综述：微生物糠醛耐受机制研究进展及未来生物技术利用展望

《Fermentation》：Research Progress in the Mechanisms of Microbial Furfural Tolerance and Future Research Prospects for Its Biotechnological Exploitation Jiaying Xiong, Meixia Chen, Laiping Zhang, Qi Zhou, Zhenyu Huang, Xiaobin Lin, Xiaomin Fang, Xiangdong Ye, Weiping Zhu and Aiqin Shi + 1 author

　　

木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质，其高效生物转化对于实现碳中和、替代化石资源及推进可持续生物制造至关重要。然而，糠醛作为木质纤维素预处理过程中产生的主要抑制剂，严重损害微生物代谢和发酵性能。迄今为止，尚无系统性综述全面整合糠醛诱导的微生物毒性机制与相应的胁迫耐受策略。本综述阐述了三个核心主题：糠醛的多途径毒性效应、微生物的内在耐受机制以及构建高耐受性微生物底盘（chassis）的先进策略。尽管已取得显著进展，但仍存在若干研究空白，包括对糠醛与其他水解产物抑制剂之间的协同或拮抗相互作用了解不足、抗抑制剂研究中适应性实验室进化、理性设计和随机诱变整合不足，以及对糠醛耐受性与工业发酵稳健性之间的权衡理解有限。未来的努力应通过组合胁迫模拟、多组学分析和“进化-阐明-工程”范式来弥补这些空白，从而实现木质纤维素生物制造的可扩展和稳定应用。

2. 微生物糠醛毒性机制

2.1. 糠醛对微生物DNA的影响及其机制

糠醛是一种强基因毒素，可导致DNA链断裂、点突变和大规模染色体重排。在酿酒酵母中，0.1 g/L至20 g/L的糠醛可使有丝分裂重组增加1.5至40倍。全基因组单核苷酸多态性分析证实了所有16条染色体上存在多种单碱基替换，特别是C→T和G→A转换。类似的遗传毒性在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中也有报道。糠醛诱导的DNA损伤主要通过三类机制介导。其一是活性氧（ROS）介导的间接DNA损伤，糠醛在酿酒酵母中诱导ROS积累，损害包括线粒体膜、液泡膜、肌动蛋白细胞骨架和染色质在内的细胞结构。其二是与DNA的直接相互作用，用糠醛处理λ噬菌体DNA可保护其免受限制性内切酶DraI和SspI的切割，但不受ApaI、BssHII或SacII的影响，这表明在该条件下，糠醛仅与AT碱基对反应，并且需要至少3-4个连续的AT对才能发生此反应。其三是代谢激活和DNA加合物形成，糠醛可被还原为糠醇，随后经磺基转移酶介导的生物活化形成反应性硫酸酯，该酯能与DNA形成共价加合物。

2.2. 糠醛对微生物蛋白质的影响及其机制

糠醛通过直接物理化学相互作用和间接胁迫途径对微生物蛋白质产生多种有害影响。糠醛可直接与某些酶的活性位点结合，作为竞争性抑制剂。例如，它在酿酒酵母中与乙醛竞争醇脱氢酶的底物结合口袋。它还可以通过与变构位点结合，改变蛋白质的三级构象，从而非竞争性地抑制酶。对于丙酮酸脱氢酶，糠醛不占据底物结合腔，但通过结构扭曲损害催化活性。糠醛还会破坏结构和功能蛋白的天然构象。光谱学和分子对接研究表明，糠醛与蛋白质骨架和侧链之间形成氢键、范德华力和疏水相互作用。这导致有序二级结构的丧失，并转向无序的无规卷曲。在酿酒酵母中，肌动蛋白细胞骨架的崩溃生动地说明了这种变性。此外，比较蛋白质组学表明，糠醛引发蛋白质表达的大规模重编程。在8 g/L糠醛条件下发酵的酿酒酵母中，涉及翻译和蛋白质合成的107种蛋白质以及糖酵解和三羧酸循环的中心代谢酶被下调，相反，一组特定的18种应激反应蛋白，包括热休克蛋白和信号通路成分，被显著上调。催化含硫氨基酸生物合成途径的蛋白质也持续受到抑制，表明存在特定的代谢瓶颈。以上效应主要通过三种分子机制介导：糠醛占据催化或变构位点，阻断底物进入或构象灵活性；糠醛与蛋白质之间的疏水和氢键相互作用可破坏维持天然折叠的水化层和分子内作用力；糠醛解毒导致的NAD(P)H耗竭和ROS积累产生氧化性细胞内环境，导致蛋白质共价修饰和失活。这些机制共同损害酶催化，瓦解结构网络，并改变蛋白质组组成，严重削弱细胞适应度和生物技术性能。

2.3. 糠醛对微生物脂质的影响及其机制

糠醛在多个层面干扰微生物脂质代谢，其影响的方向和程度高度依赖于糠醛浓度、微生物种类和培养条件。这些干扰源于酶的直接抑制、辅因子竞争、氧化损伤和代谢重编程的共同作用。首先，糠醛以浓度依赖性方式诱导代谢通量重新定向。在酿酒酵母中，亚抑制水平的糠醛将碳通量从乙醇生产转向脂质积累，使总脂质含量增加5-10%，这可能代表一种胁迫诱导的能量储存策略。然而，随着糠醛浓度增加，这种适应性反应被压制，脂质合成受到严重抑制，与总体生长停滞相平行。其次，糠醛解毒与脂质生物合成之间存在辅因子竞争。糠醛诱导脂质损伤最普遍的机制是还原型辅因子的竞争，糠醛还原和脂质生物合成都是高度依赖NAD(P)H的过程。当糠醛存在时，解毒机制消耗细胞内NAD(P)H库的很大一部分，从而限制了脂肪酸和脂质合成所需的还原力。这种辅因子消耗被认为是产油微生物中脂质积累减少的主要原因。第三，糠醛可直接抑制脂质生物合成酶。即使在低浓度下，糠醛也会破坏解脂耶氏酵母中的糖酵解酶，减少碳源利用并导致脂质合成暂时停止。第四，糠醛改变极性膜脂和中性储存脂质之间的平衡，在卡尔酵母中，超过0.8 g/L的糠醛浓度会降低极性和中性脂质含量，并且在稳定期降低更为显著。此外，糠醛代谢产生ROS，攻击膜磷脂的不饱和脂肪酸，导致脂质过氧化。这种氧化损伤损害膜完整性、流动性和膜蛋白功能，进一步加剧细胞胁迫，并导致膜相关中性脂滴的损失。总之，糠醛对DNA、蛋白质和脂质的有害影响构成了其总体毒性的分子基础。这些效应通过氧化应激、辅因子耗竭和共价修饰等核心过程紧密相连。

3. 微生物糠醛耐受机制

3.1. 糠醛的高效转化

将糠醛转化为糠醇是微生物最直接的耐受策略，该过程主要依赖氧化还原酶系统的催化作用。在酿酒酵母中，醇脱氢酶和醛酮还原酶是催化糠醛还原为糠醇的关键酶。在大肠杆菌LY180中，通过过表达fucO、ucpA或pntAB或敲除yqhD可以解决糠醛毒性。将最佳遗传性状组合集成到大肠杆菌LY180中，得到了产乙醇菌株XW129。此外，糠醛也可被其他细菌、真菌以及嗜极菌代谢。除了还原途径，某些微生物也可以通过氧化途径将糠醛转化为糠酸，例如恶臭假单胞菌KT2440的全细胞可以选择性地将糠醛氧化为糠酸，产率定量。解脂耶氏酵母通过过表达其醛脱氢酶将糠醛生物转化为糠酸，从而增强了糠醛耐受性。值得注意的是，YALI0E15400p表现出最高的转化效率，在0.4 g/L糠醛胁迫下，细胞生长和脂质产量均翻倍。产酸葡糖杆菌能以几乎100%的产率将糠醛代谢为糠酸。小球藻是首个被证明在光自养或混合营养条件下将糠醛转化为糠酸的微藻。在好氧条件下，树脂无定形孢菌和谷氨酸棒杆菌可同时将糠醛转化为相应的醇和羧酸。在根癌农杆菌菌株S33中，由其尼古丁降解簇内的ald基因编码的醛脱氢酶介导了糠醛向糠酸的氧化。当在重组大肠杆菌中异源表达时，该酶实现了特定的转化率。作为模型呋喃降解菌株，Cupriavidus basilensis HMF14含有八个hmf基因，排列在两个不同的簇中，其中控制糠醛降解的五个基因在呋喃降解微生物中高度保守。

3.2. 细胞膜结构和运输系统的调控

细胞膜是微生物抵抗外部有毒物质的第一道屏障。在糠醛胁迫下，微生物可通过调节细胞膜的磷脂组成和增加不饱和脂肪酸含量来维持膜流动性，从而减少糠醛的跨膜运输。在大肠杆菌中，增加细胞膜中磷脂酰乙醇胺头基的丰度可以提高其对糠醛的耐受性。当运动发酵单胞菌处于高糠醛浓度胁迫下，几种膜组成相关基因的表达水平显著下调，同时膜相关化合物的含量也受到显著影响，其中类异戊二烯的含量显著降低。通过多轮渐进X射线照射结合适应性实验室进化获得的酿酒酵母菌株SCF-R4，与亲本菌株相比表现出显著更高的糠醛耐受性，这与其优越的细胞膜完整性密切相关。总之，微生物采用被动膜适应策略来重塑细胞包膜的结构和组成。这种策略主要通过加强物理屏障来起作用，从而最大限度地减少糠醛进入细胞。同时，转运蛋白可以通过主动外排机制泵出细胞内积累的糠醛，降低细胞内糠醛浓度。转录组分析表明，拜氏梭菌在高浓度糠醛培养后，其膜转运蛋白过表达。在热纤梭菌中，根据转录组分析，硫酸盐转运蛋白亚基基因在糠醛处理下有明显反应。对于米曲霉RIB40，在糠醛胁迫下，外排转运蛋白的表达水平显著上调。集体来看，这两种机制以互补方式发挥作用：被动膜适应限制糠醛流入，而主动外排系统清除细胞内糠醛，从而共同增强微生物对糠醛的耐受性。

3.3. 代谢网络的自适应重构

微生物会调整代谢通量的分布以应对糠醛引起的代谢抑制。当丙酮丁醇梭菌处于糠醛压力下时，参与糖酵解、还原性三羧酸循环、丙酮-丁醇合成和氧化还原代谢的代谢物和关键酶/蛋白质低于对照组，而参与糖异生、氧化性三羧酸循环以及用于氧化应激的硫氧还蛋白过氧化物酶的蛋白质显著上调，表明抑制剂胁迫诱导了应激反应和代谢调控。磷酸戊糖途径的增强是一种常见的适应策略。该途径产生的NADPH可以为糠醛还原和ROS清除提供还原力。在酿酒酵母中，克服糠醛毒性的几种策略包括过表达参与磷酸戊糖途径的基因，上调解毒和抗氧化蛋白，以及下调氮代谢相关蛋白以节约能量。此外，糖酵解途径中葡萄糖-6-磷酸异构酶等基因的突变可以增强大肠杆菌菌株SSK101对糠醛的抗性并维持基本代谢功能的稳定性。在凝结芽孢杆菌DSM2314中，当糠醛存在时，sigma因子基因sigB及其靶基因表达上调，因为这些基因参与细胞壁成分的合成。

3.4. 氧化应激防御系统的激活

为应对糠醛诱导的ROS积累，微生物激活了以谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶为中心的抗氧化系统。GSH可以通过清除ROS来维持细胞内氧化还原平衡，而SOD和CAT分别催化超氧阴离子和过氧化氢的分解。适应在2 g/L糠醛下生长的酿酒酵母CEN.PK113-AL80-4，其耐受机制是通过过表达Rad18和Gcn1来提高过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性。值得注意的是，酿酒酵母菌株YBA_08和F60C在糠醛降解方面表现出高效性。与模式菌株S288C相比，它们的谷胱甘肽含量增加了406%，这赋予了对活性氧介导的细胞损伤的保护作用。此外，运动发酵单胞菌ZMNP是通过删除其所有四个天然质粒而从亲本菌株ZM4产生的无质粒突变体。转录组和蛋白质组分析表明，ZMNP增强了对糠醛的耐受性，这源于应激反应和半胱氨酸生物合成基因表达的上调，这种变化加速了细胞内ROS解毒和核酸损伤修复。总之，微生物糠醛耐受性依赖于四个功能不同但互补的策略。酶促生物转化以大量辅因子消耗为代价，提供快速、靶向的解毒作用。细胞膜重塑和主动外排作为一种低成本的广谱物理防御，限制了细胞内毒素的积累，但不能完全消除胁迫。代谢重编程，最显著的是磷酸戊糖途径的强化，维持氧化还原平衡并为解毒和ROS清除提供NADPH，起到保守的辅助作用。GSH-SOD-CAT抗氧化轴普遍减轻下游氧化损伤，而不解决毒性的主要来源。不同的微生物类群优先采用不同的主导机制来应对糠醛胁迫。此外，这四种机制可以系统地组织成一个两级的比较框架。第一级包括进化上保守的核心防御机制：酶促转化、膜屏障调节、PPP驱动的代谢重编程和抗氧化级联反应。这些策略广泛分布于细菌、酵母和丝状真菌中，形成了一个基本的、跨物种的防御模块。第二级包括微生物或菌株特异性的适应性，包括独特的氧化还原酶亚型、专门的调控系统、质粒丢失诱导的代谢重编程和异常的抗氧化积累。尽管这些特性通常不能跨物种转移，但它们可以显著提高宿主特异性的抗性。

4. 构建高糠醛耐受性微生物的策略

4.1. 适应性实验室进化

适应性实验室进化模拟自然选择过程，使菌株在生长压力下积累有益突变，从而获得稳定遗传的高耐受性菌株。通过该方法筛选的酿酒酵母菌株12-1，在4 g/L糠醛条件下，其生长滞后期缩短了36小时，乙醇转化率提高了6.67%。通过16轮连续传代培养衍生的进化菌株，在糠醛胁迫下的比生长速率比野生型菌株高2.5倍。通过ALE成功分离的产乙醇细菌运动发酵单胞菌菌株ZMF3-3，在3 g/L糠醛胁迫下达到了94.84%的理论乙醇产率，而起始菌株ZM4仅达到9.89%。经ALE后，嗜酸乳杆菌XH11在96小时内从未处理的玉米芯水解液中产生了61.9 g/L D-乳酸。与亲本酿酒酵母菌株TMB3400相比，进化菌株在仅含糠醛作为抑制剂的培养基中显示出明显更短的滞后期。它还能在TMB3400致死的水解液浓度下生长，并在工业相关条件下表现出显著改善的生物转化性能。基于这些结果，ALE不仅增强了菌株对糠醛的耐受性，还提高了其在糠醛胁迫下的发酵性能以及对真实木质纤维素水解液的耐受性。通常，ALE与多组学分析相结合，以阐明微生物菌株对糠醛的耐受机制。研究人员已经确定了几个关键决定因素：增强的NAD(P)H供应、转录因子的突变、ATP结合盒转运蛋白的过表达、部分基因组缺失以及细胞壁成分的改变。此外，还鉴定出几种可增强糠醛抗性的特定酶。然而，ALE的实际应用受到三个主要限制。首先，糠醛耐受机制仍不明确，因为表型通常源于复杂的、多基因的改变，跨越多个代谢和调控网络，造成“黑箱”效应，阻碍了精确分子靶点的识别和随后的理性优化。其次，ALE本质上是耗时的，需要数百代的连续培养和选择才能实现稳定的耐受性，这延长了开发时间，并限制了对紧迫工业需求的响应。此外，在受控实验室条件下长时间的适应可能不适用于大规模发酵过程。

4.2. 基因工程的精确修饰

基因工程技术的发展为精确构建高耐受性菌株提供了可能性，主要包括关键基因的过表达、敲除和突变等策略。如上所述，糠醛可以被还原为糠醇或氧化为糠酸，因此过表达参与该反应的基因是一种有前景的解毒策略。过表达醛还原酶有助于糠醛解毒。同样，过表达醛脱氢酶也有利于糠醛解毒。某些醇脱氢酶也可能参与糠醛还原。在粗糙脉孢菌T112中，醛脱氢酶基因ahd-2的突变增强了细胞对糠醛的抗性。有趣的是，过表达PHB合成基因也可以提高细胞对糠醛的耐受性。增强NAD(P)H供应是促进糠醛解毒的另一有效策略。该策略包括过表达NAD(P)H再生酶。此外，过表达烟酰胺补救途径基因也参与此策略。再者，删除参与NAD(P)H消耗的基因也是缓解糠醛毒性的有效策略。除了将糠醛转化为毒性较低的代谢物外，过表达与细胞生长相关的其他基因也是增强微生物糠醛耐受性的有效策略。此类靶点包括转录因子、胸苷酸合酶、多胺转运蛋白、外排泵、sigma因子、丁醇脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、应激诱导蛋白、E3 SUMO-蛋白连接酶、谷胱甘肽合成酶、环丙烷-脂肪酸-酰基-磷脂合酶、新型LEA样蛋白、半胱氨酸合酶和α/β水解酶。靶向基因敲除是增强微生物糠醛耐受性的额外策略。例如，删除PHO13基因已被证明可以提高产乙醇菌株在糠醛胁迫下的生长和乙醇产量。有趣的是，增强的谷胱甘肽生物合成和亚精胺水平的调节也有助于糠醛耐受。理性基因工程的应用受到几个关键限制。首先，这种方法严重依赖于对糠醛诱导的应激反应和细胞解毒网络先前机理知识的了解。然而，这种理解仍然不完整，特别是在非模式工业宿主中，从而限制了有效遗传干预措施的设计。此外，过表达解毒酶会通过消耗NAD(P)H等辅因子并将碳通量从产物合成中转移出去，从而带来巨大的代谢负担，而包括反馈抑制和基因沉默在内的天然调节机制可能进一步削弱预期的表型改善。最后，鉴于糠醛耐受性是一个多基因性状，单一靶点修饰通常只能带来边际改善，并且通常无法对木质纤维素水解液中共存的其他抑制性化合物提供交叉保护，从而限制了理性设计菌株的工业稳健性。

4.3. 随机诱变改善微生物糠醛耐受性

随机诱变通过创建多样的突变体库来提高微生物的糠醛耐受性。流行的技术包括常压室温等离子体、紫外线或离子束诱变，然后进行高浓度筛选以分离具有优异解毒能力的菌株。例如，Jiang等人采用ARTP诱变结合ALE处理凝结芽孢杆菌NL01，从而获得了耐受性突变株GKN316。该突变株能有效地将糠醛转化为毒性较低的醇衍生物。当在未脱毒的玉米秸秆水解液中培养时，与亲本菌株NL01相比，GKN316的乳酸积累显著增加了1.9倍，达到45.39 g/L。对热带假丝酵母YB 0进行ARTP诱变后，使用含有不同浓度糠醛的培养基筛选得到的突变体库。经过初筛和复筛，分离出的突变株YB 3表现出在6.5 g/L糠醛存在下生长的能力。随机诱变是一个低通量且劳动密集的过程，它产生大量的突变体库，其中有用的突变数量远少于中性和有害的变异。从如此复杂的群体中鉴定出具有高糠醛耐受性的菌株需要大量的筛选工作，消耗大量的人力、时间和资源，同时显著降低菌株开发效率。此外，诱变剂会在整个基因组中引入随机改变，而非针对特定的功能位点。因此，即使表现出增强的糠醛耐受性的菌株也经常携带与耐受性无关的隐性突变，这些突变可能会损害遗传稳定性、产孢能力或放大条件下的工业性能，最终导致发酵结果不一致。另外，迭代改进仍然具有挑战性，因为未定义突变的积累限制了性状叠加的可预测性。对已有耐受性的菌株进行重新诱变通常会遇到饱和的突变情况，新获得的突变很少或没有累加或协同益处，从而阻碍了通过连续几轮随机诱变进一步提高耐受性。总之，三种主要的增强微生物糠醛耐受性的策略各自都存在固有的局限性，这些局限性源于其方法学特点和糠醛耐受性本身的多基因复杂性。为克服这些限制，未来的研究应优先考虑互补方法的整合。此类整合性努力对于开发更适合工业木质纤维素生物制造的更高效、更稳健的微生物底盘至关重要。