喉鳞状细胞癌肿瘤免疫微环境的免疫组织化学研究及其预后意义

《Diagnostics》：Immunohistochemical Study of the Tumor Immune Microenvironment in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma and Its Prognostic Implications Mihaela-Iuliana Sirbu, Flavia Zara, Raluca Maria Closca, Marina Rakitovan, Antonia Armega-Anghelescu, Alexandru Cristian Cindrea, Ovidiu-Alexandru Mederle, Marcela-Maria Labadi and Nicolae-Constantin Balica

　　

背景/目的：喉鳞状细胞癌（Laryngeal Squamous Cell Carcinoma, LSCC）在临床行为上表现出显著的异质性，这无法完全由传统的组织病理学参数解释。越来越多的证据强调肿瘤免疫微环境（Tumor Immune Microenvironment, TME）在调节肿瘤进展和患者预后中的关键作用。方法：研究组包括82例喉鳞状细胞癌患者。研究人员选择了一套免疫组织化学标记物来识别和量化肿瘤免疫微环境中的关键免疫细胞群和免疫相关成分。对免疫浸润进行了半定量评估，特别关注其密度以及在肿瘤内和间质区室中的相对分布。结果：根据所得的免疫表型谱，病例被分为三种不同的免疫模式：活性免疫型，定义为显著且致密的炎症浸润；混合型，表现出中等和异质性的免疫特征；以及免疫抑制型，其特征是效应免疫细胞浸润减少和免疫调节成分占主导。统计分析表明，这些免疫模式与患者生存结局之间存在显著相关性。结论：本研究旨在通过免疫组织化学标记物表征喉鳞状细胞癌的免疫状态，并评估其预后意义。

喉癌是头颈部恶性肿瘤的重要组成部分，对发病率和死亡率有重大影响。在发达国家，喉癌约占头颈部恶性肿瘤的20%–30%，在中欧和东欧部分地区发病率更高。从组织病理学角度看，鳞状细胞癌占所有喉恶性肿瘤的95%以上，其发生主要与长期接触致癌物有关。头颈部癌（包括喉鳞状细胞癌）根据美国癌症联合委员会制定的TNM系统进行分期。尽管基于肿瘤免疫微环境的治疗方法近年来引起了相当大的关注，并在LSCC中显示出显著的临床改善，但此前的研究多集中于单个肿瘤浸润免疫细胞。本研究的创新之处在于整合这些成分，定义了三种不同的免疫模式，以更全面地描述肿瘤免疫微环境的异质性及其预后意义。这项研究旨在通过免疫组织化学分析，表征和量化LSCC中TME的细胞成分，并将这些发现与临床病理参数和患者预后相关联。论文发表在《Diagnostics》期刊上。

为开展研究，研究人员运用了几个关键技术方法。患者队列与样本处理：研究回顾性纳入了2018年1月1日至12月31日期间在蒂米什瓦拉市急救医院耳鼻喉科确诊的82例LSCC患者。所有样本经4%缓冲甲醛固定，并制备石蜡切片。免疫组织化学分析：使用Leica Bond-Max自动染色系统，采用一组特异性抗体（包括抗p16、抗CD20、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD68、抗CD1a和抗CD117）对肿瘤免疫微环境进行评估和量化。两名经验丰富的病理学家独立评估切片，通过半定量评分系统（0-3分）对免疫细胞密度进行评分，并结合形态学评估，将病例分为三种免疫分型。统计分析：使用R软件进行数据分析。通过Kaplan-Meier法和log-rank检验比较不同免疫分型的总生存期（Overall Survival, OS），并使用Cox比例风险回归模型评估免疫分型与OS的关联，同时调整了pT、pN、血管/淋巴管浸润和组织学分级等协变量。

研究结果

临床与人口统计学数据：本研究共纳入82例LSCC患者，诊断中位年龄为70岁，男性占主导。大多数肿瘤位于声带。患者中，68.3%有长期吸烟史，16%报告有长期饮酒史。超过一半的患者在诊断后五年内死亡。

形态学特征：显微镜检查显示，大多数LSCC为常规型鳞状细胞癌。肿瘤主要为中分化（G2）或低分化（G3）。在免疫分型A的肿瘤中，浆细胞和嗜酸性粒细胞在瘤内区域密度较高。

免疫组织化学特征：

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  p16阴性肿瘤的免疫组织化学特征：大多数LSCC（94%）为p16阴性。根据免疫评分，p16阴性肿瘤被分为三种模式。免疫分型A（活性免疫型）：以CD20⁺B淋巴细胞、CD3⁺/CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞和CD1a⁺树突状细胞密度高为特征，CD68⁺巨噬细胞和CD117⁺肥大细胞稀少。免疫分型B（混合型）：具有可变的免疫细胞密度。免疫分型C（免疫抑制型）：以效应T细胞和树突状细胞稀少，但CD68⁺巨噬细胞和CD117⁺肥大细胞密度高为特征。分析发现，肿瘤分期与免疫分型分布显著相关，免疫分型A更常见于T1期肿瘤，而免疫分型B和C则主要与晚期（T3-4）肿瘤相关。
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  p16阳性肿瘤的免疫组织化学特征：仅有6%的肿瘤为p16阳性，其免疫特征与p16阴性的免疫分型A肿瘤重叠。所有p16阳性肿瘤均被归类为免疫分型A。

生存分析：Kaplan-Meier曲线显示，免疫分型A、B和C之间的总生存期存在显著差异。多变量Cox回归分析显示，与免疫分型A相比，免疫分型B的死亡风险显著增加，免疫分型C的死亡风险更高。免疫分型在调整了pT、pN、血管/淋巴管浸润和分级后，仍与OS独立相关。

讨论与结论

讨论：LSCC的进展涉及遗传变化和TME的重塑。本研究通过免疫组化分析了82例LSCC患者的TME，并确定了三种不同的免疫模式。研究发现，活性免疫型肿瘤中T淋巴细胞和B淋巴细胞密度高，与较好的预后相关。树突状细胞密度增加也与较好的预后相关。相反，免疫抑制型肿瘤中巨噬细胞和肥大细胞密度高，与较差的生存率相关。此外，瘤内浆细胞和嗜酸性粒细胞增多与生存改善相关。本研究强调了整合免疫成分进行免疫分型的实用价值，为描述预后异质性提供了一个框架。然而，本研究也存在一些局限性，包括样本量相对较小、回顾性设计、免疫浸润半定量评估可能存在观察者间差异，以及HPV状态仅通过免疫组化评估而未通过原位杂交验证。

结论：统计分析确定了免疫模式与患者生存结果之间的相关性。活性免疫型更常见于预后较好的病例，而免疫抑制型则在总生存期较短的病例中占主导，混合型表现出中间特征。这些发现突出了通过免疫组化分析LSCC肿瘤免疫微环境所识别的模式，可能为描述预后异质性提供一个描述性框架。然而，这些观察结果仍是探索性的，在考虑任何临床应用之前，需要在更大规模的独立队列中进行验证。