基于数字光处理生物打印的超仿生气管：时空血管生成调控用于节段性气道重建

《SCIENCE ADVANCES》：DLP-bioprinted ultrabiomimetic trachea with spatiotemporal angiogenesis regulation for segmental airway reconstruction

　　

摘要：节段性气道重建需要能够模拟天然气管层次结构和生化功能的气管移植物。然而，同时实现高仿生保真度和高效血管化仍然具有挑战性。本研究提出了一种基于数字光处理（DLP, digitally light-processed）的组织工程气管，其具有解剖学上仿生的C形软骨环、交替的纤维环和背侧纤维带，精确复制了天然气管的结构层次。为了促进快速新生血管化，研究人员开发了一种具有应力松弛和可降解特性的藻酸盐（alginate）基水凝胶，该凝胶能够动态负载并持续释放血管内皮生长因子（VEGF, vascular endothelial growth factor），从而促进内皮细胞迁移和血管生成。在纤维区域内，研究人员整合了预先设计好的血管通道来引导宿主血管向内生长，与无通道支架相比，其新生血管密度增加了2.6倍。该平台通过精确的结构设计实现空间控制，并通过时程性生物活性信号调制实现时间控制，从而能够同步血管化。当通过端端吻合术与天然气管进行移植时，血管化的移植物显示出增强的存活率和功能整合，为气管组织工程和节段性气道重建提供了一个稳健的策略。

一、 研究背景、问题与动机

气管是维持人体呼吸的关键器官。由于创伤、肿瘤或先天性缺陷导致的节段性气管缺损，其重建是胸外科领域的一项重大挑战。理想的修复方案需要能够替代缺损的移植物，该移植物不仅要精确模拟天然气管复杂的解剖结构（包括交替排列的C形软骨环、纤维环和背侧膜部），还需具备良好的生物力学性能和快速有效的血管化能力，以确保移植后的存活与功能整合。然而，现有的替代方案，如自体组织、同种异体气管或人工假体，均存在结构性-力学不匹配、长期整合性差或生物相容性不足等固有局限。其中，移植物血管化不足是导致其坏死、狭窄和移植失败的核心瓶颈。传统的支架制造方法，如冻干、溶剂浇铸和静电纺丝，往往缺乏重建复杂层次结构所需的空间精度。因此，开发一种能够同时实现高保真度结构仿生和高效时空可控血管化的组织工程气管（TET, tissue-engineered trachea）策略，具有迫切的临床需求和重要的科学意义。本研究旨在攻克TET中仿生精度不足和血管化效率低下的关键技术瓶颈，为此，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表了此项工作。

二、 关键技术方法简述

本研究主要采用了以下关键技术与方法：

1. 1.
   材料设计与合成：开发了氧化-甲基丙烯酰化双重修饰的藻酸盐（OAlgGM）水凝胶，作为气管纤维段的基质材料。利用醛基的动态席夫碱反应实现VEGF的持续吸附与释放。同时，采用甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和甲基丙烯酰化沃顿胶（WJMA）构成双网络水凝胶，作为负载软骨细胞的气管软骨环材料。
2. 2.
   数字光处理（DLP）生物打印：利用DLP高精度3D打印技术，以模块化方式分别打印C形软骨环和内置圆周/轴向血管通道的纤维环单元。该技术实现了对微米级结构的精确控制。
3. 3.
   模块化组装与化学键合：将打印的软骨模块和纤维模块交替排列，通过软骨水凝胶中的氨基与纤维水凝胶中氧化藻酸盐的醛基发生席夫碱反应，实现模块间的化学键合，组装成完整的超仿生组织工程气管（UB-TET, ultrabiomimetic TET）。
4. 4.
   时空血管化调控策略：结合空间引导（通过DLP打印的预成血管通道）和时间调控（通过OAlgGM凝胶对VEGF的持续释放），协同促进新生血管长入。
5. 5.
   动物模型验证：建立新西兰大白兔的气管旁植入模型和节段性气管缺损修复模型，用于评估TET的血管化、组织再生及功能重建效果。动物实验获得上海交通大学医学院动物伦理委员会批准。

三、 研究结果

1. 气管纤维材料的制备

研究人员成功合成了OAlgGM水凝胶，并通过¹H核磁共振（¹H-NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了其化学结构。与未氧化修饰的藻酸盐甲基丙烯酸酯（AlgGM）相比，OAlgGM显示出更低的粘度和更快的应力松弛特性，这有利于细胞活动。

2. 气管纤维模板分层孔结构的DLP打印

通过优化打印参数（生物墨水浓度、交联时间、光照强度），成功利用DLP打印出气管纤维段，其内部包含直径约750 μm的预设血管通道以及小于100 μm的冻干水凝胶微孔，形成了有利于血管引导和细胞迁移的层级孔结构。

3. 优化的化学与物理结构增强HUVEC迁移

实验证明，OAlgGM水凝胶通过醛基对VEGF的吸附和持续释放能力显著优于AlgGM，释放可持续约1个月。划痕实验和Transwell迁移实验均证实，VEGF能显著促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC, human umbilical vein endothelial cell）的迁移，且DLP打印的多孔凝胶在三维微环境中效果更明显。

4. 优化的生物力学性能增强HUVEC增殖

OAlgGM水凝胶的应力松弛半衰期（τ_1/2）比AlgGM缩短了近一个数量级，且具有更大的孔径。这些特性共同创造了更适宜的细胞微环境，显著提高了HUVEC的活力和增殖能力。体外和体内降解实验表明，多孔OAlgGM水凝胶的降解速度快于块状凝胶，降解与组织再生速率相匹配。

5. C形软骨的模块化构建

研究人员选用8% GelMA与2% WJMA（G8W2）的组合作为软骨生物墨水，其表面接触模量约为10 kPa，适合软骨细胞的生物力学环境。DLP打印的C形软骨环在裸鼠皮下植入4周后，组织切片显示出软骨细胞陷窝和II型胶原（Col II, type II collagen）表达，证实了其软骨形成能力。

6. 气管的集成组装与特性

通过化学键合组装成的完整UB-TET表现出优异的抗压缩性和回弹性。蠕变和应力松弛测试表明，UB-TET的粘弹性行为与天然气管相似，特别是在应力松弛测试中，其拟合的松弛时间τ₂与天然组织接近，证明其具备维持呼吸道顺应性所需的关键动态粘弹性。

7. 气管旁植入后TET的再生

在兔气管旁植入模型中，研究人员设置了四组对比：UB-TET（有通道+VEGF）、NC-TET（无通道，仅有VEGF）、仅有通道、无通道无VEGF对照。免疫荧光染色（CD31和α-SMA, α-smooth muscle actin）显示，UB-TET组沿预设血管通道出现了显著的新生血管长入，CD31阳性内皮细胞和α-SMA阳性平滑肌细胞广泛浸润，新生血管密度相比NC-TET组显著增加。组织学评估显示，再生软骨的糖胺聚糖（GAG, glycosaminoglycan）和Col II含量与天然气管组织相近。

8. 带血管蒂移植实现集成性气管再生

在节段性气管缺损修复的二期手术中，将预血管化的UB-TET移植到缺损部位。植入40天后，组织学分析显示UB-TET组促进了纤维组织和软骨的协调再生，并有呼吸上皮（CK7阳性）在管腔内表面再生。而NC-TET组则存在水凝胶残留，阻碍了组织重塑。免疫荧光定量分析显示，UB-TET组的毛细血管密度是NC-TET组的2.6倍。此外，UB-TET组表现出更高的术后存活率、更好的吻合口通畅度以及更低的局部炎症反应评分。

四、 讨论与结论

讨论：气管多组织的复杂性使其完全解剖和功能再生面临困难。本研究的核心创新在于结合了高精度的DLP仿生结构打印与时空协同的血管化调控策略。与早期研究倾向使用封闭O形环不同，开放的C形软骨环设计更有利于气管的生物力学性能和结构弹性。研究表明，预设的几何血管通道在引导新生血管方面比单纯的VEGF释放具有更强、更有序的促进作用，两者结合产生了协同效应。此外，本研究开发的氧化改性藻酸盐水凝胶（OAlgGM）在应力松弛、降解速率和细胞相容性方面均优于未经修饰的凝胶，也优于初期探索的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）体系。尽管在兔模型中展现了良好的临床前潜力，但要实现临床转化，仍需解决将移植物放大至人体尺寸、优化机械性能、通过长期大动物研究验证免疫相容性等挑战。

研究结论：本研究成功开发了一种血管化的超仿生气管移植物。该移植物整合了交替的纤维段、C形软骨环和预设计的血管通道，复制了天然气道的层次结构和生物力学特性。该构建体在体内促进了软骨、纤维组织和上皮的强劲再生，并加速了新生血管化。这种结合空间引导（通过内置血管通道）和时间生物活性信号调制（通过VEGF的持续释放）的双重调控策略，为气管组织工程和节段性气道重建提供了一种创新且强大的解决方案。