抗原扩散介导DNA去甲基化剂程序化的嵌合抗原受体T细胞对异质性实体瘤的根除

《SCIENCE ADVANCES》：Antigen spreading mediates heterogeneous solid tumor eradication by DNA demethylating agent–programmed CAR T cells

　　

抗原异质性严重限制了嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR T细胞）疗法对实体瘤的疗效。我们的研究强调了低剂量地西他滨（Decitabine）预处理的CAR T（dCAR T）细胞在实体瘤模型中的强大抗肿瘤活性，这一益处先前已在血液恶性肿瘤中得到证实。值得注意的是，在免疫健全小鼠中输注dCAR T细胞，无需预先的淋巴细胞清除，即可大幅消除同时包含抗原阳性和抗原阴性细胞的混合肿瘤块。我们的分析显示，肿瘤免疫抑制微环境发生了显著的促炎性重塑。关键在于，抗原激活的dCAR T细胞维持了高水平的干扰素-γ（IFN-γ）产生，这诱导了肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death, ICD）并激活了传统树突状细胞（cDendritic Cells, cDC）。这反过来又刺激了内源性CD8+T细胞，增强了它们的抗原扩散能力，并有助于清除远处抗原阴性肿瘤。这些发现揭示了dCAR T细胞强大的抗原扩散能力，强调了其在解决具有固有抗原异质性的实体瘤方面的临床潜力。

研究背景与问题

近年来，嵌合抗原受体修饰T细胞（Chimeric Antigen Receptor–modified T, CAR T）疗法在治疗B细胞血液恶性肿瘤方面取得了显著临床成功。然而，将其应用于实体瘤时，临床疗效仍不理想。抗原异质性，即靶向抗原在肿瘤细胞中表达不完全，是限制CAR T疗效，特别是针对实体瘤的主要挑战。抗原扩散（Antigen Spreading, AS）是增强抗肿瘤疗效的关键现象，指激活针对非靶向肿瘤相关抗原的内源性T细胞免疫。然而，现有证据表明CAR T疗法本身诱导治疗性AS的能力有限。研究人员先前证实，低剂量DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（5-aza-2′-deoxycytidine, DAC）预处理的CAR T细胞（dCAR T细胞）在血液恶性肿瘤模型中显示出强大的抗肿瘤活性。本研究旨在将该策略扩展至实体瘤，探究其能否通过诱导AS来克服抗原异质性。

研究概述与意义

本研究发现，dCAR T细胞在免疫健全小鼠模型中展现出强大的抗肿瘤活性，能够有效清除包含抗原阳性和阴性细胞的混合肿瘤块，甚至能控制远处（abscopal）抗原阴性肿瘤的生长。其核心机制在于dCAR T细胞在抗原激活后产生高水平IFN-γ，诱导肿瘤细胞（包括抗原阴性细胞）发生ICD，从而激活树突状细胞，进而启动内源性肿瘤特异性CD8⁺T细胞，引发广泛的AS，最终根除异质性肿瘤。这项研究为利用单一、经表观遗传学编程的CAR T细胞平台，无需额外基因工程改造或联合用药，即可有效治疗抗原异质性实体瘤提供了新策略，具有重要的临床转化潜力。该论文发表在《SCIENCE ADVANCES》期刊。

关键技术方法

研究主要使用了以下关键技术：1. 细胞模型构建：利用逆转录病毒载体构建并制备了靶向人CD19的鼠源CAR T细胞，并在培养中加入10 nM DAC制备dCAR T细胞。2. 动物模型：在C57BL/6、OT-I、Batf3^-/-、Ifng^-/-等免疫健全小鼠中，建立了多种实体瘤皮下移植模型，包括单纯抗原阳性肿瘤、抗原阳性与阴性混合肿瘤、以及远处（abscopal）抗原阴性肿瘤模型。3. 多组学与高通量分析：采用流式细胞术、质谱流式细胞术（CyTOF）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞T细胞受体测序（scTCR-seq）、转座酶可及染色质高通量测序（ATAC-seq）等技术，全面分析肿瘤微环境免疫细胞组成、功能状态、克隆扩增及表观遗传变化。4. 功能验证实验：通过CD3⁺T细胞或IFN-γ抗体体内阻断、Batf3^-/-小鼠（缺乏交叉呈递DC）模型、以及Ifng^-/-来源的dCAR T细胞等实验，验证关键细胞和分子的功能。5. 功能学检测：使用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测内源性T细胞对非靶向抗原的应答，通过体外Transwell共培养体系验证旁观效应。

研究结果

dCAR T细胞在实体瘤中表现出增强的抗肿瘤效力并诱导内源性免疫细胞组成改变

在CD19⁺B16黑色素瘤模型中，dCAR T细胞治疗显著抑制肿瘤生长，甚至使部分小鼠达到完全缓解，效果优于传统CAR T细胞。对肿瘤微环境的分析显示，dCAR T治疗显著增加了肿瘤浸润的CAR⁺T细胞、内源性T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和树突状细胞的数量，其中内源性T细胞数量增加尤为显著。这些内源性T细胞表现出更高的活化、效应功能和记忆表型。结论：dCAR T对实体瘤的显著控制作用可能是CAR T靶向杀伤与激活内源性抗肿瘤效力共同实现的。

dCAR T细胞触发的内源性T细胞清除异质性肿瘤

在无淋巴细胞清除预处理的情况下，使用CD19⁺B16与CD19^-B16F10混合肿瘤模型，dCAR T细胞仍能诱导混合肿瘤显著消退。当用CD3抗体清除内源性T细胞后，dCAR T对混合肿瘤的控制作用消失。单细胞转录组测序分析显示，dCAR T治疗组肿瘤中的内源性T细胞具有更强的效应和增殖相关转录特征。结论：内源性T细胞是dCAR T治疗后清除靶抗原阴性肿瘤细胞的主要细胞群体。

dCAR T细胞诱导内源性CD8⁺T细胞的抗原扩散

在更复杂的模型中，小鼠一侧接种CD19⁺B16与OVA⁺B16混合肿瘤，另一侧接种OVA⁺B16作为远处病灶。dCAR T细胞不仅能控制混合肿瘤，还能有效抑制远处的OVA⁺B16肿瘤。ELISPOT和scTCR-seq分析证实，dCAR T治疗显著增强了内源性CD8⁺T细胞对非靶向抗原的应答能力和T细胞受体克隆扩增。在MC38结直肠癌模型和DAC预处理的OT-1 TCR-T细胞模型中也观察到了类似现象。结论：dCAR T治疗可诱导宿主肿瘤反应性CD8⁺T细胞发生AS，从而根除远处抗原阴性肿瘤。

AS的发生需要激活的树突状细胞

单细胞测序显示，dCAR T治疗组肿瘤中的树突状细胞高表达共刺激分子和趋化因子，且抗原摄取能力增强。在缺乏交叉呈递DC的Batf3^-/-小鼠中，dCAR T虽能控制CD19⁺肿瘤，但无法控制混合肿瘤，且无法诱导出OVA特异性CD8⁺T细胞。单细胞测序和酶联免疫吸附试验检测发现，dCAR T治疗组中，与ICD相关的危险相关分子模式分子，如ATP和钙网蛋白，在肿瘤细胞中的表达及在血清和肿瘤匀浆中的水平均显著升高。体外实验也证实dCAR T细胞能诱导更强的肿瘤细胞膜通透性及DAMP释放。结论：dCAR T疗法诱导的DC激活是建立AS的重要前提，而ICD是DC激活的关键驱动因素。

dCAR T细胞激活后持续高水平的IFN-γ产生导致靶抗原阴性肿瘤细胞发生ICD，从而引发显著的AS效应

单细胞测序和GSEA分析显示，dCAR T治疗组中抗原阴性肿瘤细胞的IFN-γ应答基因显著上调。体内外检测证实，dCAR T治疗组血清和瘤内IFN-γ水平更高。单细胞测序和ATAC-seq分析表明，dCAR T细胞在输注前其Ifng基因位点及相关的调控、效应、应答基因的染色质可及性就已升高，且瘤内CAR⁺T细胞的Ifng表达及其关键调控因子表达上调。体外Transwell实验证明，高水平的IFN-γ可诱导抗原阴性肿瘤细胞死亡。在体内，使用IFN-γ阻断抗体或Ifng^-/-来源的dCAR T细胞进行治疗，均会破坏dCAR T对混合肿瘤和远处肿瘤的控制，并削弱DC激活和内源性OVA特异性CD8⁺T细胞的产生。结论：dCAR T细胞是瘤内IFN-γ的主要来源，其所产生的高水平IFN-γ可诱导抗原阴性肿瘤细胞发生ICD，进而启动AS级联反应。

讨论总结与研究结论

讨论总结：

本研究揭示了dCAR T细胞通过诱导AS系统性根除抗原阴性亚克隆及远处病灶的新机制。与需额外工程化改造或联合用药的策略不同，dCAR T细胞提供了一个“一站式”平台，其经表观遗传学编程，具备内在产生高水平IFN-γ的能力。这种IFN-γ可绕过抗原依赖性，直接诱导抗原阴性肿瘤细胞发生ICD。ICD释放的DAMP激活DC，进而启动内源性多克隆T细胞反应。通过多种肿瘤模型、功能实验和组学分析，本研究构建了一个完整的因果框架，证明dCAR T疗法是启动AS驱动肿瘤清除的必要且充分条件。

研究结论翻译：

总之，本研究证明了dCAR T治疗后AS产生的一个潜在机制，即抗原激活的dCAR T细胞释放大量的IFN-γ，驱动肿瘤细胞中广泛的ICD，从而激活DC并刺激内源性CD8⁺T细胞。这些发现有力地支持了dCAR T细胞在靶抗原阳性和抗原阴性混合实体瘤以及远处抗原阴性肿瘤中的抗肿瘤功能。我们的研究结果强调了dCAR T细胞在有效治疗异质性肿瘤，甚至是远处异质性肿瘤中的关键作用，从而肯定了其在临床试验中的潜力。