女性生殖和激素因素对骨质疏松症、骨密度及骨关节炎的因果影响：一项双样本孟德尔随机化研究

《International Journal of Women's Health》：Causal Effects of Female Reproductive and Hormonal Factors on Osteoporosis, Bone Mineral Density, and Osteoarthritis: A Two-Sample Mendelian Randomization Study

　　摘要
目的：女性生殖和激素因素与骨骼疾病之间的因果关系尚未明确，部分原因在于观察性证据的矛盾以及潜在的反向因果关系。我们使用双向孟德尔随机化（MR）方法来阐明这些关系。

方法：利用主要是欧洲血统个体的大规模全基因组关联研究（GWAS），我们分析了12种生殖和激素暴露因素（包括生殖里程碑、生育史和激素干预），与7种骨骼相关结果进行对比。在通过MR-PRESSO测试去除多效性异常值后，使用逆方差加权（IVW）MR方法估计遗传预测的因果效应。使用MR-Egger、Stegger方向性和留一法分析来评估异质性和多效性。

结果：经过FDR校正（FDR < 0.05）后，遗传预测的效应显示青春期晚期与较高的骨质疏松风险（OR: 1.59）和较低的骨密度（BMD）（OR: 0.88）相关，而绝经期晚期与较低的骨质疏松风险（OR: 0.74）相关；在去除异常值后，45-60岁女性的BMD较高（OR: 1.17）。曾经使用激素替代疗法也与修正后的中年BMD较高相关（OR: 0.71）。较长的月经周期与较低的BMD相关（OR: 0.83），最后一次使用口服避孕药（OCP）的年龄较晚与较低的BMD有轻微关联（OR: 0.65）。对于骨关节炎，首次和最后一次活产的年龄较晚与较低的风险相关（OR: 0.81和0.75），而开始使用OCP的年龄较晚与较低的骨关节炎风险相关（OR: 0.88）。

结论：本研究提供了遗传证据，证明较长的生殖寿命对骨骼健康具有保护作用。激素因素对骨质疏松和骨关节炎具有不同的因果影响，这对于制定有针对性的预防策略至关重要。

关键词：孟德尔随机化；骨质疏松；骨关节炎；生殖因素；骨密度；雌激素

引言：
骨质疏松及其导致的脆弱性骨折是主要的公共卫生问题，尤其是在全球人口老龄化背景下。这些状况导致了大量的发病率、死亡率和社会经济负担。

参考文献：
1、2 全球范围内，由于低骨密度（BMD）及相关骨折导致的伤残调整生命年（DALYs）和死亡人数在过去三十年中显著增加。
3-5 在低收入和中等收入国家，这种负担尤为严重，快速的人口老龄化和有限的筛查资源加剧了骨质疏松和骨关节炎的影响，因此迫切需要有效的预防和管理策略。实施预防措施需要全面了解影响骨骼代谢的因素。骨骼代谢受多种因素调节，其中性激素起着关键作用。
在众多影响骨骼健康和疾病的性激素中，雌激素因绝经期间雌激素缺乏与绝经相关骨骼疾病之间的明确关联而被广泛研究。
机制上，多项研究表明雌激素及其受体可以影响骨细胞对机械负荷的敏感性及随后的骨细胞机械转导过程，强调了雌激素在骨骼健康中的关键作用。
雌激素缺乏，尤其是在绝经后，会破坏骨吸收和形成的平衡，导致骨丢失加速和骨强度下降，从而增加骨折风险。
除了骨质疏松，骨关节炎（OA）也是老年人致残的主要原因之一。OA在性别上存在显著差异，女性尤其是绝经后的发病率和严重程度更高。雌激素受体（ERα和ERβ）在关节软骨和软骨下骨中表达，支持雌激素信号在软骨细胞代谢和细胞外基质稳态中的作用。
实验证据表明雌激素调节炎症途径和软骨更新；然而，流行病学研究报道雌激素暴露、激素替代疗法（HRT）与OA风险之间的关联并不一致。这些差异突显了需要因果推断方法来澄清激素在关节疾病中的作用。同时研究骨质疏松和OA至关重要，因为它们共享年龄和激素变化等风险因素，但其潜在的病理生理机制和对激素的反应可能不同，形成复杂的临床挑战。
女性的一生中，生殖和激素因素显著影响内源性雌激素水平。观察性研究发现，青春期晚期（内源性雌激素暴露时间较短）与绝经后女性较低的BMD相关。同样，使用HRT被证明可以预防绝经后骨丢失并降低骨折率。然而，其他常见暴露因素的证据存在争议，例如口服避孕药（OCP）对峰值骨量的净效应仍存在争议，而生育的终生骨骼影响尚不清楚。特别是雌激素在OA中的作用尤为神秘，观察性研究报告了保护性和有害效应的矛盾证据。这些观察结果容易受到残余混杂因素（如生活方式、社会经济地位）和反向因果关系的影响，从而掩盖了真实的因果关系。因此，迫切需要进行严格的病因学调查来澄清这些复杂的关联。
孟德尔随机化（MR）是一种强大的遗传流行病学方法，利用遗传变异作为工具变量（IVs）来推断暴露对结果的因果效应。通过利用受孕时的遗传变异随机分配，MR最小化了混杂因素，并且不易受到反向因果关系的影响，从而模仿了自然的随机对照试验。这种方法可以为激素暴露与骨骼健康之间的因果关系提供更有力的证据。
观察性研究已将个别生殖因素与骨骼结果联系起来，但这些关联可能受到生活方式和反向因果关系的干扰。最近的MR研究评估了青春期、绝经期以及选定的生殖特征与骨质疏松或特定BMD指标（如总BMD或部位特异性BMD）的关系，其中一些研究包括了按年龄分层的BMD分析，但没有评估OA。迄今为止，尚无MR研究在单一分析框架内系统地整合多种生殖和激素因素，同时评估骨质疏松、OA和按年龄分层的BMD。

因此，本研究旨在进行一项全面的双向MR分析，系统评估广泛的女性生殖和激素因素（分为生殖时机（青春期年龄、绝经期年龄、月经周期长度）、生殖史（首次和最后一次活产年龄、与生育相关的特征）以及激素干预（OCP使用、HRT和双侧卵巢切除术）对骨质疏松风险、不同生命阶段的BMD、脆弱性骨折和OA的因果效应。通过提供这些因果途径的证据，我们旨在指导风险分层，确定潜在的干预目标，并最终为这些致残性骨骼和关节疾病的个性化预防策略的发展做出贡献。

材料与方法：
本研究采用双向MR框架来评估12种生殖和激素暴露与7种骨骼相关结果之间的因果关系。该设计基于三个核心假设：（i）这些遗传变异与感兴趣的暴露因素有强烈关联；（ii）它们与暴露-结果关系的任何混杂因素无关；（iii）它们仅通过暴露因素影响结果。由于遗传变异在受孕时是固定的，MR估计反映了遗传预测暴露的累积 lifetime 效果。研究设计的概述见图1。本研究遵循STROBE指南（补充文件1）。

数据来源：
所有分析均基于大规模全基因组关联研究（GWAS）的公开可用汇总级数据，主要涉及欧洲血统的个体。12种暴露因素包括与生殖周期和生育史相关的因素（青春期年龄、绝经期年龄、月经周期长度、首次活产年龄、最后一次活产年龄）以及激素干预（是否使用HRT、开始使用HRT的年龄、最后一次使用HRT的年龄、开始使用OCP的年龄、最后一次使用OCP的年龄、双侧卵巢切除术的年龄）。7种结果包括骨质疏松（GCST90086118）、全身骨密度（BMD）及其按年龄分层的指标（>60岁、45-60岁和30-45岁；分别为ebi-a-GCST005348、ebi-a-GCST005350、ebi-a-GCST005346）、脆弱性骨折（finn-b-OSTEOPOROSIS_FRACTURE_FG）和OA（GCST90566795）。
由于暴露数据来自基于UK Biobank的GWAS，因此评估了样本与结果数据集之间的潜在重叠。骨质疏松（GCST90086118）基于美国人群，不包括UK Biobank的参与者。对于BMD GWAS，UK Biobank贡献了1,553名个体（占56,284名的2.76%），表明重叠较少。对于OA（GCST90566795；PMID: 40205036），UK Biobank贡献了425,643名参与者（占1,962,069名的21.69%），表明存在部分重叠。关于GWAS联盟、样本量和每个特征的详细信息，请参见补充表1。

工具变量选择：
对于每种暴露因素，我们根据严格的方案选择了单核苷酸多态性（SNPs）作为IVs。首先，在全基因组显著性阈值（P < 5 × 10^-8）下识别出与暴露因素强烈相关的SNPs。对于在这一水平上具有少于五个显著SNPs的暴露因素（最后一次使用HRT的年龄、双侧卵巢切除术的年龄、开始使用OCP的年龄、最后一次使用OCP的年龄），阈值放宽至P < 5 × 10^-6以确保足够的统计功效。为了保证工具变量的数量和估计精度，对于全基因组显著变异较少的特征，应用了严格的阈值（r2 < 0.001，窗口大小=10,000 kb）进行连锁不平衡（LD）聚类。排除了等位基因频率（MAF）≤ 0.01的SNPs。当结果GWAS中没有相应的IV时，我们在高LD（r2 > 0.8）下搜索代理SNP。我们协调了暴露和结果数据集，以确保每个SNP对暴露和结果的影响对应于相同的等位基因。移除了方向不明确的回文SNPs。使用F统计量评估所选IV的强度，计算公式为F = R2(N-2)/(1-R2)，其中R2是IV解释的暴露变异比例，N是暴露GWAS的样本大小。F统计量大于10表示工具变量足够强。在我们的分析中，所有保留的IV的F统计量均大于10，表明工具变量偏差的可能性较小。

孟德尔随机化分析：
主要分析使用随机效应逆方差加权（IVW）方法进行，该方法结合每个SNP的Wald比率来提供汇总的因果估计。IVW方法假设不存在水平多效性或多效性是平衡的。为了评估我们的发现稳健性，我们采用了几种互补的MR方法。MR-Egger回归提供了一个对方向性多效性具有鲁棒性的因果估计，尽管其统计功效较低。加权中位数方法即使在多达50%的IV无效的情况下也能提供一致的估计。加权模式方法基于具有相似因果效应的最大SNP簇提供估计。
对于BMD结果，原始GWAS已调整了年龄、身高、体重、主成分和研究特定的协变量，并对残差进行了逆正态变换。因此，SNP效应大小代表每1标准差（SD）的标准化BMD变化。在MR分析中，因果估计（β）经过指数化（比值比[OR] = eβ），因此报告的OR反映了每1 SD遗传预测的BMD差异对应的结果风险变化。

敏感性分析：
我们进行了全面的敏感性分析来评估MR假设的有效性。使用Cochran的Q统计量评估IVs之间的异质性。显著的异质性（P < 0.05）可能表明存在多效性效应。MR-Egger回归的截距项用于检测方向性多效性，P值< 0.05表明其存在。MR-PRESSO（多效性残差和异常值）测试用于通过识别和去除异常SNP来检测和校正水平多效性。通过系统地每次移除一个SNP并重新计算IVW估计来进行的留一法敏感性分析，以评估因果关联是否由单一有影响力的SNP驱动。最后，我们应用了Steiger方向性检验来验证作为工具变量（IVs）的遗传变异对暴露因素的影响比对结果因素的影响更强，从而支持了假设的因果方向。

**统计分析**
所有统计分析都是使用R语言（版本4.0.5）中的“TwoSampleMR”包进行的。为了考虑众多暴露-结果对之间的多重比较，我们应用了假发现率（FDR）校正。如果经过FDR校正后的P值小于0.05，则认为存在因果关联。

**工具变量选择和特征**
经过严格的选择和质量控制过程，为每一种暴露因素确定了一组独立且强相关的IVs。每种暴露因素的SNP数量从双侧卵巢切除术的6个到初潮年龄的201个不等。每个IV的F统计量显著高于常规阈值10（平均F统计量范围为22.69至82.84），表明弱工具变量偏差不太可能影响我们的结果。特定于暴露的工具变量在补充表2中提供，用于MR分析的标准化SNP级数据集在补充表3中呈现。

**主要孟德尔随机化结果**
在应用FDR校正后，我们在去除多效性异常值后进行了主要MR分析，发现了几种显著的关联。所有MR方法的估计结果总结在表1中。详细的多方法森林图显示在图2中。为了保持一致性，这里报告的所有效应估计值都是来自主要IVW分析的OR值。

**结论**
来自初次孟德尔随机化分析的生殖和激素因素对骨骼相关结果的因果估计

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**图2**
- 去除异常值前后生殖因素和骨骼结果的孟德尔随机化估计森林图。森林图显示了基于逆方差加权（IVW）、MR-Egger、加权中位数和加权众数方法的95%置信区间（CIs）的比值比（ORs）。
(A) 去除多效性异常值之前的估计。
(B) 通过MR-PRESSO识别出的多效性异常值去除之后的估计。垂直虚线代表零值（OR = 1）。

**生殖寿命、月经周期和骨骼健康**
如图3所示，与较短的内源性雌激素暴露窗口相关的因素与较差的骨骼健康状况相关。遗传预测的较晚初潮年龄与骨质疏松症风险增加有关（IVW OR：1.59，95% CI：1.24–2.04；FDR = 0.008，图3A）。这一发现还表明，较晚的初潮导致全身骨密度（BMD）降低（IVW OR：0.88，95% CI：0.82–0.94；FDR = 0.004，图3B），特别是在45–60岁年龄组中（IVW OR：0.87，95% CI：0.79–0.95；FDR = 0.028，图3C）。

相比之下，由于较晚的绝经年龄而导致的较长生殖寿命具有保护作用，显著降低了骨质疏松症的风险（IVW OR：0.74，95% CI：0.62–0.88；FDR = 0.009，图3D）。此外，较晚的绝经年龄与45–60岁女性的较高BMD相关（IVW OR：1.13，95% CI：0.88–0.95；P=0.008，FDR = 0.057，图3E）。我们还发现，较长的月经周期对骨骼健康有不利影响，特别是导致全身BMD降低（IVW OR：0.83，95% CI：0.73–0.94；FDR = 0.028，图3F），以及45–60岁年龄组中BMD降低（IVW OR：0.73，95% CI：0.61–0.89；FDR = 0.016，图3G）。相应的散点图显示在图4A–G中。

**生殖历史、激素干预和骨骼结果**
我们的分析发现生殖时间对骨关节炎（OA）有显著的保护作用。首次活产（IVW OR：0.81，95% CI：0.76–0.86；FDR < 0.001，图5A）和最后一次活产（IVW OR：0.75，95% CI：0.65–0.87；FDR = 0.006，图5B）的较晚年龄与OA风险降低相关。

激素干预与骨骼健康表现出复杂且不同的关联。最近一次使用口服避孕药（OCP）的较晚年龄与45–60岁年龄组中较低的BMD相关（IVW OR：0.65，95% CI：0.48–0.88；FDR = 0.048，图5C）。然而，开始使用OCP的较晚年龄与OA风险降低有关（IVW OR：0.88，95% CI：0.82–0.95；FDR = 0.009，图5D）。有趣的是，双侧卵巢切除术与OA风险降低相关（IVW OR：0.93，95% CI：0.89–0.98；FDR = 0.052，图5E）。鉴于FDR值的临界性和效应方向的意外性，这种关联应被视为假设生成性的，需谨慎解释。相应的散点图显示在图6A–E中。对于所有其他测试的暴露-结果对，在FDR校正后未观察到显著关联（表1）。由于最后一次使用OCP的年龄、开始使用OCP的年龄和双侧卵巢切除术使用的SNP数量较少，相应的效应估计可能不够精确，应视为支持性结果。

**敏感性分析**
敏感性分析显示，包括绝经年龄与OA在内的几种暴露-结果关系存在显著的异质性（Cochran’s Q P < 0.05，图2）。MR-Egger截距测试未发现显著的方向性多效性，除了开始HRT的年龄与骨质疏松症（P = 0.026，图2）。MR-PRESSO在关键关联中识别出有影响力的异常值，例如初潮年龄与全身骨密度（Global P = 0.039）以及最后一次使用OCP的年龄与45–60岁年龄组的全身BMD（Global P = 0.045）（表3）。替代方法（加权中位数、MR-Egger）得出的结果与IVW的结果方向一致，例如首次生育年龄与骨质疏松症（所有方法P < 0.05），而初潮年龄与OA的方向在不同方法中保持一致。Steiger测试确认了所有显著关联的正确方向，除了4对暴露-结果对（表4）。

**排除异常值后的重新分析**
我们在排除这些异常值后重新分析了数据。四种MR方法的结果总结在补充表4中。生殖周期因素的森林图显示在补充图1A–H中。值得注意的是，对于45–60岁年龄组中绝经年龄与BMD的关联，FDR p值从去除异常值前的0.057降至去除后的0.004（补充图1H）。生殖历史和激素干预的森林图显示在补充图2A–F中。对于曾经使用HRT与45–60岁年龄组的全身BMD的关联，FDR p值从去除异常值前的0.994降至去除后的0.004（补充图2F）。

**排除MR-PRESSO识别的异常值后**
在排除MR-PRESSO识别的异常值后（补充表5），某些关联中仍然存在异质性，例如初潮年龄与全身BMD（Cochran’s Q P < 0.001；补充表6），但不同MR方法（IVW、加权中位数、MR-Egger）的估计方向和显著性一致。重要的是，MR-Egger截距测试未检测到任何报告关联的显著方向性多效性（补充表6），MR-PRESSO全局测试也未在报告的关联中识别出额外的异常值（所有P > 0.05；补充表7）。这一结论还得到了相应散点图（补充图3A–H；补充图4A–F）和漏斗图（补充图5A–H和6A–F）中观察到的整体对称性的支持，表明主要的IVW估计不太可能受到方向性多效性效应的偏倚。留一法分析确认没有单个SNP不成比例地驱动任何显著关联（补充图7A–H和8A–F）。最后，Steiger方向性检验支持了所有报告显著发现的假设方向（从暴露到结果），除了一个被排除在主要结果之外的对。总体而言，这些敏感性分析支持了我们主要发现的总体稳健性。我们的研究发现表明，遗传预测的初潮年龄较晚与较高的骨质疏松风险和较低的骨密度（BMD）相关，这一结果与观察性研究以及最近一项针对东亚人群的磁共振（MR）研究的结论一致，并进一步加强了这些结论。不同研究设计和人群之间的这种一致性凸显了内源性雌激素暴露总时间对于达到和维持峰值骨量（BMD）的重要性。初潮年龄较晚对骨密度和骨质疏松风险的保护作用也与雌激素延缓骨转换速度的机制相符。雌激素通过RANKL/OPG信号通路抑制破骨细胞的分化和活性，并可能促进成骨细胞的功能，从而维持有利于骨形成的平衡。此外，该研究还表明激素替代疗法（HRT）在45至60岁年龄段对骨密度具有保护作用，这与雌激素替代疗法在预防绝经后骨丢失方面的已知治疗效果一致。有趣的是，我们发现最后一次使用口服避孕药（OCPs）的年龄较晚与45至60岁年龄段的较低骨密度相关。关于OCP使用与骨骼健康的关系存在争议，一些研究表明其影响是中性的或有益的，尤其是现代配方。这一结果可能反映了OCP使用时间、剂量以及个体内分泌环境之间的复杂相互作用，需要进一步研究。例如，某些孕激素（尤其是早期配方）可能具有轻微的雄激素效应，而第四代孕激素如drospirenone则具有抗雄激素特性。鉴于雄激素也会影响骨量，我们推测45至60岁年龄段个体骨密度下降可能与他们历史上使用含早期孕激素的OCPs有关。除了骨质疏松和骨密度的发现外，我们还观察到初产年龄及最后一次生育年龄较晚对骨关节炎（OA）具有保护作用。激素因素在OA中的作用很复杂，雌激素可能通过多种途径影响软骨细胞功能。此外，双侧卵巢切除术与较低的OA风险之间存在边缘相关性，但由于效应量较小且接近显著性阈值，这一发现需谨慎解读。我们的研究对骨质疏松和OA的风险分层、预防和管理具有重要意义。首先，如初潮年龄较晚（≥16岁）和绝经年龄较早（<45岁）等生殖特征可作为识别高风险女性的重要指标，这些女性可能受益于更早的骨密度筛查；将这些因素纳入现有的风险评估工具（如frax）可以提高骨质疏松预测的准确性。对于OA，生殖史有助于识别易感个体，从而在关节结构受损前进行针对性生活方式或治疗干预。我们的结果支持个性化激素干预方案，尤其是对于绝经早期的女性（45至60岁），尤其是那些生育寿命较短的女性，以减缓骨丢失速度。对于OCP使用者，长期使用或延迟停药可能对中年骨密度产生不利影响，因此需要考虑替代避孕策略或额外的骨骼保护措施。从公共卫生的角度来看，这些发现强调了更新临床指南和提升公众意识的必要性。应将生殖里程碑纳入骨质疏松和OA的管理建议中，以强调其对骨骼健康的终身影响。政策制定者和研究人员应优先考虑在不同人群中开展研究，以确保结论的普遍适用性，并探究激素调节的OA治疗方法。我们的研究主要优势包括使用磁共振设计来减少混杂因素和逆向因果关系，以及利用大规模全基因组关联研究（GWAS）的总结数据，这提供了强大的统计功效。然而，该研究也存在一些局限性：GWAS数据主要来自欧洲血统个体，可能限制了我们的发现在其他人群中的普遍性；尽管广泛的敏感性分析未检测到主要发现的显著多效性，但MR框架固有的残余或多效性无法完全排除；我们的分析基于总结级数据，无法进行分层分析（如按BMI或其他生活方式因素）；英国生物银行（UK Biobank）的暴露数据与某些结果GWAS之间存在部分样本重叠（尤其是OA，21.69%），而骨密度的重叠极小（2.76%），骨质疏松数据则没有重叠。未来的研究应在多样化的血统人群中复制这些发现，并通过多变量MR分析来阐明相关生殖特征的作用机制。

总之，这项研究提供了遗传学证据，支持女性生殖和激素因素与骨骼结果之间的关联。雌激素相关的生殖因素与骨密度和骨质疏松具有相对一致的保护作用，而与OA的关联则更为复杂且不太明确，反映了骨骼重塑和关节退化背后的不同生物学机制。较长的生殖寿命（表现为初潮较早和绝经较晚）与更良好的骨骼结果相关。双侧卵巢切除术与较低的OA风险之间存在意外关联，需要进一步机制研究。相比之下，包括某些与生育次数相关的特征和某些激素与骨折的关联，在校正后并未显示出显著效果，表明并非所有生殖或激素因素都会对骨骼结果产生可测量的影响，这为未来的机制研究和临床风险分层提供了指导。由较少遗传工具支持或接近统计阈值的发现（如双侧卵巢切除术与OA的关联以及最后一次使用OCP的年龄与中年骨密度的关联）应谨慎解读。总体而言，这些结果有助于改进未来的风险分层和假设生成；然而，将其直接应用于临床实践仍需进一步验证。此外，激素暴露的时间点（包括激素替代疗法的开始和停止）可能是决定骨骼结果的关键因素，需要进一步研究。

伦理批准和知情同意：本研究使用了来自大规模全基因组关联研究（GWAS）的公开可用总结级数据，相关研究已获得其机构审查委员会的伦理批准。由于这项研究是对匿名、公开数据的二次分析，因此根据《中华人民共和国国家卫生健康委员会2023年2月发布的《涉及人类受试者的生命科学和医学研究的伦理审查措施》第32条（第1和2项），无需额外伦理批准。

作者贡献：所有作者都对报告的工作做出了重要贡献，无论是在概念构思、研究设计、数据采集、分析解读还是所有这些方面；参与了文章的起草、修订或批判性审查；同意最终发布的版本；并同意对文章的各个方面负责。

数据共享声明：本研究中使用的总结级数据是公开可用的。暴露和结果数据来自IEU OpenGWAS项目数据库（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）、FinnGen联盟（https://www.finngen.fi/en）和GWAS Catalog（https://www.ebi.ac.uk/gwas/）。每种特征的具体GWAS总结统计信息及其访问ID详见补充表1。