Microsporidia中的真菌相关氨基酸转运蛋白CpAAT9的动态表面暴露

《Animals and Zoonoses》：Dynamic surface exposure of the fungal-affiliated putative amino acid transporter CpAAT9 in Cryptosporidium parvum

　　陈新新|王晨晨|张颖|周腾|李敏|尹吉刚|朱贯
中国吉林省长春市吉林大学兽医学院人畜共患病研究所、教育部人畜共患病重点实验室、重症人畜共患病诊断与治疗国家重点实验室，邮编130062

**摘要**
微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是一种专性细胞内寄生虫，其代谢能力极低，严重依赖宿主提供的营养物质。因此，膜转运蛋白在寄生虫的生存和发育过程中起着关键作用。然而，微小隐孢子虫中的氨基酸转运系统目前尚不十分清楚。在本研究中，我们重点关注了CpAAT9（cgd8_3740）这种氨基酸转运蛋白，它在大多数其他顶复门（apicomplexan）寄生虫中缺乏可识别的同源物，反而与一类与真菌同源物相关的真核生物转运蛋白家族具有进化亲缘关系。系统发育分析表明，类似AAT9的转运蛋白代表了一个古老的真核生物谱系，在顶复门（Apicomplexa）中的微小隐孢子虫中得到了选择性的保留。通过亲和纯化多克隆抗体，我们利用间接免疫荧光实验检测了CpAAT9在多个发育阶段的表达和亚细胞分布情况。CpAAT9在整个寄生虫生命周期中都存在。在孢子虫中，CpAAT9主要定位于寄生虫的质膜上，并在囊壁下呈现不规则的点状分布。非透膜染色显示，在孢子虫出囊后CpAAT9有大量暴露在表面；在孢子虫滑行运动过程中，这种蛋白会沿着滑行轨迹释放出来。在细胞内发育阶段，CpAAT9仍然可以被检测到，并且部分与面向肠道腔道的寄生泡膜（PVM）的标记物共定位。相比之下，在有性生殖过程中，其表面暴露程度有所降低。这些发现表明，CpAAT9是一种能够动态重新分布、脱落或分泌的膜转运蛋白。这种特殊的定位模式提示它可能参与了从肠道腔道中获取营养物质的过程，或者与肠道黏液的相互作用。本研究为微小隐孢子虫的转运蛋白生物学提供了新的见解，并将CpAAT9确定为未来功能研究的潜在靶点。

**引言**
微小隐孢子虫是一种全球分布的肠道原生动物寄生虫，可感染多种脊椎动物宿主，包括人类和家畜，是全球腹泻性疾病的主要原因之一。其感染可导致严重的持续性腹泻，尤其是在幼儿和免疫功能低下者中。尽管该寄生虫具有全球重要性，但目前的治疗方法仍然有限。硝唑沙星（nitazoxanide）是目前唯一被批准用于治疗免疫功能正常个体的隐孢子虫病的药物，而对于婴幼儿和免疫缺陷患者仍缺乏有效的治疗方案。微小隐孢子虫生物学的一个显著特征是其高度简化的代谢途径，许多代谢途径和细胞器功能已经丧失。例如，它缺乏典型的线粒体和顶质体，许多氨基酸、核苷酸和脂质的生物合成途径也不存在。因此，这种寄生虫在整个生命周期中严重依赖宿主提供的营养物质。为弥补这些代谢缺陷，微小隐孢子虫拥有一系列转运蛋白，帮助其从宿主环境中吸收必需的代谢物。然而，目前仅有少数转运蛋白得到了实验研究，例如葡萄糖转运蛋白CpGT1和CpGT2，它们被定位在寄生虫与宿主界面的摄食细胞器中。这些发现突显了转运蛋白在营养获取和寄生虫发育中的关键作用。

微小隐孢子虫的基因组编码了10种潜在的氨基酸转运蛋白（CpAATs），但其中没有任何一种得到了实验研究。为了填补这一知识空白，我们选择了CpAAT9（cgd8_3740）作为研究对象，因为它在大多数其他顶复门寄生虫中缺乏可识别的同源物，反而与真菌的液泡氨基酸转运蛋白Avt6具有进化亲缘关系。通过免疫染色实验，我们发现CpAAT9在寄生虫发育过程中会发生动态重新分布：在孢子虫中，它主要位于囊壁上并在滑行运动过程中脱落；在细胞内发育阶段，它主要定位于寄生泡膜（PVM）上，而非寄生虫与宿主细胞的交界处。用去垢剂处理后，囊壁和PVM上的CpAAT9信号可以被显著去除。这些发现表明，CpAAT9可能参与了从肠道腔道中获取营养物质的过程，或者与肠道黏液的相互作用。

**材料与方法**
**伦理声明**：所有动物实验均符合中国卫生部的《实验动物 cuidado e uso guía》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）规定，并获得了吉林大学动物福利与研究伦理委员会的批准（AUP #2020-IZ-20, AUP #2024-IZ-00030）。
**生物信息学和系统发育分析**：通过访问CryptoDB（https://cryptodb.org）和TransportDB（https://www.membranetransport.org/）上的注释基因组，并结合微小隐孢子虫原始基因组测序及后续重测序研究中的转运蛋白注释信息，鉴定出微小隐孢子虫中的潜在氨基酸转运蛋白（AATs）。根据它们的染色体位置，将这10种转运蛋白命名为CpAAT1–CpAAT10（表1）。

**表1. 微小隐孢子虫中的潜在氨基酸转运蛋白列表**
| 基因ID | CpATCC基因ID | GenBank编号 | 建议名称 | TMD* | CryptoDB基因产物描述 |
| --- | ------------ | ---------------- | --------- | -------------- | -------------- |
| cgd3_470 | CPATCC_0031 | 350XP_6266 | 32 | CpAAT1 | 跨膜氨基酸转运蛋白 |
| cgd3_4350 | CPATCC_0035 | 370XP_6269 | 77 | CpAAT2 | 氨基酸转运蛋白 |
| cgd4_2770 | CPATCC_0019 | 880XP_6258 | 62 | CpAAT3 | 氨基酸转运蛋白 |
| cgd4_4450 | CPATCC_0021 | 710XP_6254 | 59 | CpAAT4 | 跨膜氨基酸转运蛋白 |
| cgd5_1630 | CPATCC_0023 | 420XP_6261 | 09 | CpAAT5 | 氨基酸转运蛋白 |
| cgd7_4800 | CPATCC_0010 | 700XP_6286 | 27 | CpAAT6 | 氨基酸转运蛋白 |
| cgd8_80 | CPATCC_0000 | 080XP_6254 | 72 | CpAAT7 | 跨膜氨基酸转运蛋白 |
| cgd8_1170 | CPATCC_0001 | 220XP_6270 | 24 | CpAAT8 | 类氨基酸渗透酶的整合膜蛋白 |
| cgd8_3740 | CPATCC_0003 | 970XP_6272 | 66 | CpAAT9 | Yer119cp样氨基酸转运蛋白 |
| cgd8_3890 | CPATCC_0004 | 110XP_6272 | 81 | CpAAT10 | 信号肽 |

**研究方法**
本研究聚焦于CpAAT9（基因ID：cgd8_3740），它在CryptoDB中被注释为“Yer119cp样氨基酸转运蛋白”。为了探索其进化关系，我们使用CpAAT9的氨基酸序列在NCBI RefSeq蛋白数据库中进行BLASTP搜索，E值截止值为1×10^-5。通过InterProScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）和NCBI保守结构域数据库（CDD）预测了CpAAT9的蛋白质结构域。选择来自主要真核生物谱系的代表性同源物进行系统发育分析，并使用T-Coffee软件进行了多序列比对，随后手动检查并修剪了比对结果中的不确定性区域。最终比对包含48个分类单元和279个信息性氨基酸位点。采用IQ-TREE（v1.6.12）软件和ModelFinder实现了最大似然系统发育重建，分支支持值通过1000次SH-aLRT重复实验和100次超快速自举重复实验估计得出。基于贝叶斯信息准则（Bayesian Information Criterion）选择了最佳替代模型（LG+F+G4）。系统发育树使用FigTree v1.4.4软件可视化，并在Adobe Illustrator中进行进一步注释。

**抗体制备和亲和纯化**：从CryptoDB获取CpAAT9的氨基酸序列。首先使用SWISS-MODEL服务器进行同源性建模，预测蛋白质的三维结构，并通过B细胞表位预测算法分析预测的跨膜螺旋之间的环区以评估潜在的抗原性。针对CpAAT9的肽序列进行了BLAST搜索，以减少潜在的交叉反应性。选择位于第八和第九跨膜结构域之间胞质环中的残基356–370（EDAEGSSTKDRHLLR）所对应的肽段作为抗原。该肽段由中国Peptides公司（上海）合成，并按标准程序与钥孔帽贝血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin）结合，用于兔免疫。兔按照标准免疫方案接受了多次加强注射。最后一次加强注射后至少7天收集血清样本，并在-80°C下保存直至使用。抗体的亲和纯化按照常规方法进行。

**寄生虫来源和卵囊制备**：本研究中使用的微小隐孢子虫株属于gp60位点的IIaA17G2R1亚型。卵囊在犊牛体内繁殖，并使用标准蔗糖梯度离心法从粪便样本中纯化。纯化的卵囊在含青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的磷酸盐缓冲液（PBS）中4°C保存备用。实验前，将卵囊在0.2%次氯酸钠（Sigma-Aldrich）中冰浴5分钟进行表面杀菌，随后用无菌PBS清洗五次。只有卵囊出囊效率超过80%的样本才用于后续实验。

**寄生虫发育阶段的制备**：为了获得从破裂卵囊中释放的孢子虫，将纯化的卵囊悬浮在4%甲醛（Quanrui Reagent，济南）中，并在液氮和冰之间进行五次冻融循环，之后进一步固定30分钟。通过将卵囊置于含有0.5%牛胆酸（Sigma-Aldrich）的RPMI-1640培养基（Procell，湖北）中37°C培养45分钟来诱导出囊。释放的孢子虫经过离心收集，并用4%甲醛固定30分钟。在滑行运动实验中，将出囊后的孢子虫洗涤一次后置于涂有聚L-赖氨酸（Solarbio Life Sciences，北京）的玻璃载玻片上，在37°C下滑行30分钟后再进行固定。

**入侵和细胞内发育实验**：微小隐孢子虫在HCT-8细胞（人回结肠腺癌细胞系；ATCC CCL-244）中培养，如前所述。细胞在含10%胎牛血清（Biological Industries，Beit HaEmek，以色列）的RPMI-1640培养基中37°C、5% CO2环境下培养至约80%汇合度。通过在感染后15分钟间隔向单层细胞中添加出囊孢子虫两次来制备入侵阶段的样本，然后固定30分钟。在细胞内发育实验中，将卵囊加入到含有0.15%牛胆酸的RPMI-1640培养基中的HCT-8单层细胞中培养3小时以诱导出囊和入侵。接种后，通过更换培养基去除未出囊或未入侵的寄生虫，继续在完整培养基中培养样本。感染后6小时、12小时和72小时收集样本，并用4%甲醛固定30分钟。

**Western blot分析**：将出囊孢子虫溶解在含有1% EDTA和蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀缓冲液中（Thermo Fisher Scientific，美国）。为确保完全裂解，样品经过五次冻融循环处理。蛋白质样品与SDS上样缓冲液混合后，60°C加热10分钟，随后通过SDS-PAGE分离。膜在5%脱脂乳的TBST中室温下封闭1小时，然后与未稀释的亲和纯化抗CpAAT9抗体或预免疫血清（按照相同程序处理）孵育2小时。在抗原中和实验中，抗体溶液预先与100 μg免疫肽孵育1小时后再用于检测膜。

**间接免疫荧光（IFA）实验**：不同发育阶段的固定样品用0.2% Triton X-100在PBS中透膜5分钟。对于非透膜样本省略了透膜步骤。所有后续处理步骤对透膜和非透膜样本均相同。样品在PBS中的5%脱脂乳中封闭30分钟后，与亲和纯化的抗CpAAT9抗体或预免疫血清（按照相同程序处理）孵育1小时。洗涤后，样品与Alexa Fluor 488或594标记的兔抗IgG二级抗体（Invitrogen，美国）孵育1小时。对于选定的实验，使用自制抗体标记孢子虫表面蛋白进行对照；宿主细胞F-肌动蛋白用罗丹明标记的phalloidin（Solarbio Life Sciences，北京）显示；寄生泡膜（PVM）用荧光素标记的Vicia villosa lectin（VVL，1:1000稀释）标记。细胞核用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；1 μg/mL）染色30分钟，洗涤后使用Antifade mounting medium（Beyotime，上海）固定。荧光图像使用Olympus BX53荧光显微镜和适当的滤光片组拍摄。

**其他实验步骤**：所有样品在相同的实验条件下进行处理，并使用UVP ChemStudio成像系统（Analytik Jena，美国）进行可视化。荧光定量分析是在原始的TIFF图像上进行的，并以相对荧光单位（RFU）报告。为了便于展示，成对的图像经过了标准化的线性对比度拉伸处理，以固定动态范围，确保视觉上的公平比较。对于同时被VVL和CpAAT9标记的图像，使用Fiji（ImageJ）v1.54p中的Coloc 2插件对阈值信号进行了共定位分析。报告了皮尔逊R值和曼德斯共定位系数值以及科斯特斯P值。

**统计分析**
定量数据使用GraphPad Prism v10（GraphPad Software，美国马萨诸塞州波士顿）进行分析。通过Welch的t检验来确定透化和非透化孢子之间的统计显著性。对于共定位，曼德斯系数表示为[平均值 ± 标准误]。

**结果**
CpAAT9是一种与真菌相关的膜转运蛋白，其同源基因仅存在于Apicomplexa门下的Cryptosporidium谱系中。对Cryptosporidium parvum基因组的搜索发现了十个预测的氨基酸转运蛋白（AAT）基因（表1）。由于尚未为Cryptosporidium AATs建立系统命名法，这些蛋白质根据它们的染色体位置被命名为CpAAT1–CpAAT10。在这些候选基因中，CpAAT9（cgd8_3740）因其独特的进化分布而受到特别关注。CpAAT9编码一个含有11个跨膜结构域的457个氨基酸的蛋白质，这与典型的膜转运蛋白一致（图1A）。使用InterPro和NCBI保守结构域数据库进行结构域分析，发现了一个保守的AAT（Aa_trans）结构域，表明CpAAT9属于AAT超家族（图1B）。

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**图1. CpAAT9的生物信息学特性。**
(A) CpAAT9（cgd8_3740）的预测跨膜拓扑结构，显示了11个跨膜结构域的位置以及用于抗体生成的肽区域（残基356–370）。
(B) CpAAT9的结构域架构，显示了由InterPro和NCBI保守结构域数据库分析确定的保守氨基酸转运结构域（Aa_trans）。
(C) 使用CpAAT9对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和智人（Homo sapiens）参考蛋白质组进行的BLASTP分析。最接近的同源基因被突出显示，显示出与酵母氨基酸转运蛋白的相似性大于与人类同源基因的相似性。

**BLASTP搜索**
使用CpAAT9作为查询，在NCBI RefSeq蛋白质数据库中进行搜索，检索到了来自多种真核生物谱系的2000多个同源序列（表S1）。正如预期的那样，最接近的匹配结果是来自其他Cryptosporidium物种的同源基因。在属外，同源序列主要在真菌中被检测到，这些真菌占据了高分值的多数。此外，在几个原生生物谱系中也发现了额外的同源基因，包括Chromera velia和Vitrella brassicaformis、Perkinsus marinus以及丝状体门和鞭毛藻门的代表。在其他顶复门谱系中没有发现同源基因。

**当搜索限制在出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）和人类（Homo sapiens）上时，**分别代表了一种模型真菌物种和宿主，CpAAT9检索到了13个匹配结果。同样，三个酵母同源基因的相似性最高（E值介于2e?27到3e?22之间），而10个人类序列的相似性较低（E值介于3e?12到0.016之间）（图1C）。CpAAT9与代表性的酵母和人类同源基因之间的多序列比对显示了一些保守区域和16个完全保守的氨基酸残基（图S2）。

**系统发育分析**
使用代表性的真核生物同源基因进行的系统发育分析进一步明确了CpAAT9的进化位置（图2）。最大似然树大致分成了两个主要分支，分别对应于真菌和原生生物序列。所有的Cryptosporidium序列形成了一个得到良好支持的單系群，进一步分为两个姐妹分支，分别对应于AAT7和AAT9转运蛋白家族。这些结果表明，这两个转运蛋白谱系很可能起源于一个早于Cryptosporidium属内多样化的祖先复制事件。

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**图2. CpAAT9及相关氨基酸转运蛋白的系统发育分析。** 使用IQ-TREE和LG+F+G4替换模型，从代表性真核生物序列重建的AAT9类似转运蛋白的最大似然系统发育树。该树是根据包含279个保守氨基酸位置的对齐结果推断出的。分支支持值以SH-aLRT（%）/超快速自举（%）表示。Cryptosporidium序列形成了一个得到良好支持的單系群，进一步分为两个姐妹分支，分别对应于AAT7和AAT9家族。Chromerid和鞭毛藻序列分支位于Cryptosporidium分支的基部或附近，而真菌序列形成了一个独立的分支。比例尺表示每个位置的替换次数。

**CpAAT9在孢子中的表面暴露**
为了研究CpAAT9的表达和定位，针对位于第八和第九个跨膜结构域之间的预测细胞质环中的残基356–370（EDAEGSSTKDRHLLR）制备了多克隆抗体。通过使用裂解的C. parvum孢子液进行Western blot分析来评估亲和纯化抗体的特异性。检测到了一条大约50 kDa的单一条带（图3A），这与CpAAT9的预测分子量一致。将抗体与免疫肽预孵育会消除这一信号，证实了抗体-抗原相互作用的特异性。此外，作为对照，经过相同亲和纯化处理的预免疫血清没有产生IFA信号（图S3）。

**图3. 抗CpAAT9抗体的验证及其在孢子中的定位。**
(A) 使用未稀释的亲和纯化抗CpAAT9抗体（0.5 mL/印迹）对C. parvum孢子裂解液进行Western blot分析。一条大约50 kDa的单一条带对应于CpAAT9的预测分子量。将抗体与免疫肽预孵育（100 μg/印迹，1小时）会消除信号，证实了抗体的特异性。
(B) 间接免疫荧光测定（IFA）显示CpAAT9在透化的裂解孢子中的定位。CpAAT9表现为寄生虫膜下的不规则颗粒状信号。与膜标记物的共染色显示了均匀的膜标记，不同于CpAAT9的不均匀分布。DIC，差异干涉显微镜。

**间接免疫荧光测定（IFA）**显示抗体能够识别寄生虫内的CpAAT9。使用包括透化步骤的标准IFA程序，CpAAT9在裂解孢子的膜下显示出不规则的颗粒状分布（图3B）。这与检测中使用的膜标记物的均匀染色模式不同。由于这种分布模式对于膜转运蛋白来说是不寻常的，我们怀疑CpAAT9可能定位在质膜或孢子表面，这可能使其在透化过程中容易受到去污剂的提取，即使在甲醛固定之后也是如此。然后，我们比较了在不同透化条件下CpAAT9的分布。在裂解的孢子中，透化样本再次显示出不规则的颗粒状信号，分布在质膜下方（图4A）。相比之下，非透化孢子在寄生虫表面显示出更强且更连续的荧光信号（图4B）。定量分析显示，非透化孢子的相对荧光强度是透化样本的4.5倍（P < 0.0001，双尾Welch t检验；图4C）。

**图4. 透化和非透化条件下孢子中CpAAT9的定位。**
(A–B) 比较透化（A）和非透化（B）条件下裂解孢子中CpAAT9的分布。非透化孢子显示出更强的表面信号，表明CpAAT9在裂解后暴露于外部。
(C) 以相对荧光单位（RFU）报告的CpAAT9荧光强度的定量分析显示，非透化孢子发出的信号是透化样本的4.46倍（P < 0.0001，Welch t检验；n = 25）。
(D–E) 在透化（D）和非透化（E）条件下从机械破坏的卵囊中释放的孢子中定位CpAAT9。两种条件下的信号模式和强度相似，表明CpAAT9的表面暴露与裂解过程相关，而不是简单的机械释放。核用DAPI进行复染。DIC，差异干涉显微镜。

然而，抗体识别的表位位于CpAAT9的预测细胞质结构域内，理论上在非透化孢子中抗体无法到达该位置。这种差异提出了两种可能性：要么是拓扑预测不准确，CpAAT9的表位自然暴露于表面；要么是大量蛋白质被转运到孢子表面。这两种情况都支持CpAAT9在裂解孢子中表面暴露的结论。

**为了确定这种表面暴露是否与裂解过程特定相关，**还检查了从机械破坏的卵囊中释放的孢子。在这些样本中，透化和非透化的寄生虫显示出相似的颗粒状染色模式和相当的信号强度（图4D–E）。这些结果表明，CpAAT9的表面暴露与裂解过程相关，而不是孢子的简单机械释放。

**CpAAT9也在裂解过程中释放的残余体中被检测到**（图5A）。在这些结构中，非透化样本显示出的荧光信号比透化样本更强，表明CpAAT9存在于残余体的外表面。然而，在破裂的卵囊中未观察到CpAAT9与残余体的关联，这表明该蛋白质是在裂解过程中从孢子中释放的。

**此外，从观察裂解寄生虫的滑动运动中也获得了CpAAT9表面暴露和释放的额外证据。**在滑动测定中，不仅在寄生虫上检测到CpAAT9信号，还在运动孢子留下的滑动轨迹上检测到CpAAT9信号（图5B）。与泛Cryptosporidium抗体（Pan-Cp）共染色可以观察到这些轨迹包含寄生虫衍生的物质。核用DAPI进行复染。DIC，差异干涉显微镜。

这些观察结果表明，CpAAT9在孢子激活过程中发生了动态重新分布，包括表面暴露和在滑动运动过程中的部分释放。

**CpAAT9主要分布在无性发育阶段的寄生虫吞噬vacuole（PVM）上**

**在HCT-8细胞中C. parvum的细胞内发育过程中进一步检查了CpAAT9的分布。**在寄生虫侵入期间，CpAAT9在转变为滋养体的孢子中仍然可检测到，并保持颗粒状分布，在寄生虫表面下方（图6）。没有信号在寄生虫-宿主细胞界面富集，这与仅在界面出现的两种糖转运蛋白不同。

**在无性发育（裂殖）期间，**CpAAT9从滋养体一直可检测到，穿过未成熟和成熟的裂殖体。在透化样本中，CpAAT9主要表现为寄生虫表面下弱的颗粒状信号（图7A；图8）。增加曝光时间后，信号变得更强，证实了该蛋白质在整个裂殖过程中持续存在。

**在透化和非透化条件下CpAAT9的分布。**
(A) 透化样本在标准曝光条件下显示出发育中的裂殖体内的弱颗粒状CpAAT9信号。增加曝光时间后，信号变得更强，表明蛋白质在整个裂殖过程中持续存在。
(B) 非透化样本在两种曝光水平下的裂殖体中显示出更强的CpAAT9信号，表明在无性发育过程中有相当部分的CpAAT9暴露于外部。核用DAPI进行复染。DIC，差异干涉显微镜。

**在非透化样本中，CpAAT9信号通常更强，偶尔呈现为半圆形图案（图7B；图9），进一步支持了表面暴露的观点。**为了直接测试CpAAT9是否定位在寄生虫吞噬vacuole（PVM）上，使用Vicia villosa凝集素（VVL）作为PVM的标记进行了共定位实验。CpAAT9信号与VVL染色在发育中的裂殖体中有明显的重叠（图10A），支持该蛋白质在细胞内发育期间定位在PVM上或附近。定量共定位分析（n = 25）确认了CpAAT9和VVL信号之间的强烈空间重叠（图10B）。这得到了高皮尔逊相关系数（R = 0.708 ± 0.029，平均值 ± 标准误）和显著的曼德斯阈值系数（tM1 [VVL over CpAAT9] = 0.950 ± 0.021；tM2 [CpAAT9 over VVL] = 0.925 ± 0.013）的支持。这种共定位的统计显著性通过Costes P值（0.996 ± 0.003）得到了验证。下载：下载高分辨率图片（605KB）下载：下载全尺寸图片

图9. 非渗透状态无性生殖阶段的CpAAT9分布。IFA图像显示在非渗透条件下CpAAT9在裂殖过程中的定位。与渗透样本相比，CpAAT9信号更强，偶尔会在寄生虫边界形成半圆形图案。寄生虫用泛隐孢子虫抗体（Pan-Cp）进行共染色，细胞核用DAPI染色。DIC（差分干涉显微镜）。

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图10. CpAAT9与寄生体食 vacuole 膜（PVM）的共定位。（A）IFA图像显示发育中的裂殖体中CpAAT9与PVM的共定位。样本用Vicia villosa凝集素（VVL）进行共染色，VVL可以标记PVM。CpAAT9和VVL信号之间的强烈重叠表明CpAAT9与PVM相关。细胞核用DAPI进行复染。DIC（差分干涉显微镜）。（B）使用Coloc 2 plusin在Fiji（ImageJ）中对阈值信号进行定量共定位分析，结果显示CpAAT9和VVL信号之间有强烈的重叠（Pearson’s R平均值=0.708，Manders系数tM1和tM2分别为0.950和0.925）。这种共定位在统计学上是显著的（Costes P值的平均值为0.996；n=25）。

相比之下，在有性生殖阶段（大配子囊和小配子囊），CpAAT9信号主要在渗透条件下被检测到，而在非渗透样本中几乎不存在（图11）。这些观察结果表明，在C. parvum的有性生殖阶段，CpAAT9的表面暴露减少或消失，这表明该蛋白的活性降低并且主要局限于细胞内部。

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图11. 有性生殖过程中的CpAAT9分布。IFA图像显示大配子囊（）和小配子囊（）中的CpAAT9定位。在渗透条件下，CpAAT9表现为靠近寄生虫表面的颗粒状信号。而在非渗透样本中几乎没有信号，表明在有性生殖阶段CpAAT9没有外部暴露。细胞核（Nuc）用DAPI染色。DIC（差分干涉显微镜）。

讨论

对于那些代谢能力有限且严重依赖宿主来源营养物质的细胞内寄生虫来说，氨基酸转运至关重要。在Cryptosporidium parvum中，基因组的缩减消除了许多生物合成途径，使得膜转运系统对于寄生虫的生存和发育尤为重要。在这项研究中，我们表征了CpAAT9——这是一种预测存在于C. parvum中的转运蛋白，并研究了其在多个发育阶段的进化关系和亚细胞分布。我们的发现表明，CpAAT9属于一个进化上保守的转运蛋白家族，与真菌同源物有很强的关联，并表现出动态的定位模式，包括在寄生虫发育过程中的表面暴露以及从运动型寄生虫上的释放。

系统发育和BLAST分析表明，CpAAT9属于一个广泛分布的真核生物转运蛋白家族，但在顶复门寄生虫中的分类学分布较为特殊。同源蛋白在真菌和几种原生生物谱系中很常见，但在其他顶复门寄生虫中似乎不存在。在Cryptosporidium中，AAT9形成了一个与AAT7家族密切相关的独特分支，这表明这两种转运蛋白谱系可能起源于该属分化之前的一个祖先复制事件。CpAAT9与真菌同源物的强烈亲和力尤为显著，可能反映了这一转运蛋白谱系的古老保守性或在其他顶复门寄生虫中的差异性基因丢失。无论具体的进化机制如何，AAT9类转运蛋白在顶复门寄生虫中的有限分布表明，Cryptosporidium可能保留了与其他成员不同的营养获取策略。

本研究的一个意外发现是CpAAT9在寄生虫激活和发育过程中的动态重新分布。在孢子虫中，CpAAT9最初表现为寄生虫内的颗粒状信号，但在出囊后显著暴露于寄生虫表面。该蛋白也在残留体和运动型孢子虫产生的滑行轨迹中被检测到。这些观察结果表明，CpAAT9在寄生虫激活的早期阶段会经历表面暴露和部分释放。虽然膜转运蛋白通常被认为是参与溶质转运的膜整合蛋白，但越来越多的证据表明某些转运蛋白还可以参与其他细胞过程，包括膜重塑和蛋白释放。对于CpAAT9来说，在出囊和滑行运动过程中的表面暴露可能反映了与寄生虫激活和宿主细胞侵袭相关的动态膜重组。

在细胞内发育过程中，CpAAT9在整个裂殖过程中均可检测到。非渗透染色显示，在无性生殖阶段，大量该蛋白会暴露于外部，而使用VVL凝集素的共定位实验表明CpAAT9与PVM相关。由于Cryptosporidium缺乏许多生物合成途径，位于PVM处的转运蛋白也可能在清除肠道腔内的营养物质或微生物代谢物中发挥作用。这与之前报道的两种位于喂养器细胞器上的糖转运蛋白不同，后者负责从宿主细胞质中转运营养物质，支持了寄生虫多样化的营养获取策略。这也与其酵母同源物Avt6（一种液泡氨基酸输出蛋白）不同，暗示CpAAT9在进化过程中发生了功能转变，采用了在营养获取方面的作用，而不是从储存细胞器中排出细胞内氨基酸。

与无性生殖阶段不同，在有性生殖阶段，CpAAT9几乎没有表面暴露，非渗透处理的配子囊中未检测到该蛋白的染色。这种阶段特异性差异表明，CpAAT9的作用可能主要在孢子虫激活和无性复制期间最为重要，此时寄生虫正在积极侵入宿主细胞并快速增殖。有性生殖阶段表面暴露的减少可能反映了膜组织的变化或代谢需求的变化。

CpAAT9的具体转运底物尚不清楚。然而，它与真菌氨基酸转运蛋白的进化关系表明它可能在摄取或重新分布对寄生虫生长至关重要的某些氨基酸方面发挥作用。此外，CpAAT9在孢子虫滑行运动过程中会被释放或排出，这一过程对于穿透肠黏膜层和穿越上皮以建立感染至关重要。因此，排出的CpAAT9可能会通过与黏液或其他细胞外基质分子的相互作用来调节宿主的反应。

总之，这些发现将CpAAT9确定为C. parvum中一种进化上独特的假设氨基酸转运蛋白，并揭示了其在寄生虫发育过程中动态表面暴露和释放或分泌的意外模式。CpAAT9在寄生虫表面和PVM上的定位表明，这种转运蛋白可能有助于从肠腔中获取营养物质。这与之前报道的两种从宿主细胞喂养器细胞器中转运营养物质的糖转运蛋白不同，支持了寄生虫多样化的营养获取策略。此外，运动型孢子虫释放CpAAT9表明它可能作为一种效应分子参与与宿主黏膜的相互作用。未来确定底物特异性和功能重要性将对于全面阐明CpAAT9的生物学作用至关重要。

最后，CpAAT9的表面可及性突显了其作为治疗或免疫学靶点的潜力。作为一种表面暴露的膜蛋白，CpAAT9可以直接被小分子抑制剂或中和抗体在细胞外环境中接触到，从而绕过了常常限制药物效果的膜通透性挑战。此外，它在孢子虫滑行运动的关键窗口期出现在表面，使其成为疫苗开发的理想候选对象，抗体结合可能阻断营养物质的转运或干扰寄生虫在宿主肠道界面中的移动能力。

结论

在这项研究中，我们表征了CpAAT9——一种在C. parvum中进化上独特的假设氨基酸转运蛋白，它与真菌同源物有很强的关联，并在顶复门寄生虫中保持独特存在。免疫荧光分析显示，CpAAT9在寄生虫发育过程中表现出动态定位，包括在出囊后的孢子虫表面的暴露、在滑行运动过程中的释放以及在细胞内生长过程中部分定位到PVM。这些发现表明，CpAAT9可能有助于营养物质的获取和膜动态的变化。由于膜转运蛋白可存在于寄生虫表面，CpAAT9也可能成为治疗或免疫干预的潜在靶点。

作者贡献声明：
Jigang Yin：监督、项目管理和资金获取。
Min Li：研究。
Teng Zhou：研究。
Ying Zhang：研究。
Chenchen Wang：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析。
Xinxin Chen：撰写——初稿、可视化、研究。
Guan Zhu：撰写——审稿与编辑、可视化、监督、项目管理和资金获取、方法学、正式分析、概念化。