Pleurotus ostreatus提取槲皮素对铜绿假单胞菌群体感应及生物膜形成的调控

《Infection and Drug Resistance》：Modulation of Pseudomonas aeruginosa Quorum Sensing and Biofilm Formation by Quercetin Extracted from Pleurotus ostreatus

　　

背景： 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)依赖群体感应(Quorum Sensing, QS)调控毒力、生物膜形成及耐药耐受性，使得QS抑制(Quorum Sensing Inhibition, QSI)成为一种极具吸引力的抗毒力策略。槲皮素(Quercetin)是一种已知的具有QSI活性的黄酮类化合物，但其作为蘑菇来源的治疗剂潜力仍未得到充分探索。 方法： 研究人员从糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)中提取槲皮素，并利用基于GFP的报告基因分析(lasB-gfp和pqsA-gfp)、生物膜试验、蛋白酶活性测定以及对LasR、PqsR和PqsE的分子对接技术，将其与纯化槲皮素进行了评估。 结果： 在不影响细菌生长或活力的亚抑制浓度(10–100 μM)下，两种处理均显著降低了lasB和pqsA驱动的GFP报告基因活性。抑制作用呈剂量依赖性，且在PQS系统中更为显著，同时伴随胞外蛋白酶活性的大幅降低，并强烈抑制生物膜形成及部分分散已建立的生物膜。分子对接揭示了槲皮素与QS调节因子LasR和PqsR的有利结合，其中在PqsR辅诱导物口袋中表现出高亲和力相互作用，而与PqsE的结合则微弱且非特异性。 结论： 这些机制见解与观察到的PQS优先抑制现象相一致。糙皮侧耳槲皮素提取物在所有试验中均与纯槲皮素的效力紧密匹配，证实了提取的有效性和稳定性。这确立了蘑菇源槲皮素作为一种可持续的天然QSI的潜力，能够减弱铜绿假单胞菌的关键毒力通路。本研究支持开发富含槲皮素的糙皮侧耳提取物作为管理慢性、生物膜相关感染的潜在辅助疗法。

本研究由相关领域科研人员开展，旨在探讨源自糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的槲皮素对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应(Quorum Sensing, QS)系统的调控作用及其潜在机制。该研究发表于《Infection and Drug Resistance》。

研究背景聚焦于铜绿假单胞菌作为一种机会性病原体，其持久性和耐药性很大程度上由QS系统介导。QS是一种细胞密度依赖性的通讯系统，调控多种毒力因子、生物膜成熟及耐药耐受性的表达。传统的抗生素疗法面临日益严重的耐药性问题，因此干扰QS的策略，即群体感应抑制(Quorum Sensing Inhibition, QSI)，因其不直接杀灭细菌、施加的选择压力较低而备受关注。虽然植物源槲皮素的QSI特性已被广泛研究，但蘑菇来源的槲皮素在此领域的潜力尚不明确。鉴于糙皮侧耳作为一种广泛栽培、营养丰富的食用真菌，是生物活性化合物的可持续来源，研究人员假设其提取物中的槲皮素可作为有效的天然QSI剂。

为实现研究目标，研究人员采用了多项关键技术方法。首先，利用GFP为基础的QS报告系统(lasB-gfp和pqsA-gfp)定量检测QS活性。其次，通过结晶紫染色法进行生物膜形成与破坏试验。此外，利用分子对接技术(AutoDock Vina)模拟槲皮素与QS关键调节蛋白(LasR、PqsR、PqsE)的结合模式。最后，通过微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)以确定亚抑制浓度范围。

研究结果部分详细阐述了实验发现。在抗菌活性方面，纯槲皮素与蘑菇提取物的MIC值分别为100 μM和115 μM，且在亚抑制浓度(10–100 μM)下不影响细菌生长与活力。生长曲线分析证实，在此浓度范围内，OD₆₀₀与活菌计数(CFU/mL)与对照组无显著差异。

关于QS抑制效应，荧光报告基因检测显示，两种槲皮素处理均呈剂量依赖性显著降低lasB和pqsA启动子的转录活性。值得注意的是，对pqsA-gfp的抑制效果(最高达62.9%)明显强于lasB-gfp(最高达41.2%)，表明PQS系统对此更为敏感。变异性分析进一步支持了这一结论，pqsA-gfp荧光的方差降低幅度更大。

在生物膜研究中，预防性试验显示50 μM浓度的纯槲皮素和提取物分别减少了68.2%和64.7%的生物膜生物量；在破坏已建立生物膜的试验中，相应数值为42.9%和39.6%，证明了其显著的体外抗生物膜功效。

蛋白酶活性测定验证了功能性毒力因子的抑制。随着浓度升高，蛋白酶水解活性呈剂量依赖性下降，与lasB报告基因的抑制趋势一致。

分子对接结果揭示了潜在的分子机制。槲皮素与PqsR(MvfR)辅诱导物结合域表现出最强的结合亲和力(-6.7 kcal/mol)，其通过与Ala102、Thr166、Leu207及Thr265等关键残基形成广泛的疏水接触和氢键，模拟了已知PqsR拮抗剂的结合模式。与LasR配体结合域的结合亲和力次之(-6.6 kcal/mol)，主要通过羟基与His78、Thr80、Gln81等残基形成氢键网络。相比之下，槲皮素与PqsE硫酯酶的结合极弱(-3.3 kcal/mol)，且未能深入催化空腔，表明PqsE并非其主要靶点。

讨论部分总结了这些发现的意义。研究证实糙皮侧耳提取的槲皮素在功能上与纯化槲皮素等效，能有效抑制QS和生物膜形成。分子机制研究表明，槲皮素主要通过拮抗PQS系统的核心调节因子PqsR发挥主要作用，同时对LasR有部分干扰，而对PqsE几乎无直接影响。这种对PQS通路的优先抑制具有治疗优势，因为PQS在协调生物膜稳健性和持续感染中处于核心地位。此外，由于该策略不抑制细菌生长，施加的进化选择压力较小，不易诱发耐药性。

结论部分指出，无论是纯化还是源自糙皮侧耳的槲皮素，均能在非抑制浓度下有效抑制铜绿假单胞菌PAO1的群体感应及生物膜相关毒力。分子对接数据支持了PQS系统的优先抑制机制，即槲皮素与PqsR的高亲和力结合以及与LasR的有利相互作用。该研究确立了糙皮侧耳作为QSI活性黄酮类化合物的可行天然来源，突显了蘑菇源槲皮素作为一种可持续的抗毒力候选物，在辅助治疗慢性、生物膜介导的感染方面具有重要潜力。