并将此前额叶皮层区域确立为唤醒调制的皮层位点。
研究人员采用了多种关键技术方法：
- 1.
动物模型与手术：使用C57BL/6J、VGAT-Cre及DBH-Cre KI转基因小鼠，在逆转光/暗周期下于活跃暗相进行实验。通过立体定位注射将病毒载体递送至目标脑区，并植入光纤套管用于后续的光遗传学操控或光纤光度记录。
- 2.
行为与生理信号量化：使用红外相机记录小鼠面部视频，利用DeepLabCut软件实时或离线追踪瞳孔轮廓并计算瞳孔面积。通过面部感兴趣区域（ROI）的逐帧像素强度差异量化面部运动。在部分实验中，通过连接编码器的转轮记录自主跑动速度。同时，通过脉搏血氧仪测量静息心率，以验证瞳孔大小作为自主唤醒指标的有效性。
- 3.
光遗传学操控：利用AAV病毒载体在特定神经元群体中表达光敏感蛋白。通过激活ACC的GABA能神经元（在VGAT-Cre小鼠中表达ChR2）实现ACC抑制；通过激活ACC的CaMKII阳性神经元（表达ChR2）实现ACC激活。采用开环（固定时间刺激）和基于实时瞳孔跟踪的闭环（在瞳孔扩张时触发）两种范式进行光刺激，并通过控制组（表达mCherry的病毒）排除病毒表达和光传递本身的影响。
- 4.
光纤光度记录：向目标脑区注射编码GCaMP钙指示剂的病毒，通过植入的光纤记录群体水平的神经元钙活动，同步采集行为信号，以分析ACC和LC-NE神经元活动与瞳孔大小、面部运动及跑动的关系。
- 5.
听觉刺激范式：在无特定任务背景下，向小鼠呈现随机频率的纯音，以研究ACC对显著性刺激诱发唤醒的调制作用。
- 6.
组织学验证：实验结束后，通过灌注固定、脑片制备和荧光成像，验证病毒表达范围和光纤植入位置。
研究结果
瞳孔关联的自主唤醒与面部运动和跑动相关
研究人员将自发自主唤醒定义为在没有实验刺激或任务关联的情况下，由瞳孔大小自我生成的波动所证实的交感神经激活。实验证实瞳孔大小是自主唤醒的可靠指标，其自发变化与静息心率变化一致。分析表明，瞳孔扩张平均由探索性运动驱动，短暂的面部运动诱发较小的瞳孔扩张，而大范围的跑动则与大幅、持续的瞳孔关联唤醒增加相关。
开环和闭环光遗传学ACC失活降低唤醒
通过光遗传学激活ACC局部GABA能神经元来抑制ACC活动。开环ACC失活降低了试验平均的瞳孔大小，而对照小鼠（仅表达mCherry）在相同条件下光刺激无此效应。ACC失活对面部运动无影响，表明在此条件下，ACC活动特异地调节由探索运动诱发的唤醒变化，而不大体影响运动本身。闭环光遗传学失活实验进一步证实，在检测到瞳孔扩张事件后实时抑制ACC，可降低瞳孔扩张事件的曲线下面积（AUC），并加速瞳孔在达到峰值后的收缩。作为对照，在初级视皮层（V1）进行类似失活对瞳孔大小无系统性影响，表明对瞳孔关联唤醒的抑制作用是ACC特异性的。
ACC活动与瞳孔扩张幅度成比例
通过光纤光度法同时记录ACC群体钙活动和行为。将ACC活动与瞳孔扩张对齐显示，ACC在瞳孔扩张开始前激活，并在面部运动开始后激活。ACC活动在瞳孔或面部事件期间的平均水平随事件幅度增加而增加，而事件开始前的ACC活动与峰值幅度无关。即使在区分跑动和非跑动状态后，ACC活动仍能追踪瞳孔大小。这些结果表明ACC活动与瞳孔扩张事件的幅度成比例。
光遗传学激活ACC神经元增加瞳孔关联唤醒和跑动
通过光遗传学激活ACC神经元，可增加瞳孔大小、跑轮速度和面部运动。瞳孔大小和跑动速度在光刺激期间持续增加，而面部运动则在刺激开始后短暂增加。在对照小鼠中，光刺激不改变瞳孔大小。ACC激活对唤醒和跑动的影响具有频率和时程依赖性。短时程（10毫秒）的ACC激活可增加瞳孔大小，但对跑动速度无显著影响，表明ACC活动可在不诱发跑动的情况下增加瞳孔关联唤醒。
ACC活动调节对显著刺激的瞳孔反应
在呈现听觉纯音时，ACC群体活动和瞳孔大小均增加。较大的音调诱发瞳孔反应与较大的ACC反应相关。在音调呈现前和呈现期间进行ACC失活，不仅降低了自发性瞳孔扩张，也抑制了音调诱发的瞳孔反应。ACC失活对音调诱发的面部运动反应无影响。这些结果表明ACC活动对显著性关联的唤醒有调制作用。
ACC和LC显示出独特的唤醒相关活动模式
比较ACC和LC-NE神经元的群体钙活动发现，LC活动与瞳孔大小的相关性低于ACC，而LC活动与面部运动的相关性高于ACC。与ACC不同，LC-NE的群体活动不随瞳孔扩张幅度成比例变化。LC-NE活动在瞳孔扩张开始时达到峰值并随后开始下降，而ACC活动在扩张开始前增加并在峰值扩张期间保持升高。时序分析显示，LC活动领先于瞳孔大小的时间显著多于ACC活动。将神经活动与瞳孔扩张和收缩的规范周期对齐分析表明，与LC活动相比，ACC活动在调节已启动的瞳孔扩张事件幅度方面处于更有利的位置。
讨论与结论
越来越多的研究认识到皮层活动存在广泛的唤醒状态依赖性调制。本实验表明，除了受唤醒调制外，ACC本身的皮层活动也能调节自发和显著性关联的唤醒状态。基于观察到瞳孔扩张始终先于面部运动，研究人员提出，在实验条件下，头固定小鼠中瞳孔关联唤醒的自发波动是由运动活动触发的。
ACC抑制减少了瞳孔大小，但不影响面部运动，这表明ACC调节了由探索运动诱发的瞳孔关联唤醒，而不大体影响运动本身。通过闭环光遗传学设计，研究人员证明在瞳孔扩张期间实时抑制ACC活动可抑制正在进行的唤醒事件。光纤光度记录显示，ACC群体钙活动的强度与唤醒事件的幅度成比例。长时间的光遗传学ACC激活可驱动唤醒的显著增加，进而导致行为状态转变（如跑动增加）。然而，短时程ACC激活可在不影响跑动的情况下增加唤醒，这表明ACC可独立于行为状态转变来调制瞳孔关联唤醒。研究发现，ACC活动还能调节显著性关联的唤醒，ACC活动与听觉音调诱发的瞳孔扩张幅度成比例，且ACC失活可抑制音调诱发的瞳孔反应。
比较唤醒相关的ACC和LC-NE活动表明，LC-NE活动可能触发唤醒事件，而ACC活动则对这些事件进行实时调制。与LC活动相比，ACC活动滞后于LC激活。这一事件顺序表明，在典型条件下，ACC活动不参与唤醒事件的发起。与LC-NE活动不同，ACC活动与瞳孔扩张的大小成比例，这表明ACC活动调节正在进行的唤醒事件。一种可能性是，瞳孔扩张开始前的ACC活动反映了来自LC-NE神经元及其他来源的神经调制输入。在这种解释中，神经调制输入触发了ACC活动的初始增加，随后的唤醒相关调制则由ACC内部的整合产生。
本研究的局限性包括：光纤光度法记录的是群体水平的活动，可能掩盖了单个神经元的功能异质性；通过激活GABA能神经元实现ACC失活，可能引起下游回路的活性变化，从而影响观察到的行为效应；未阐明ACC投射中负责唤醒调制的具体通路。未来研究需要在同一动物中以单神经元分辨率同时记录ACC和LC活动，并评估ACC操控对下游区域唤醒相关活动的影响。
总之，本研究结果与先前显示ACC和LC之间完整通讯是新颖环境诱导清醒所必需的发现一致。本研究进一步证明，ACC还在清醒期间实时调制瞳孔关联唤醒状态。这些发现可能有助于调和先前关于LC活动与瞳孔关联唤醒之间仅存在中度耦合的观察。研究表明，瞳孔关联唤醒的变异性部分反映了ACC活动。未来的实验需要确定神经调制输入如何促进ACC对唤醒的调制，以及ACC如何调节唤醒相关神经调制核团的活动。研究人员提出，ACC功能的统一解释包括基于任务特定目标和行为需求的、依赖于情境的唤醒调制。
研究结论翻译：
综上所述，我们的实验确定了前扣带皮层是维持瞳孔关联唤醒瞬时增加的关键皮层位点。
