人工甜味剂诱导细菌耐药性并调节基因表达

《Infection and Drug Resistance》：Artificial Sweeteners Induce Bacterial Drug Resistance and Modulate Gene Expression

　　

目的： 探究人工甜味剂在规定每日摄入量水平下，对细菌抗生素敏感性降低以及抗生素耐药性和毒力相关基因表达的影响。 方法： 研究人员首先评估了五种常用人工甜味剂（糖精（SAC）、环磺酸盐（CYC）、阿斯巴甜（ASP）、安赛蜜（ACE-K）和三氯蔗糖（SUC））对大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抗菌作用，并检测了活性氧（ROS）产生的变化。在暴露2小时后，通过转录组测序研究了与耐药性、氧化应激和毒力相关基因的表达。 结果： 人工甜味剂对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）均高于国际食品法典委员会（CAC）定义的每日摄入限值。除糖精（SAC）外，这些甜味剂在48小时内对细菌生长无显著影响。然而，在此限值浓度下，人工甜味剂与抗生素敏感性降低、耐药相关基因上调以及ROS产生增加相关。2小时的转录组分析显示，与葡萄糖（GLC）对照相比，人工甜味剂上调了与耐药性、氧化应激和毒力相关的基因。此外，研究人员观察到人工甜味剂对大肠杆菌中铁摄取相关基因的影响，这表明其对细菌铁死亡具有潜在影响，需进一步验证。 结论： 暴露于CAC允许剂量的人工甜味剂与抗生素敏感性降低相关，并可能影响细菌功能。因此，人工甜味剂作为天然糖替代品的安全性需要仔细评估和进一步的体内验证。

论文解读：人工甜味剂对细菌耐药性与基因表达的调控作用研究

一、 研究背景、问题与目的

人工甜味剂因其高甜度和低热量的特性，被广泛用作食品添加剂和天然糖的替代品，尤其在针对肥胖和糖尿病患者的食品中。传统上，它们被认为是代谢惰性的。然而，越来越多的证据表明，长期摄入人工甜味剂可能与代谢疾病风险增加相关。与此同时，抗生素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生危机，其产生通常归因于抗生素的滥用。值得注意的是，一些常用人工甜味剂（如糖精、安赛蜜）含有类似磺胺类抗生素的磺酰基，且比天然甜味剂更可能引发氧化应激，而氧化应激通常导致细菌对抗生素产生耐药性。尽管人工甜味剂可能通过改变肠道微生物组成和功能，对抗生素耐药性进化产生选择压力，但关于其在每日摄入剂量下对细菌耐药性及相关基因表达影响的研究尚不充分。因此，本研究旨在探究在CAC规定的每日摄入水平下，常用人工甜味剂是否会影响细菌对抗生素的敏感性，并调控与耐药、氧化应激及毒力相关的基因表达，以评估其作为天然糖替代品的安全性。

二、 研究方法概述

本研究选取了五种常用人工甜味剂（糖精 SAC、环磺酸盐 CYC、三氯蔗糖 SUC、阿斯巴甜 ASP、安赛蜜 ACE-K）和两株代表性肠道共生细菌（革兰氏阴性的大肠杆菌 ATCC 25922 和革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌 ATCC 6633）。研究人员首先测定了甜味剂对细菌生长曲线的影响及其最小抑菌浓度（MIC）。通过测量细胞内活性氧（ROS）水平评估了甜味剂诱导的氧化应激。核心部分是利用转录组测序（RNA-seq）技术，在细菌暴露于甜味剂2小时后，分析差异表达基因（DEGs）。生物信息学分析采用DESeq2软件，以|log2FoldChange| >1且调整后p值（padj）<0.05为标准筛选差异基因。所有数据统计分析采用方差分析（ANOVA）和独立样本t检验。

三、 研究主要结果

1. 1.
   人工甜味剂对细菌生长曲线的影响： 通过绘制生长曲线发现，除糖精（SAC）对大肠杆菌生长有显著影响外，其他四种甜味剂在CAC规定浓度下，在48小时内对两种细菌的生长均无显著抑制作用。然而，暴露于所有甜味剂24小时后，细菌生长速率均减缓或下降，而葡萄糖（GLC）组则持续生长。
2. 2.
   人工甜味剂的最小抑菌浓度： 所有测试甜味剂对两种细菌的MIC均高于实验所用的CAC最大浓度，表明在日常使用浓度下，人工甜味剂无明显抗菌特性。然而，暴露于人工甜味剂48小时后，两种细菌对氨苄西林（Amp）的MIC值均增加了2至4倍，表明抗生素敏感性降低（产生了适应性耐受），而GLC组则无此变化。
3. 3.
   耐药相关基因的表达： 转录组分析（暴露2小时）的主成分分析（PCA）显示，人工甜味剂处理组与GLC对照组在基因表达谱上能明显区分。热图分析表明，与GLC对照组相比，甜味剂处理组中与耐药性相关（主要为外排泵基因）的基因表达大多上调，这一现象在大肠杆菌中尤为明显。例如，在CYC处理的大肠杆菌中，acrA、acrB和tolC（AcrAB-TolC外排泵复合体组分）的表达分别上调了1.6、2.5和2倍。在SUC处理组中，外膜蛋白基因ompA、ompC和ompF表达显著上调。此外，多种甜味剂处理均导致msbA（ABC转运蛋白，参与脂多糖合成）等基因表达大幅上调。
4. 4.
   人工甜味剂对活性氧及相关基因表达的影响： 暴露2小时后，与对照组相比，人工甜味剂处理组中两种细菌的细胞内ROS水平均显著增加，且与浓度呈正相关，而GLC处理则未增加甚至降低了ROS产生。转录组数据显示，与氧化应激相关的基因在人工甜味剂组中普遍高表达。例如，在CYC处理的大肠杆菌中，soxS、hupA和oxyR基因表达分别上调了14.4、4.7和4.7倍。这些结果证实，在早期暴露阶段，人工甜味剂比GLC更易促进细菌细胞内ROS的过量产生。
5. 5.
   人工甜味剂对毒力相关基因表达的影响： 暴露2小时后，与GLC对照组相比，人工甜味剂处理组上调了两种细菌中毒力因子相关基因的表达。在大肠杆菌中，所有五种甜味剂处理均显著上调了rstA基因（编码调控铁摄取和毒力的转录调节因子）的表达，其中CYC组上调高达16.7倍。slyD基因（被鉴定为新的毒力因子）的表达在所有甜味剂组中也上调了5倍以上。在枯草芽孢杆菌中，与孢子形成相关的关键调控基因spo0A、spo0B和spoIIAA在部分甜味剂处理组中表达显著上调，表明人工甜味剂的添加对细菌造成了一定压力，可能促进孢子形成。

四、 讨论与结论

讨论总结： 本研究结果表明，在CAC允许的膳食浓度下，人工甜味剂虽无明显杀菌效果，但可诱导细菌产生氧化应激，进而上调外排泵等耐药相关基因的表达，导致对抗生素的敏感性降低（适应性耐受），而非稳定的临床耐药性。这种效应是浓度依赖性的，高浓度下可能表现出杀菌或协同抗菌作用，而日常暴露水平下则呈现相反趋势。耐药性（如AcrAB-TolC外排泵上调）和毒力（如rstA和slyD基因上调）相关性状的共调控，提示人工甜味剂可能在降低抗生素敏感性的同时，无意中促进了更具毒力的表型。此外，人工甜味剂还影响了大肠杆菌中铁摄取相关基因（如feoA、feoB下调，rstA上调）的表达，这暗示了其对细菌铁代谢的潜在干扰，可能与铁死亡机制相关，但此推论需通过脂质过氧化测定等实验进一步验证。本研究的局限性包括：2小时的暴露仅捕获早期转录反应；观察到的MIC增加代表适应性耐受；单菌种培养无法复现复杂的肠道微生态；铁死亡假说需体内实验验证。

研究结论翻译： 结果表明，五种常用人工甜味剂（糖精、环磺酸盐、三氯蔗糖、阿斯巴甜和安赛蜜）对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）超过了CAC确定的每日限值浓度。除糖精（SAC）外，人工甜味剂在48小时内对大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的生长没有显著影响。然而，在此限值浓度下，它们与抗生素敏感性降低以及暴露2小时后活性氧（ROS）产生增加相关。2小时的转录组分析显示，与葡萄糖（GLC）组相比，人工甜味剂组通常上调了与耐药机制、氧化应激和毒力相关的基因。这种转录反应与诱导适应性耐受而非稳定的临床耐药性一致。此外，人工甜味剂影响了大肠杆菌中铁摄取相关基因的表达，尽管其对铁死亡的影响仍是推测性的，需要通过脂质过氧化测定来验证。

这些发现来源于体外单菌种细菌培养，应谨慎解释，因为它们无法完全复现人类肠道微生物组的复杂性。虽然我们的结果强调需要仔细考虑人工甜味剂在允许的每日摄入水平下的安全性，但它们不能替代临床或体内研究。未来的研究应包括使用复杂的微生物组模型进行纵向体内研究，以评估慢性低剂量暴露是否会选择出稳定的耐药性，并通过铁代谢研究验证铁死亡假说。考虑到人工甜味剂在全球食品和医药中的广泛使用，它们对细菌抗生素敏感性的潜在影响值得在生理相关条件下进行进一步的体内研究。

（本研究发表于《Infection and Drug Resistance》期刊。）