重建的初始黏着斑冷凝物驱动肌动蛋白聚合于支撑脂双层膜

《SCIENCE ADVANCES》：Reconstituted nascent adhesion condensates drive actin polymerization on supported lipid bilayers

　　

摘要 初始黏着斑是早期基于整合素的复合体，它们将细胞外基质与肌动蛋白细胞骨架偶联，并成熟为黏着斑。许多初始黏着斑蛋白通过弱、多价的接触相互作用，这表明液状的组织方式可能有助于黏着斑的组装。然而，相分离如何塑造肌动蛋白的聚合和组织仍不清楚。本研究中，研究人员比较了两种血管舒张刺激磷蛋白（VASP）募集适配蛋白，即斑联蛋白（zyxin）和纽蛋白（vinculin），以确定适配蛋白的身份如何调节冷凝物性质和肌动蛋白偶联。斑联蛋白-VASP和纽蛋白-VASP组装体均能驱动整合素簇化并支持肌动蛋白丝生长。值得注意的是，斑联蛋白-VASP冷凝物保持流体性并沿新形成的肌动蛋白束重新分布，而纽蛋白-VASP冷凝物则更刚性，尽管能维持聚合，但未能沿肌动蛋白丝扩散。这些结果表明，差异性的VASP募集可调节冷凝物性质和肌动蛋白结构，为初始黏着斑成熟为黏着斑提供了一个潜在的机制。

研究背景与科学问题

黏着斑是位于细胞质膜的多蛋白组装体，在机械和生化上连接细胞外基质与肌动蛋白细胞骨架。整合素黏着的组装始于迁移细胞前缘处形成的小型、短寿命的初始黏着斑，其中一部分可成熟为更大、长寿命的黏着斑。初始黏着斑内的整合素簇化由弱、多价的蛋白质-蛋白质相互作用驱动，这是液-液相分离的典型特征。事实上，包括纽蛋白、斑联蛋白、VASP在内的多种黏着斑蛋白在体外可发生相分离，并且其中部分蛋白能在富含磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P₂）的脂膜上簇化整合素胞内尾。这些发现表明，膜辅助的相分离有助于初始黏着斑的组装。然而，由此产生的相分离组装体如何在不同黏着成熟阶段触发肌动蛋白聚合并调节细胞骨架组织，目前仍不清楚。肌动蛋白聚合对于初始黏着斑成熟、力传导和应力纤维形成至关重要。VASP是初始黏着斑中关键的肌动蛋白聚合因子，其本身也可在溶液中或锚定于脂双层时发生相分离并聚合并成核肌动蛋白。在细胞中，VASP通过适配蛋白如斑联蛋白和纽蛋白被靶向黏着斑位点。这两种蛋白在黏着成熟的不同阶段表现出差异行为：纽蛋白存在于初始黏着斑，而斑联蛋白在牵引力上升和黏着斑生长时变得愈发重要。相分离组装体的材料性质已知取决于其分子组成。因此，研究人员假设通过不同的适配蛋白募集VASP可以调节黏着冷凝物的性质，进而调节黏着组装过程中的肌动蛋白聚合和网络结构。虽然斑联蛋白和纽蛋白都能将VASP募集至整合素黏着斑，但它们是否差异性地调节VASP冷凝物的力学性质和肌动蛋白组织尚不清楚。

研究概述与意义

为了探究这一问题，本项研究发表在《SCIENCE ADVANCES》期刊上。研究人员在支撑脂双层膜上重建了一个最小化的初始黏着斑样系统，以直接比较斑联蛋白和纽蛋白介导的VASP组装体。研究发现，两种适配蛋白-VASP复合物均能形成具有不同物理性质和肌动蛋白网络几何特征的冷凝物。斑联蛋白基组装体保持流体性并促进肌动蛋白束化，而纽蛋白基组装体则更刚性，支持肌动蛋白丝生长但不形成束。这些发现表明，黏着适配蛋白对冷凝物材料性质的差异性调控有助于整合素黏着组装的不同阶段。该研究为理解相分离在黏着斑组装和细胞骨架组织中的作用提供了新的实验证据和机制见解。

关键技术方法简述

研究采用体外重建方法，核心是在含有PI(4,5)P₂的支撑脂双层膜上组装功能性的黏着蛋白复合物。主要技术包括：利用荧光标记蛋白（如斑联蛋白-mCherry、纽蛋白-AF555、VASP-AF532、β1整合素尾-ATTO647等）进行荧光成像；通过宽场荧光显微镜和全内反射荧光显微镜监测冷凝物形成、整合素尾簇化及肌动蛋白聚合动态；采用荧光漂白后恢复技术定量分析β1整合素尾的扩散动力学以及冷凝物内部的流动性；通过芘-肌动蛋白聚合实验检测冷凝物在CapZ和profilin存在下促进肌动蛋白聚合的能力；利用图像分析软件对冷凝物面积、偏心率、肌动蛋白束线密度等参数进行量化分析。

研究结果

斑联蛋白和纽蛋白与VASP发生相分离并聚合肌动蛋白

研究人员在支撑脂双层膜上重建了最小初始黏着斑样复合物，该系统复现了初始黏着斑的两个关键特征：整合素尾簇化和局域化肌动蛋白聚合。实验表明，斑联蛋白-VASP和纽蛋白-VASP复合物在溶液中快速发生相分离，形成生物分子冷凝物并附着于膜上。芘-肌动蛋白聚合实验证实，两种冷凝物均能在抑制因子CapZ和profilin存在的情况下恢复肌动蛋白聚合。当含有PI(4,5)P₂的膜上形成冷凝物后，加入肌动蛋白聚合混合物可导致肌动蛋白快速富集于冷凝物内并发生聚合。然而，两种冷凝物介导的肌动蛋白丝起源不同：斑联蛋白-VASP的肌动蛋白丝多从冷凝物内部开始聚合，而纽蛋白-VASP的肌动蛋白丝主要在冷凝物外部形成后被捕获并入。

斑联蛋白-VASP和纽蛋白-VASP冷凝物形成及β1尾簇化依赖于膜功能化

研究通过单独或组合孵育蛋白质，剖析了VASP、斑联蛋白和纽蛋白在冷凝物形成中的各自作用。单独VASP既不诱导相分离也不簇化β1整合素尾。单独斑联蛋白或纽蛋白可吸附于膜上但不诱导相分离。只有当斑联蛋白或纽蛋白与VASP结合时，才会在溶液中发生快速相分离并形成附着于膜的冷凝物。实验进一步评估了talin-1和kindlin-2在冷凝物附着和β1尾簇化中的作用。对于斑联蛋白-VASP，在talin-1或kindlin-2单独存在时附着增加，两者共存时达到最大；而对于纽蛋白-VASP，冷凝物数量仅在两种蛋白共存时增加。去除PI(4,5)P₂会减少两种系统膜相关冷凝物的数量。两种冷凝物均促进β1尾簇化，且在talin-1和kindlin-2共存时效应最强。荧光漂白后恢复实验表明，kindlin-2显著降低了β1尾的扩散和流动分数，talin-1单独作用甚微，两者共存时降低效应最强。这表明kindlin-2对β1尾的稳定作用强于talin-1，它们的共同存在增强了膜与冷凝物之间的相互作用以及β1尾的簇化。

斑联蛋白-VASP和纽蛋白-VASP冷凝物产生不同的肌动蛋白网络

虽然两种冷凝物都能促进肌动蛋白聚合，但所产生的肌动蛋白结构存在显著差异。首先，来自斑联蛋白-VASP网络的肌动蛋白丝在相遇时会“拉链式”合并成束，而纽蛋白-VASP网络中的肌动蛋白丝则交叉穿过而不合并成束。因此，斑联蛋白-VASP主要产生由肌动蛋白束组成的互连网络，而纽蛋白-VASP则产生以单丝为主、束数量较少的网络。为了探究这些行为差异是否源于冷凝物性质不同，研究人员观察了肌动蛋白聚合过程中冷凝物的行为。随着肌动蛋白聚合，斑联蛋白-VASP冷凝物沿生长中的肌动蛋白丝延伸，并在丝束化时进一步拉长并“润湿”肌动蛋白束。相比之下，纽蛋白-VASP冷凝物保持恒定形状，既不显示肌动蛋白润湿也不形成丝束。偏心率测量证实了斑联蛋白-VASP冷凝物形状变得更加细长，而纽蛋白-VASP则无变化。荧光漂白后恢复测量显示，两种冷凝物均有荧光恢复，表明存在液相分离特征性的流动部分，但纽蛋白-VASP冷凝物的恢复速度比斑联蛋白-VASP慢四倍，表明其内部流动性更低，类似于更交联或凝胶化的系统。鉴于斑联蛋白-VASP网络的高度连通性和冷凝物流体性，研究人员测试了其对力的响应性。当在斑联蛋白-VASP聚合的肌动蛋白网络中引入α-辅助动蛋白和NMMII时，肌动蛋白网络发生显著收缩，斑联蛋白-VASP冷凝物从膜上脱离但仍与肌动蛋白网络连接，并随着收缩进程相互聚集融合。

讨论与结论

本研究表明，重建的黏着冷凝物可以通过差异性的VASP募集来调节其材料性质和肌动蛋白组织，从而可能影响黏着斑的成熟过程。纽蛋白-VASP冷凝物行为更偏向固态，而斑联蛋白-VASP冷凝物则更富流体性。这种差异与肌动蛋白结构相关联：斑联蛋白-VASP冷凝物的流体性支持肌动蛋白束的生长，而纽蛋白-VASP冷凝物则产生肌动蛋白单丝。此外，斑联蛋白-VASP网络显示出肌球蛋白驱动的冷凝物融合和肌动蛋白簇化。基于这些发现，研究人员提出了一个由膜辅助相分离驱动的初始黏着斑组装和成熟的假设模型。模型步骤包括：整合素激活与稳定；通过液-液相分离形成初始黏着斑；整合素簇化与活性整合素筛选；肌动蛋白与初始黏着斑偶联；斑联蛋白-VASP募集与肌动蛋白束化；力依赖性成熟与应力纤维形成。该研究强调了相分离可能通过局部富集关键成分并促进与肌动蛋白的偶联来帮助组织初始黏着斑。冷凝物动力学的差异可能产生黏着异质性，并在成熟过程中调节肌动蛋白组织和力传导，表明相分离可能是整合素黏着组装的一个更广泛的组织原则。然而，本研究中的系统未涵盖细胞环境的全部复杂性，如缺乏上游信号通路、全长整合素和细胞外基质接合等，这限制了将体外结果直接外推至细胞环境。