RAB5c 调控 LC3 关联的吞噬作用以增强巨噬细胞的杀菌功能

《SCIENCE ADVANCES》：RAB5c orchestrates LC3-associated phagocytosis to promote microbicidal function of macrophages

　　

ATG8 蛋白（包括 LC3）与单层膜的非经典结合涉及自噬机制在非代谢应激相关的细胞功能中的作用。其中一条通路是 LC3 关联的吞噬作用（LC3-associated phagocytosis，LAP），它通过某些先天免疫相关受体介导的货物摄取，帮助吞噬体成熟和后续信号传导。本研究表明，控制早期内体运输的分子开关 RAB5 GTP 酶的一个特定亚型 RAB5c 是 LAP 所必需的。研究人员证明 RAB5c 调节巨噬细胞中生成磷脂酰肌醇 3-磷酸 [phosphatidylinositol 3-phosphate，PI(3)P] 和活性氧（reactive oxygen species，ROS）所需复合物的吞噬体募集和功能。RAB5c 促进 V-ATP 酶（V-ATPase）跨膜核心向吞噬体的转运，这是 ATG16L1 结合和随后的 LC3 结合所必需的。RAB5c 的缺失损害了巨噬细胞清除真菌病原体烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的能力，而破坏 V-ATP 酶–ATG16L1 轴则在体内增加了感染易感性。因此，早期内体到吞噬体的运输可以被选择性利用，通过引导吞噬体成熟向 LAP 方向进行，从而促进病原体的清除。

一、 研究背景与科学问题

固有免疫是抵御病原体入侵的第一道防线。巨噬细胞等吞噬细胞通过吞噬作用清除病原体，此过程涉及吞噬体的形成和成熟，包括与内体/溶酶体融合、酸化、降解等一系列精细调控步骤。自噬（autophagy）是一种细胞降解途径，其中自噬相关蛋白 8（ATG8）家族成员（如 LC3）与自噬体膜结合。研究发现，自噬机制成分可被用于一种称为“LC3 关联的吞噬作用”（LC3-associated phagocytosis, LAP）的非经典通路。LAP 在特定受体（如 Toll 样受体 TLR2/TLR4、C 型凝集素受体 Dectin-1、FcγR 等）激活后触发，利用自噬相关蛋白（如 RUBCN、VPS34 复合物、ATG16L1 复合物等）将 LC3 结合到单层膜的吞噬体上，从而调节吞噬体成熟、效应功能及后续信号传导。LAP 缺陷会导致巨噬细胞对多种病原体（如烟曲霉、沙门氏菌、李斯特菌等）的清除能力受损。

尽管已知 RAB GTP 酶（Ras-associated binding guanosine-triphosphatases）是控制膜运输的关键分子开关，且 RAB5 作为早期内体（early endosome, EE）的标志物，在吞噬体成熟过程中的内体-吞噬体融合中发挥重要作用，但 RAB5 的不同亚型（RAB5a, RAB5b, RAB5c）在 LAP 通路中是否存在特异性功能尚不清楚。同时，尽管已鉴定出 LAP 的多个组分，但它们如何被募集到吞噬体上并整合成一个统一的信号通路仍知之甚少。阐明 LAP 的时空组织对于理解感染、癌症和免疫失调背景下的固有免疫反应至关重要。

二、 研究设计与技术方法概览

本研究旨在探究早期内体-吞噬体相互作用在 LAP 中的重要性。研究主要使用了小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 和小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）作为模型。通过基因沉默（shRNA）、CRISPR-Cas9 基因敲除、过表达等手段，特异性操控 RAB5c 等基因的表达。利用活细胞实时成像、高分辨率及增强分辨率共聚焦显微镜、免疫荧光、免疫印迹、吞噬体纯化、相关光电子显微镜（correlative light–electron microscopy, CLEM）、内体免疫共沉淀（endosome immunoprecipitation, EndoIP）等技术，从时空动态、蛋白定位、复合物形成等多个层面分析了 RAB5c 在 LAP 通路中的作用。此外，研究还使用了烟曲霉野生型及其黑色素合成缺陷突变体（ΔpksP）感染巨噬细胞的体外模型，以及利用携带 ATG16L1 羧基端 WD40 结构域缺失突变（Atg16l1^ΔWD40）的小鼠，进行了体内肺部感染实验，以评估 RAB5c 及 V-ATP 酶–ATG16L1 轴在抗真菌免疫中的功能。

三、 研究结果

1. RAB5c 缺失损害 LAP

研究人员发现，在诱导 LAP 的刺激物（如调理酵母聚糖 Op-zym、IgG 包被的微珠）被吞噬后，RAB5c 被早期募集到新生吞噬体周围。特异性敲低 RAB5c（而非 RAB5a 或 RAB5b）会显著减少 LC3 在吞噬体膜上的结合，并损害后续的吞噬体酸化、溶酶体标志物 LAMP1 的募集以及蛋白酶解活性，表明吞噬溶酶体成熟受阻。吞噬体纯化实验证实，RAB5c 缺失减少了 LAP 诱导的吞噬体上 LC3-II 的水平，同时也降低了早期内体标志物 EEA1 及其他 RAB5 亚型在吞噬体上的富集，提示 RAB5c 调控了早期内体与吞噬体的通信。

2. RAB5c 缺失损害 PI(3)P 生成和 NOX2 复合物的稳定组装，但反而增加吞噬体 ROS 产生

RAB5c 缺失导致 LAP 诱导的吞噬体上，Ⅲ类磷脂酰肌醇 3-激酶 [class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase, PI(3)K] 复合物成分（VPS34、Beclin-1、UVRAG、RUBCN）的募集减少，并降低了 PI(3)P 的局部生成。同时，吞噬体上 NOX2 复合物的胞质组分 p47^phox和磷酸化 p40^phox的水平下降，但其跨膜组分 p22^phox和 gp91^phox未受影响。然而，出乎意料的是，RAB5c 缺失的巨噬细胞在吞噬 Op-zym 后，吞噬体内活性氧（ROS）的产生反而增加。进一步研究发现，这种 ROS 爆发是 NOX2 依赖性的，并与吞噬体上磷酸化 ERK1/2 的积累以及 p47^phox的早期、瞬时性募集峰值相关。ERK 抑制剂可消除这种异常的 ROS 产生。这表明 RAB5c 缺失破坏了 NOX2 复合物的稳定组装，但通过促进 ERK1/2 信号，导致了过早的、不稳定的 ROS 爆发。

3. RAB5c 调控 LAP 过程中吞噬体上 V-ATP 酶的组装

V-ATP 酶在 LAP 中起着关键作用：ROS 引起的离子失衡触发其 V1 和 V0 亚基在吞噬体膜上组装，随后 ATG16L1 通过其 WD40 结构域结合到 V1 亚基 ATP6V1H 上，从而募集 ATG12-ATG5-ATG16L1 复合物，引导 LC3 脂化。研究发现，RAB5c 缺失减少了 V-ATP 酶 V1 亚基 ATP6V1A 和 V0 亚基 ATP6V0d1 在 LAP 诱导的吞噬体上的募集。活细胞成像显示，V0 亚基从细胞器向吞噬体膜的转移过程在 RAB5c 缺失时被破坏。内体免疫共沉淀实验表明，V0 组分存在于 RAB5c⁺的早期内体中，但两者并无直接稳定的相互作用，提示 RAB5c 可能通过调控膜运输将 V0 递送至吞噬体。重要的是，即使通过药物抑制将 ROS 水平降至与对照组相当，也无法挽救 RAB5c 缺失导致的 V-ATP 酶组装和 LC3 结合的缺陷，证明 RAB5c 对 V-ATP 酶转运的调控独立于其 ROS 调节功能。

4. RAB5c 介导的 V-ATP 酶组装赋予巨噬细胞对烟曲霉的抗性

在烟曲霉感染模型中，RAB5c 缺失同样损害了巨噬细胞吞噬体上 LC3 的结合和 V-ATP 酶 V1 亚基的募集，并导致杀菌能力下降，尽管此时吞噬体 ROS 产生增加。这再次表明，异常的 ROS 不能替代正常的 LAP 通路行使杀菌功能。为了更直接地验证 V-ATP 酶–ATG16L1 轴的作用，研究人员使用了 ATG16L1 WD40 结构域缺失突变（Atg16l1^ΔWD40）的小鼠。该突变体巨噬细胞的 LAP 通路特异性受损（LC3 结合减少），但自噬和 ROS 产生正常。这些细胞对烟曲霉的清除能力显著下降。在体内，Atg16l1^ΔWD40小鼠在肺部感染烟曲霉后，表现出更高的真菌负荷、更严重的肺组织损伤和炎症反应。这些结果确凿地证明，RAB5c 通过调控 V-ATP 酶–ATG16L1 轴驱动的 LAP，对于巨噬细胞有效清除烟曲霉至关重要。

四、 讨论与结论总结

本研究系统阐述了 RAB5c 在 LAP 通路中的独特且不可或缺的作用。RAB5 GTP 酶作为早期内体相互作用的标志物，常在吞噬体成熟过程中被观察到，但其功能意义，尤其是不同亚型的功能特异性，此前并不明确。本研究发现 RAB5c 在 LAP 信号通路的时空组织中扮演了核心协调者的角色：

1. 1.
   协调 PI(3)P 生成：RAB5c 促进含有 RUBCN 的Ⅲ类 PI(3)K 复合物向吞噬体的运输和/或功能，这对于局部生成 PI(3)P 这一 LAP 早期事件至关重要。
2. 2.
   调控 ROS 信号：尽管 RAB5c 缺失导致 NOX2 复合物稳定组装受损，但却通过增加吞噬体上 ERK1/2 的积累，引发过早的 ROS 爆发，这提示 RAB5c 可能参与精细调节 ROS 产生的幅度和时机。
3. 3.
   介导 V-ATP 酶转运：RAB5c 调控含有 V0 组分的细胞器与吞噬体之间的膜运输，从而确保 V-ATP 酶能够正确组装在吞噬体膜上，这是连接 ROS 信号与下游 ATG16L1 复合物募集及 LC3 脂化的关键步骤。

最终，通过结合 RAB5c 缺失和 ATG16L1 WD40 结构域突变模型，本研究成功解析了 ROS 在杀菌中的双重角色：NOX2 产生的 ROS 是通过触发 V-ATP 酶–ATG16L1 轴来发挥其杀菌功能的。即使存在高水平的 ROS，如果 V-ATP 酶组装和后续的 LAP 通路受阻，巨噬细胞的杀菌能力也会严重受损。这为理解吞噬体成熟和抗感染免疫的机制提供了新的见解，并表明靶向早期内体-吞噬体运输或 LAP 通路特定环节，可能为治疗相关感染或免疫疾病提供新思路。

研究结论翻译：

总之，我们的研究结果确立了 RAB5c 在 LAP 过程中控制吞噬体成熟方面的独特作用，并证明吞噬体 ROS 通过充当 V-ATP 酶组装和吞噬体成熟的第二信使，对烟曲霉发挥杀菌活性。