胸膜肺实质弹力纤维增生症（PPFE）图谱揭示异常细胞状态及其空间分布模式，为肺纤维化研究提供替代路线图

《SCIENCE ADVANCES》：The pleuroparenchymal fibroelastosis atlas reveals aberrant cell states and their zonation as an alternate roadmap to lung fibrosis

　　

摘要：胸膜肺实质弹力纤维增生症（Pleuroparenchymal fibroelastosis, PPFE）是一种进行性间质性肺疾病，其定义性组织学特征为肺泡内纤维化伴间隔弹力组织增生，提示其存在独特的细胞疾病过程。本研究展示了一个基于40名患者移植肺的双国PPFE单核RNA测序图谱。免疫荧光显微镜、RNA原位杂交、微计算机断层扫描和分层相差同步辐射计算机断层扫描为其提供了空间背景。研究人员确定了与PPFE相关的血管周围成纤维细胞和弹力纤维化成纤维细胞是炎症微环境中驱动弹力组织重塑的关键因素，并由形成三级淋巴结构的免疫细胞所维持。空间图谱揭示了肺泡内纤维化伴间隔弹力组织增生（intra-alveolar fibrosis with septal elastosis, AFE）的有趣分区现象，这由PPFE相关细胞类型之间的细胞间环路所维持。与特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）的比较分析显示，CTHRC1+纤维化成纤维细胞和异常基底样细胞是跨间质性肺疾病中介导胶原沉积的保守促纤维化细胞机制。这个综合性图谱定义了PPFE的细胞景观，并将弹力组织重塑与纤维化重塑区分开来，为针对特定生态位的治疗策略提供了分子基础。

论文解读：

研究背景与问题

胸膜肺实质弹力纤维增生症是一种快速进展的间质性肺疾病，主要影响女性，目前除肺移植外尚无特异性治疗方法。PPFE具有独特的组织病理学特征，即以弹性纤维沿肺泡间隔沉积为特点的肺泡内纤维化伴间隔弹力组织增生。尽管单细胞RNA测序技术已显著改变了对包括特发性肺纤维化在内的多种呼吸系统疾病发病机制的理解，但对于非UIP模式的ILD，如PPFE，其单细胞层面的研究仍存空白。目前尚不清楚PPFE是由常见的IPF相关病理性细胞类型组成，还是存在PPFE特异性细胞群。理解这两种典型进展性但临床差异巨大的ILD之间共有的跨越疾病的肺纤维化原理，以及确定PPFE临床试验中有用的细胞或分子靶点，对于开发跨ILD的治疗方法和PPFE特异性治疗策略至关重要。为了填补这些知识空白，研究人员开展了这项研究。

研究方法概述

本研究建立了国际协作的单细胞分辨PPFE图谱。研究分析了来自德国汉诺威和法国巴黎三个欧洲ILD和移植中心的40名接受肺移植的PPFE患者以及16名对照的肺组织。研究人员进行了单核RNA测序，构建了包含320,541个单核转录组的PPFE图谱，并与已发表的来自9名IPF患者的199,379个细胞核数据（GSE286182）进行整合，以捕获这些进展性纤维化ILD的细胞景观。研究人员使用了显微计算机断层扫描（micro-CT）引导的多重RNA原位杂交、免疫荧光显微镜、分层相差同步辐射计算机断层扫描和透射电子显微镜进行验证和定位，并结合了广泛的计算机模拟配体-受体分析。

研究结果

1. 队列和数据集特征

本研究共分析了23名德国患者和17名法国患者的肺组织，并整合了9名比利时IPF患者的数据。PPFE患者群体以年轻、不吸烟的女性为主，这与主要由老年男性吸烟者组成的IPF单细胞测序数据集形成对比。细胞频率分析显示，与对照组和IPF相比，PPFE队列中淋巴系细胞比例显著增加，且与连续切片中重塑的肺实质比例相关。研究人员将原始测序数据提交至GEO，并建立了在线可交互探索的数据网站。

2. PPFE中的间质细胞多样性

间质细胞构成了所有分析细胞的20.8%。研究人员鉴定了多种成纤维细胞亚型，包括常驻肺泡成纤维细胞、胸膜下成纤维细胞、血管周围成纤维细胞和气道成纤维细胞。值得注意的是，在IPF中发现的介导胶原沉积的主要促纤维化细胞类型——CTHRC1⁺纤维化成纤维细胞，在PPFE中同样以相似的比例出现，是肺实质胶原和蛋白聚糖的主要来源。然而，PPFE特有的变化在于血管周围成纤维细胞和类似血管周围的“弹力纤维化”成纤维细胞的比例增加。弹力纤维化成纤维细胞因其转录谱与血管周围成纤维细胞和CTHRC1⁺纤维化成纤维细胞重叠而得名，并共表达弹力纤维形成相关基因以及LEPR和ITGA8。此外，PPFE肺泡成纤维细胞表现出GREM1、IGF1和COL14A1表达增加，提示其从常驻肺泡细胞向位于叶间隔、支气管血管束或胸膜下结缔组织的间质细胞类型的早期表型转变。

3. PPFE成纤维细胞的炎症激活状态

PPFE与对照组间质细胞间的差异表达分析揭示了与“炎症成纤维细胞”状态相关的基因表达上调，包括CXCL12和CXCL14以及干扰素信号相关基因。在PPFE中，多种成纤维细胞亚群获得了这种炎症激活状态，表现为CXCL12的表达。值得注意的是，与对照组和IPF相比，PPFE成纤维细胞中这些细胞因子的表达更高。不同成纤维细胞亚群的炎症激活细节存在差异：胸膜下成纤维细胞表达独特的干扰素/TNF反应特征，而CXCL12和CXCL14的共表达仅限于弹力纤维化及血管周围成纤维细胞。

4. PPFE中的免疫细胞景观

与上述淋巴细胞趋化因子表达增加一致，研究人员观察到PPFE肺组织中淋巴系细胞比例相对于对照组和IPF显著增加。免疫表型分析揭示了PPFE肺中广泛的免疫细胞库。相比之下，肺泡巨噬细胞比例相对降低，经典单核细胞比例增加，而SPP1⁺CHIT1⁺促纤维化巨噬细胞并未升高。

5. 免疫-间质细胞通讯网络划分为三个不同的生态位

结合计算机模拟的细胞间通讯分析和原位定位，研究人员在PPFE病变中发现了三个相互关联的信号枢纽。第一个枢纽是以炎症成纤维细胞群和形成三级淋巴结构的淋巴细胞为中心的增强信号回路，称为“TLS生态位”。CXCL12⁺成纤维细胞和表达相应受体CXCR4的淋巴细胞亚群之间的信号传导是该枢纽的一个主要非细胞外基质相关通路。第二个枢纽是“TLS周围髓系细胞生态位”，其中CD14⁺单核细胞聚集在TLS周围，并与多种成纤维细胞亚群显示出增加的通讯权重，特别是通过CSF1-CSFR轴。第三个枢纽是“促纤维化淋巴-成纤维细胞通讯”，与观察到的TLS与通常纤维化生态位在空间上邻近相符。靶向配体-受体分析揭示了PPFE队列中部分淋巴细胞亚群中经典TGFB1信号传导的广泛上调，可能通过TGFB信号传导催化局部促纤维化间质激活和纤维化重塑。

6. PPFE重塑在空间上组织成四个不同的区域

间质标志基因的空间原位图谱显示，PPFE病变具有空间组织性，定义了四个具有不同细胞组成的生态位。从胸膜表面到看似未重塑的肺泡实质，这些区域包括：胸膜下纤维化区，由HAS1⁺WT1⁺胸膜下成纤维细胞组成，表现出强烈的炎症特征；弹力纤维化区，包含SFRP2⁺血管周围和弹力纤维化成纤维细胞，并与重塑的肺泡间隔残留物共存，涉及弹力纤维代谢和糖胺聚糖代谢相关基因的表达；免疫纤维化区，一层有组织的免疫细胞浸润带，将弹力纤维化区与通常纤维化生态位分开，该区域富含CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞和SFRP2⁺成纤维细胞；通常纤维化生态位，由CTHRC1⁺纤维化成纤维细胞和其上覆盖的单层异常基底样细胞在纤维肺泡重塑边缘形成的一条连续带组成，是胶原沉积的主要区域。

7. 异常基底样细胞衬覆纤维上皮重塑边缘

研究人员在PPFE和IPF队列中均鉴定出具有相当高频率的异常基底样细胞。免疫荧光染色证实它们作为细胞单层衬覆在弹力纤维化重塑的边缘，覆盖着CTRHC1⁺纤维化成纤维细胞，共同组成“通常纤维化生态位”。CellChat交互作用分析显示，CTHRC1⁺纤维化成纤维细胞是与异常基底样细胞连接性最高的信号枢纽，涉及的通讯通路与胶原、层粘连蛋白、血小板反应蛋白和纤连蛋白的分泌相关。异常基底样细胞表达多种刺激性配体，可通过相应受体预测性激活其周围生态位中的成纤维细胞。

8. PPFE病灶血管复合体的多模态分析

PPFE组内皮细胞频率分布向两个异位细胞群偏移。首先，淋巴管内皮细胞在PPFE中增加，免疫荧光显示淋巴管在AFE病变中扩张。其次，研究人员观察到异位系统性-静脉内皮细胞的相对增加。3D HiP-CT重建显示，位于弹力纤维化区和胸膜下纤维化区交界处的明显血管复合体与叶间静脉相通，提示系统性-静脉和肺静脉血管系统之间存在血管吻合。微CT成像也证实了大量小血管从肺泡实质通过重塑边缘浸润到重塑的PPFE组织中。

讨论与结论

本研究提供了一个双国单核RNA测序图谱，描绘了PPFE的细胞和结构景观。在细胞水平上，研究人员观察到PPFE病变中间质细胞具有意想不到的激活状态和多样性，其表达谱反映了驱动弹力纤维化重塑的分工。在一种迄今为止被认为是纯弹力纤维化的疾病中，研究人员观察到了淋巴细胞显著扩增。研究人员在PPFE中发现了先前在IPF中被发现的成纤维细胞灶形成细胞——CTHRC1⁺纤维化成纤维细胞和异常基底样细胞。在组织学水平上，研究人员描述了PPFE病变的分区，包含上述PPFE相关细胞类型。与IPF的比较揭示了肺纤维化的共同原理，特别是通常纤维化生态位在两种临床差异巨大的进展性纤维化ILD中的出现。同时也突出了差异，特别是所有主要成纤维细胞群体中PPFE富集的炎症表型，纤维化重塑边缘附近引人注目的TLS形成，以及维持PPFE病变分区的细胞间回路。

这项研究揭示了PPFE中异位和异常细胞群以独特的分区模式在空间上组织。研究人员揭示了PPFE富集的炎症成纤维细胞激活状态是免疫纤维化重塑的基础，促进了弹力组织增生，并强调了异常基底样细胞和CTHRC1⁺纤维化成纤维细胞是驱动胶原性纤维化重塑的通常纤维化生态位的核心组成部分。PPFE图谱附有一个易于访问的网络工具，并为针对PPFE和跨ILD的生态位特异性治疗策略提供了分子基础。