通过宏基因组分析揭示了传统越南鱼酱发酵过程中微生物组的动态变化

《Applied Food Research》：Dynamic changes in microbiome during traditional Vietnamese fish sauce fermentation revealed by metagenomics analysis

　　Thi Thanh Thanh Vu | Vincento Valentino | Thi Huyen Tran | Ngoc Nam Trinh | Trung Hau Nguyen | Khanh Hoang Nguyen | Francesca De Filippis | Sao-Mai Dam
越南胡志明市工业大学生物技术及食品技术研究所，Nguyen Van Bao街12号，Hanh Thong区，邮编700000

**摘要**
“鱼露”是一种传统的越南鱼酱，通过鱼和盐的自然发酵制成。鱼酱的发酵过程受到酶和微生物群落共同作用驱动的复杂代谢活动的调控。我们对四个样本进行了宏基因组分析，以揭示特定微生物在蛋白质降解和风味生成中的作用。在分析的四个鱼酱样本中，Tetragenococcus halophilus是细菌群落中的优势物种。经过六个月的发酵后，Tetragenococcus halophilus的相对丰度增加，达到最高水平（66.07%）。通过对鱼酱样本（发酵1个月、3个月和6个月）中的蛋白酶进行分析，发现了来自Tetragenococcus、Staphylococcus和Bacillus物种的各种酶，包括prolidase和Xaa-Pro氨肽酶。这些酶促进了脯氨酸的释放，这对渗透平衡和风味形成至关重要。几种丰富的蛋白酶可能在高盐条件下有效降解蛋白质，释放出对细菌生长和风味发展至关重要的自由氨基酸。支持这一点的证据是，对Tetragenococcus halophilus的全基因组分析显示，该物种中存在大量与盐胁迫适应、可溶性物质合成、转运蛋白和氨基酸生物合成相关的基因，这些基因有助于其在发酵鱼酱中的存活和代谢活动。这些发现为了解鱼酱发酵过程中的细菌组成和功能角色提供了宝贵的见解，并推动了探索有助于提升产品风味的潜在蛋白酶菌株的发展。

**1. 引言**
发酵是一种最古老的食品保存技术，发酵食品以其独特风味和改善的营养价值而闻名（Sawant等，2025；Valentino等，2024）。通过不同的微生物和酶的代谢作用，可以生产出各种类型的发酵产品（Marco等，2021）。鱼酱是一种传统的越南调味品，已有数百年的历史，是由腌制凤尾鱼（Stolephorus chinensis）发酵12个月或更长时间制成的。鱼和盐是生产鱼酱的主要原料，通常的鱼盐比例为3:1（Ma等，2022）。这些原料随后在由Litsea glutinosa木材制成的木桶中发酵。传统越南鱼酱是海鲜产业的主要产品之一，大约40-60%的捕捞量用于鱼酱生产。根据越南农业与农村发展部的信息，越南沿海地区分布有4200多家鱼酱生产设施。每年越南消费的鱼酱超过4.981亿升，人均消费量至少为4.91升（越南统计总局数据）。2015年，越南鱼酱市场的价值约为5.01亿美元，产量超过7万吨。从出口情况来看，鱼酱主要在亚洲（约54%）、澳大利亚（约18%）和欧洲（约13%）市场销售。

鱼类微生物组是推动鱼酱发酵的关键因素，涉及多种参与蛋白质降解、气味产生和风味形成的代谢过程。蛋白酶活性促进了必需氨基酸的释放，这不仅提升了产品的营养价值，还为挥发性风味化合物的生物合成提供了关键前体（Marlida等，2024）。了解细菌群落不仅对发酵过程的发展至关重要，还有助于阐明高质量产品背后的微生物相互作用（De Filippis等，2017）。在 marine 产品中，自然发酵主要依赖于源自原材料和加工环境的微生物（Han等，2024）。产品独特性可能受到原材料来源或生产方法的影响，从而导致发酵过程中不同细菌群落的选择（Ohshima等，2019）。例如，在使用Pampus argenteus（PA）和Larimichthys polyactis（LP）鱼制作的鱼酱发酵过程中，研究发现微生物动态存在差异：在LP中七个月后Psychrobacter被Staphylococcus取代，而在PA中则是由Virgibacillus主导发酵（Han等，2024）。此外，不同工厂之间也存在差异。Ohshima等（2019）分析了两家工厂生产的泰国鱼酱产品，发现初始优势菌为Halanaerobium sp.，但在第一家工厂中逐渐被Lentibacillus sp.、Halomonas sp.和Tetragenococcus sp.取代；而在第二家工厂中则主要是Peptostreptococcus sp.、Peptoniphilus sp.、Gallicola sp.、Fusobacterium sp.和Vagococcus sp.。因此，研究鱼露发酵过程中的微生物组对于理解各物种的代谢贡献至关重要，可能有助于找出提高这种传统发酵产品质量的策略（Wang等，2022）。此外，鉴定与发酵鱼酱感官特性相关的微生物功能特征将促进未来分离潜在发酵启动菌的努力，从而推进产品标准化，减少腐败和 food waste，确保安全并提升鱼酱市场竞争力。

**2. 材料与方法**
**2.1. 样品收集**
从越南富国岛收集了腌制凤尾鱼和三个鱼酱样本。腌制凤尾鱼在从渔船卸货后立即进行发酵。过程包括将凤尾鱼与盐按3:1的比例混合（3份鱼对1份盐），然后将其分层放入传统的木桶中（约12吨容量）。上层完全覆盖盐以创造厌氧条件，混合物在室温下发酵12个月或更长时间。在发酵1个月后（从第0天起）以及此后每三个月，从桶的排水口采集约50毫升的传统鱼酱发酵液（共采集15次，见图1），所有样本均无腐败迹象。样品来自3个桶，在冷冻前混合。采集后样品被运送到实验室并储存在-20°C。

**2.2. 物理化学分析**
所有物理化学参数在每个采样时间点重复三次测量。总氮（TN）和铵氮（N-NH?）分别使用Kjeldahl法和氧化镁蒸馏法测定（Mehmet Kilinc等，2006）。氨基酸氮（N-氨基）通过HPLC分析检测，使用o-苯甲醛（OPA）作为试剂（Antoine等，1999）。氯化钠（NaCl）浓度根据AOAC International官方方法937.09（2023）通过银量滴定法测定。组胺含量根据Zhong等（2023）的方法在每个采样时间点测定。

**2.3. DNA提取和宏基因组测序**
将腌制凤尾鱼样品切成小块研磨，加入PBS 1X溶液。混合物在5000转/分钟下离心2分钟，然后收集上清液用于DNA提取。鱼酱样品通过涡旋混合器匀质化，用无菌纱布过滤并收集液体。过滤后的40毫升液体在8000转/分钟下离心15分钟，收集沉淀物。沉淀物用1毫升PBS 1X缓冲液洗涤后转移到新的无菌离心管中，再在15000转/分钟下离心5分钟。使用Qiagen公司的DNeasy Powersoil pro试剂盒进行DNA提取（按照制造商说明操作）。遗憾的是，9个月、12个月和15个月发酵期收集的样本中提取的DNA量太少，无法进行测序，因此被排除。使用New England Biolabs公司的NEBNext? Ultra? II DNA Library Prep Kit生成宏基因组文库。宏基因组使用Illumina公司的NovaSeq 6000（2×150 PE）平台进行测序。

**2.4. 宏基因组生物信息学分析**
使用FastQC（版本0.12.1）和默认设置评估原始读数的质量。通过将读数映射到宿主基因组（Engraulis encrasicolus和Engraulis japonicus，见补充表S1）来去除宿主污染。使用PRINSEQ（Schmieder和Edwards，2011）过滤低质量读数，去除长度小于60 bp或质量得分≤5的读数。使用MetaPhlAn（Truong等，2017）生成微生物组分类概况，并使用‘vegan’ R包中的‘diversity’函数计算Shannon指数和Simpson指数（计算公式为1 – D，其中D=∑pi2，pi表示物种的相对丰度）。高质量读数使用MEGAHIT（Li等，2015）组装成contigs，长度小于1000 bp的contigs被丢弃。使用MetaGenMark（Zhu等，2010）在contigs上预测编码序列的坐标和序列。为了鉴定蛋白酶，使用DIAMOND BLASTP（Buchfink等，2021）和MEROPS数据库版本12_1（Rawlings等，2018）对预测基因进行功能注释，仅保留匹配度（pident）≥80%且查询覆盖度≥80%的读数进行下游分析。使用Kraken2（版本2.0.8，选项–use-name和–report）和‘k2_plusPF’数据库为预测基因分配分类信息。通过BowTie2（选项–very-sensitive-local和–no-unal，Langmead和Salzberg，2012）将读数与编码蛋白酶的基因比对，计算蛋白酶的RPKM值（每百万映射读数的读数）。使用ggpubr R包中的统计函数‘stat_cor’（选项“method = “spearman”）计算蛋白酶RPKM值与氨基酸浓度之间的相关性（Spearman’s ρ相关系数）。高质量读数使用BowTie2（选项–very-sensitive-local和–no-unal）映射到contigs上。使用MetaBAT2处理对齐文件和contigs，重建宏基因组组装基因组（MAGs）（Liu等，2021）。使用CheckM（Parks等，2015）评估MAGs的完整性和污染情况（≥50%和<5%）。使用GTDB-Tk（Parks等，2018）进行分类学分类和系统发育树构建。使用Prokka（Seemann，2014）对Tetragenococcus halophilus的基因组（包括本研究中的一个MAG和NCBI数据库中的74个参考基因组，见补充表S2）进行功能注释。随后使用Roary（Page等，2015）进行全基因组分析，比较不同基因组间的基因存在/缺失情况。所有图表均在R环境中使用‘ggplot2’和‘pheatmap’包生成（https://www.r-project.org）。

**3. 结果**
**3.1. 鱼酱的物理化学特性**
鱼酱的物理化学特性见表1和补充表S3。总氮含量范围为19至22.1克/升。经过六个月的发酵后，氨基酸氮含量增加到12.6克/升，而盐浓度从250克/升下降到231克/升。共鉴定出17种氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸和精氨酸最为丰富（见补充表S3）。我们还测定了组胺的含量，组胺是一种常见于肉类、鱼类、奶酪和葡萄酒产品中的生物胺（Kimura等，2001）。几乎所有样本都显示出相对较高的组胺水平，范围从161.57到261.33毫克/千克，其中最高的浓度出现在生鱼和发酵第三个月时。然而，根据《食品法典》对鱼酱的标准（CXS 302-2011），检测到的组胺浓度仍在推荐范围内。表1显示了鱼酱的化学成分。

| 样本 | NaCl (g/L) | 总氮 (g/L) | 氨氮 (g/L) | 氨基酸氮 (g/L) | 组胺 (mg/kg) |
| KH00 | 250 ± 0.38 | a | 20.8 ± 0.1 | d | 0.84 ± 0.11 | i | 4.58 ± 0.02 | i | 261.33 ± 10.02 | a |
| KH01 | 240 ± 1.02 | b | 22.1 ± 0.09 | b | 1.1 ± 0.1 | h | 8.44 ± 0.06 | g | 161.67 ± 3.06 | d |
| KH03 | 245 ± 4.58 | b,c | 19 ± 0.04 | f | 1.74 ± 0.01 | d,e | 10.5 ± 0.11 | e | 237.33 ± 6.66 | b |
| KH06 | 231 ± 0.71 | d | 19.6 ± 0.15 | e | 1.73 ± 0.13 | d,e | 12.6 ± 0.08 | b | 199.33 ± 4.73 | c |

同一行中不同字母（a–i）表示数值有显著差异（p < 0.05）。

3.2. 元基因组数据处理
从四个样本中获得了总共3.1747亿个原始读段，这些样本包括腌制凤尾鱼（KH00）以及一个月（KH01）、三个月（KH03）和六个月（KH06）发酵后的鱼酱。通过将读段与两种凤尾鱼物种Engraulis encrasicolus和Engraulis japonicus的基因组进行比对，去除了由宿主DNA污染产生的读段（表2）。经过质量筛选后，保留了1.9537亿个高质量、清洗过的读段用于组装（表2）和后续的元基因组分析。组装统计结果见表3。

表2. 读段预处理摘要。
| 样本编号 | 原始读段（对） | GC% | 第一次宿主去除（对） | 第二次宿主去除（对） | 剪裁后（对） |
| KH00 | 74,567,260 | 48% | 0 | 23,911,408 | 23,631,340 |
| KH01 | 92,390,934 | 49% | 0 | 50,019,932 | 49,925,482 |
| KH03 | 89,758,610 | 49% | 0 | 62,734,914 | 62,577,762 |
| KH06 | 60,749,728 | 44% | 0 | 60,327,410 | 60,321,102 |

表3. 元基因组组装统计。
| 样本 | 插入片段数量 | GC% | GC% |
| KH00 | 5,855 | 48.86 | 94.16 |
| KH01 | 48,869 | 46.64 | 44.16 |
| KH03 | 43,776 | 63.20 | 46.05 |
| KH06 | 32,203 | 44.16 | 44.16 |

3.3. 微生物群落的分类学分析
图2显示了腌制凤尾鱼（KH00）和鱼酱样品在一个月（KH01）、三个月（KH03）和六个月（KH06）发酵阶段细菌属（图2A）和物种（图2B）的分布情况。在属水平上，我们鉴定了137个属，其中14个属的相对丰度超过1%（图2A）。Psychrobacter、Tetragenococcus、Staphylococcus、Halomonas、Peptostreptococcus、Bacillus、Oceanimonas和Halobacterium是所有样本中细菌群落的优势属。

3.4. 鱼酱元基因组中蛋白酶编码基因的流行情况
为了了解微生物群落对鱼酱特定感官特性的贡献，我们筛选了元基因组的蛋白水解潜力。蛋白水解酶的总体丰度（以RPKM表示）随时间增加（图3A），特别是在KH03（RPKM = 910,870.76）和KH06（RPKM = 935,822.69）中显著升高，表明蛋白水解活性随时间增强。具体而言，编码C108.001蛋白酶的基因丰度在整个发酵过程中持续增加，表明这种蛋白酶在鱼蛋白降解中起关键作用。在我们的元基因组中，共发现了27个编码C108.001蛋白酶的基因，其中21个属于Staphylococcus属，特别是S. pseudoxylosus、S. simulans、S. saprophyticus、S. nepalensis和S. epidermidis（图3B）。

此外，编码S14.001蛋白酶（一种丝氨酸肽酶）的亚家族在鱼酱发酵三个月（KH03，RPKM = 23,666.04）和六个月（KH06，RPKM = 22,967.25）后显著增加，而基线水平（KH00，RPKM = 7,358.57）则保持不变。这种蛋白酶可以断裂长蛋白质链，释放出短肽和游离氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸和亮氨酸（Zeiler等人，2013年）。S. debuckii、S. simulans和S. nepalensis是主要编码S14.001蛋白酶的物种（图3C），而较小比例的基因来自Bacillus cereus属和Lactobacillales目。

3.5. Tetragenococcus halophilus的泛基因组分析
泛基因组提供了对某一系统发育谱系成员遗传多样性的概览，有助于更好地理解属于同一物种的基因组之间的遗传特征、代谢功能和多样性（Chun等人，2019年）。本研究对75个Tetragenococcus halophilus基因组进行了泛基因组分析（包括我们从样本中获取的1个MAG和从NCBI下载的74个基因组），并使用Prokka工具进行了基因注释。辅助基因的存在/缺失模式通过热图可视化了，并通过层次聚类对基因组进行了分组（图5）。

总体而言，在75个Tetragenococcus halophilus基因组中发现了10,050个基因，包括一个核心基因组（即至少出现在95%的基因组中的基因，Gong等人，2023年）中的1,229个基因（11.74%）和8,821个辅助基因（88.26%），突显了该物种的遗传多样性。有趣的是，基因组根据分离源进行了聚类，表明菌株对不同环境生态位的遗传适应。特别是从KH06样本中重组的T. halophilus的MAG与从类似环境（例如发酵鱼或虾）中分离的NCBI基因组聚集在一起（图5）。这些基因组富集了与盐胁迫抗性相关的基因，包括opuCC_3、yehX、yheS_2、ydeA和osmC，这些基因与参与功能性化合物吸收或排泄的ABC转运蛋白有关（Supplementary Table S5）。为了调节细胞内的渗透压，ABC转运蛋白倾向于积累可兼容的溶质，包括离子、氨基酸、肽、糖和代谢物等亲水分子（Alloing等人，2006年；Liu等人，2015年），这些物质可以帮助细胞在高盐环境中生存（Yoo等人，2023年）。此外，一些参与氨基酸和维生素生物合成的基因也得到了富集，包括proC、ubiE、PGDH、dsdA和metE、bioC。

4. 讨论
鱼酱在发酵过程中的物理化学特性主要体现在总氮、游离氨基酸含量和盐浓度的变化上。观察到的氨氮增加以及总氮的减少反映了氮化合物的动态转化，其中氮化合物通过水解释放出来，并随后转化为更简单或更易挥发的形式。鱼酱中的蛋白水解受到原材料、发酵条件和不同阶段微生物群落的影响，产生了蛋白质氮和非蛋白质氮化合物，包括游离氨基酸、核苷酸、肽和氨，所有这些都对鱼酱的独特香气和风味有贡献（Jiang等人，2007年）。经过六个月的发酵后，天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸和精氨酸被鉴定为样品中的主要氨基酸，这与印度尼西亚鱼酱bekasang的氨基酸组成一致，后者在发酵过程中主要含有赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸和天冬氨酸（Ijong & Ohta，1996年）。

解析越南鱼酱发酵过程中的微生物组成和微生物组动态变化可以有效地抑制潜在的腐败和有害微生物的活动，从而优化发酵过程并减少食物浪费。在本研究中，我们观察到最初占优势的属（包括Psychrobacter、Peptostreptococcus和Halobacterium）在六个月发酵后被Tetragenococcus逐渐取代。Tetragenococcus是不同亚洲地区鱼酱发酵过程中的主要微生物属之一（Li等人，2022年）。相关研究还发现，在中国鱼酱的七个月发酵过程中，Tetragenococcus迅速主导了微生物群落并超过了其他物种（Han等人，2023年），表明该分类群在发酵鱼中起着关键作用。此外，Tetragenococcus spp.还从泰国鱼酱（Chuea-Nongthon等人，2017年）和用于制奶酪的盐水中分离出来（Vermote等人，2018年），其在微生物群落中占比超过60%。据报道，Tetragenococcus halophilus是一种适应高盐环境的嗜盐物种（Justé等人，2014年；Kobayashi等人，2004年；Link等人，2021年）。与文献一致，T. halophilus在原始材料中的丰度较低，但在发酵六个月的样本中成为优势菌株。这种优势可能归因于鱼酱的高盐浓度，这抑制了非耐盐微生物的竞争，使Tetragenococcus halophilus成为优势物种。基于泛基因组分析，T. halophilus菌株可能通过调整细胞内离子浓度和吸收发酵介质中的兼容物质（如糖和氨基酸）来适应高渗透压环境（Aljohny，2015年），这可能是通过opuCC_3、yehX、yheS_2等基因介导的。此外，Tetragenococcus halophilus基因组中富集的几个基因与必需氨基酸和维生素的生物合成有关，包括丝氨酸（赋予甜味；Hakimi等人，2022年）、甲硫氨酸（赋予苦味；Park等人，2002年）和生物辅因子如生物素或烟酸（维生素K2）。因此，将新分离的嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）菌株与该物种的泛基因组进行比较，可能有助于快速识别出耐渗透压的菌株，从而开发出高成功率的新型发酵鱼露生产发酵剂。有趣的是，我们的结果与先前报道的数据一致。实际上，我们观察到嗜盐四联球菌是C108.001蛋白酶的潜在产生菌之一，在发酵3个月和6个月的样品中显示出最高的表达量（以RPKM表示）。这种蛋白酶家族包括能够释放短肽或游离氨基酸的酶，这些氨基酸通常是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或脯氨酸，具体取决于底物（Aro Aro等人，2010年；Denyseyuk等人，2020年）。这种酶的活性有助于分解复杂蛋白质，从而释放与风味形成相关的肽，并通过提高其他微生物在自然环境中获取和利用游离氨基酸的能力来增强其代谢潜力，从而参与风味的发展（Kato等人，1989年；Xu等人，2025年；Zhu等人，2021年）。尽管在发酵过程中嗜盐四联球菌是优势种，但其他次要物种也对发酵鱼露微生物组中的蛋白水解潜力有所贡献。值得注意的是，几种葡萄球菌（包括凝固酶阴性的S. simulans和S. debuckii）在其基因组中携带了一些在发酵鱼露中最丰富的蛋白酶。已有研究表明，葡萄球菌可以在高盐环境中产生蛋白酶。事实上，Casaburi等人（2006年）发现，在18株葡萄球菌中，S. xylosus、S. saprophyticus、S. equorum、S. carnosus和S. simulans能够在意大利南部的发酵香肠中产生蛋白水解酶、氨肽酶和酯酶（Casaburi等人，2006年）。因此，葡萄球菌通过产生蛋白酶来促进氨基酸的释放，这些蛋白酶在食品发酵中作为风味前体起着重要作用（Zhao等人，2024年）。在发酵鱼露宏基因组中，具有脯氨醇酶活性的蛋白酶基因过表达，且脯氨酸浓度在发酵过程中的增加与宏基因组的更高蛋白水解潜力呈正相关。脯氨醇酶被认为是通过与其他内肽酶和外肽酶协同作用来降解细胞内蛋白质和参与脯氨酸代谢的（Du等人，2005年）。宏基因组中，尤其是葡萄球菌和嗜盐四联球菌中存在脯氨醇酶，表明微生物组具有降解小肽或游离脯氨酸的潜力，这些对于鱼露的风味发展是重要的（Zhu等人，2021年；Ghosh等人，1998年；Matsushita-Morita等人，2017年）。实际上，脯氨酸被认为是鱼露苦味的主要贡献者之一（Zhu等人，2021年），尤其是当它以短肽的形式存在时（Zhao等人，2016年）。此外，脯氨酸还参与渗透调节（Wilk等人，2021年；Zhao等人，2016年），而渗透压有助于从鱼细胞中释放水分和可溶性含氮化合物，从而增加液相中的氮含量（Hjalmarsson等人，2007年）。虽然含氮化合物是鱼露质量的关键指标，但氨基酸的积累也有助于提高鱼露的产品质量和风味特性（Jiang等人，2007年）。复合的酶活性增强了含脯氨酸肽链的降解，导致游离脯氨酸的释放增加，从而有助于形成发酵产品的特征性风味。实际上，在食品工业中，可以在奶酪制作过程中添加脯氨醇酶和其他肽酶，通过水解导致苦味的肽来改善奶酪的风味（Courtin等人，2002年），并释放可以进一步代谢的氨基酸，丰富最终产品的风味（Smit等人，2000年）。同样，在发酵3个月和6个月的样品中，内肽酶（如丝氨酸蛋白酶S14.001）和外肽酶（包括金属蛋白酶M24.006和金属蛋白酶M15.024）也是最丰富的基因之一。有趣的是，Bu及其同事（2022年）的研究发现，泰国鱼露中的蛋白酶活性在长时间发酵时更高。此外，还从凤尾鱼发酵汤中分离出了丝氨酸蛋白酶（Bu等人，2022年），这支持了其在鱼露生产中的重要性。丝氨酸蛋白酶的存在与凤尾鱼酱的抗氧化活性密切相关，表明它不仅在塑造发酵鱼露的感官特性方面具有积极作用，还有助于增强产品的抗氧化能力（Bu等人，2022年）。类似地，Guo及其同事（2011年）发现，金属蛋白酶在发酵过程中增加，有助于氨和游离氨基酸的形成（Guo等人，2011年）。总体而言，我们的结果表明，越南鱼露独特的感官特性不能归因于单一物种，而可能是由不同的微生物群落通过环境因素（如盐的添加）的选择及其酶在鱼蛋白代谢中的协同作用共同作用的结果。这些关于微生物群落结构和动态的新见解可能为识别能够增强发酵鱼露感官特性的微生物联合体铺平道路。一旦识别出这些群落，就可以复制它们以优化发酵鱼露的加工技术。

5. 结论
本研究提供了关于传统越南鱼露发酵过程中细菌微生物组动态变化的全面宏基因组见解。结果表明，嗜盐四联球菌在发酵过程中起着核心作用，在六个月后成为优势种。功能分析显示，来自嗜盐四联球菌、葡萄球菌和芽孢杆菌的蛋白酶在高盐条件下对蛋白质降解有显著贡献。此外，嗜盐四联球菌显示出广泛的基因适应性，包括盐胁迫耐受性、兼容的溶质代谢、转运系统和氨基酸生物合成，这解释了其在发酵过程中的主导地位和代谢活性。总体而言，这些结果为选择有益微生物奠定了基础，这些微生物可以作为发酵剂来优化发酵效率、控制风味形成并提高传统鱼露的生产质量和一致性。尽管我们的研究为微生态联合体的精细调整以优化鱼露生产和风味特性铺平了道路，但在未来的研究中仍需解决一些问题。实际上，需要更大的样本量（包括技术重复实验），以及与代谢组学和物理化学数据（例如酶活性、挥发性有机化合物）的整合，以验证我们的结果，并更好地了解鱼露发酵过程中发生的微生物动态及其对产品特性的影响。此外，必须严格评估此处描述的对风味发展最相关的物种的安全性（例如缺乏毒力和抗微生物特性）。

**作者贡献声明**
Thi Thanh Thanh Vu：撰写——原始草稿、正式分析、数据可视化、方法学。
Vincenzo Valentino：撰写——原始草稿、正式分析、方法学。
Thi Huyen Tran：数据管理、正式分析、撰写——审阅和编辑。
Ngoc Nam Trinh：正式分析、研究、撰写——审阅和编辑。
Trung Hau Nguyen：正式分析、研究、资源管理。
Khanh Hoang Nguyen：正式分析、研究、撰写——审阅和编辑。
Francesca De Filippis：资金获取、监督、资源管理、项目管理、撰写——原始草稿。
Sao-Mai Dam：资金获取、监督、资源管理、项目管理、撰写——审阅和编辑。

**资助**
本研究得到了越南科学技术部国际合作司（MOST）管理的国家科学技术计划办公室（合同编号18/2022/H?-N?T）资助的项目NDT/IT/22/18“通过宏基因组分析表征其微生物和遗传遗产来保护手工艺发酵食品的质量和真实性”的支持，以及意大利外交和国际合作部（MAECI，VN21GR09）的支持。
本研究还部分得到了意大利大学和研究部（MUR）资助的项目DOGMA - 桥接食品和肠道微生物组：探索食品微生物在调节肠道微生物组和改善人类健康中的作用（CUP E53C24003720001，FIS-2023-00241）的支持。

**数据可用性**
四个样本的原始读取数据可在NCBI Sequence Read Archive数据库中找到，访问编号为PRJNA1332412。

**伦理声明**
不适用。