GRB2在缺氧条件下通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌细胞对索拉非尼的耐药性

《Journal of Hepatocellular Carcinoma》：GRB2 Promotes Sorafenib Resistance in Hepatocellular Carcinoma Cells Under Hypoxia by Activating the PI3K/AKT Signaling Pathway

　　

目的：索拉非尼（Sorafenib）耐药是晚期肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）治疗中的主要挑战。本研究旨在探讨生长因子受体结合蛋白2（GRB2）在缺氧条件下肝细胞癌细胞对索拉非尼耐药中的作用，并阐明其涉及PI3K/AKT信号通路的潜在分子机制。方法：研究人员利用TCGA-LIHC、GEO数据集和多个数据库进行生物信息学分析，评估了GRB2在HCC中的表达、其与缺氧特征的相关性及其预后意义。通过蛋白质印迹法（Western blot）检测了HCC细胞系和正常肝细胞中GRB2的表达。在常氧（21% O2）或低氧（1% O2）条件下培养Huh7细胞，并用索拉非尼单独处理或与PI3K抑制剂LY294002联合处理。通过慢病毒shRNA进行GRB2敲低。分别通过CCK-8实验、伤口愈合实验和流式细胞术评估细胞增殖、迁移和凋亡。结果：生物信息学分析显示，与正常组织相比，GRB2在HCC组织中显著上调，与缺氧相关基因（HIF-1α、VEGFA）和缺氧评分呈正相关，并与患者预后不良相关。蛋白质印迹法证实GRB2在HCC细胞系中相较于正常肝细胞高表达。在缺氧条件下，HIF-1α的表达呈时间依赖性增加，验证了缺氧模型的有效性。缺氧削弱了索拉非尼对细胞增殖和迁移的抑制作用，同时减少了细胞凋亡，这由IC50值（从4.934 μM增加至8.676 μM）的增加所证明。在缺氧条件下使用索拉非尼处理会上调GRB2、PI3K和磷酸化AKT（p-AKT）蛋白水平。通过LY294002抑制PI3K或敲低GRB2可恢复缺氧HCC细胞对索拉非尼的敏感性，降低PI3K和p-AKT的表达，并促进细胞凋亡。结论：研究结果表明，缺氧降低了HCC细胞对索拉非尼的敏感性，而GRB2通过激活PI3K/AKT通路在此过程中发挥作用。靶向GRB2可能是一种潜在的策略，以增强索拉非尼在缺氧条件下治疗HCC的疗效。

肝细胞癌是全球第六大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因，索拉非尼是其一线系统治疗药物，但其耐药性已成为临床主要障碍。缺氧是HCC等实体瘤的标志性微环境特征，可导致化疗耐药。既往研究表明，PI3K/AKT信号通路是索拉非尼耐药的关键介质，而GRB2是一种接头蛋白，在多种癌症中被报道与耐药相关，但GRB2在HCC缺氧微环境中介导索拉非尼耐药的作用及机制尚不清楚。为此，研究人员开展本研究，旨在探索GRB2在缺氧条件下通过PI3K/AKT信号通路调控HCC细胞索拉非尼耐药的作用，研究结果发表在《Journal of Hepatocellular Carcinoma》。这项研究对于深入理解HCC耐药的分子机制和开发新的联合治疗策略具有重要意义。

本研究主要运用了多种技术方法。首先，研究人员利用TCGA-LIHC、GEO等公共数据库（如SPARKLE、GEPIA2、UALCAN、The Human Protein Atlas）进行了生物信息学分析，评估GRB2在HCC中的表达、预后以及与缺氧特征的相关性。其次，在细胞功能实验中，使用了人HCC细胞系Huh7等，并建立了缺氧（1% O₂）细胞模型。关键实验技术包括：蛋白质印迹法检测蛋白表达；CCK-8法测定细胞活性和计算IC₅₀；流式细胞术检测细胞凋亡；伤口愈合实验评估细胞迁移；以及通过慢病毒转染构建稳定敲低GRB2的细胞系。此外，还使用了PI3K抑制剂LY294002进行药理学干预，以验证通路作用。

研究结果分为六个主要部分，具体结论如下：

GRB2在肝细胞癌中高表达。通过生物信息学分析发现，GRB2 mRNA在包括HCC在内的多种实体瘤中广泛上调。在TCGA-LIHC配对样本队列和GEO数据集GSE76427中验证发现，GRB2在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织。人类蛋白质图谱数据库的免疫组化图像和蛋白质印迹实验进一步在蛋白水平证实，GRB2在HCC细胞系中表达显著高于正常肝细胞。

GRB2表达与HCC患者预后不良相关。分析显示，GRB2的表达水平随HCC组织学分级和TNM分期的升高而显著增加。Kaplan-Meier生存分析表明，GRB2高表达患者的总生存期和无复发生存期均显著短于低表达患者。受试者操作特征曲线分析表明GRB2对HCC具有一定的诊断准确性。

GRB2与缺氧特征密切相关。通过TCGA数据分析，GRB2表达与缺氧关键因子HIF-1α和VEGFA呈正相关。利用CancerSEA数据库和GSVA算法评估发现，GRB2表达与缺氧、血管生成和侵袭等恶性表型正相关。此外，基于ssGSEA算法计算的缺氧评分显示，高缺氧评分组的GRB2表达显著高于低评分组，这表明GRB2与缺氧信号密切相关，可能参与HCC的缺氧相关恶性进展。

缺氧减弱索拉非尼对HCC细胞的疗效。蛋白质印迹法验证了缺氧模型，显示HIF-1α在缺氧Huh7细胞中表达上调且呈时间依赖性。CCK-8实验表明，缺氧条件下索拉非尼对Huh7细胞增殖抑制的IC₅₀值（8.676 μM）显著高于常氧条件（4.934 μM）。流式细胞术显示，5 μM索拉非尼诱导的细胞凋亡率在缺氧条件下（约6.01%）显著低于常氧条件（约17.04%）。伤口愈合实验证明，缺氧增强了经索拉非尼处理的Huh7细胞的迁移能力。这些数据表明，缺氧减弱了索拉非尼对HCC细胞增殖、凋亡和迁移的抑制作用，即降低了细胞在缺氧条件下对索拉非尼的敏感性。

PI3K/AKT通路介导缺氧下的索拉非尼耐药。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析显示GRB2与PI3K/AKT通路的关键组分存在物理相互作用。蛋白质印迹实验显示，在缺氧条件下用索拉非尼处理Huh7细胞后，GRB2、PI3K和p-AKT蛋白水平显著上调。使用PI3K抑制剂LY294002联合索拉非尼处理缺氧细胞，可抑制PI3K和p-AKT的表达，并显著降低细胞活力、减弱细胞迁移、增加细胞凋亡。这表明PI3K/AKT通路与缺氧下的索拉非尼耐药相关，抑制该通路可降低耐药性。

下调GRB2增强缺氧HCC细胞对索拉非尼的敏感性并抑制PI3K/AKT通路。通过慢病毒shRNA稳定敲低GRB2后，蛋白质印迹和RT-qPCR验证了敲低效率。在缺氧条件下，GRB2敲低的Huh7细胞经索拉非尼处理后，其细胞活力显著低于对照组，细胞迁移能力减弱，凋亡细胞比例显著增加。同时，GRB2敲低显著降低了索拉非尼处理的缺氧Huh7细胞中p-AKT和PI3K的表达。这些数据表明，GRB2通过激活PI3K/AKT通路促进HCC细胞在缺氧条件下的索拉非尼耐药，而下调GRB2可恢复其对索拉非尼的敏感性。

在讨论部分，研究人员指出缺氧微环境是HCC索拉非尼耐药的关键因素。GRB2作为一种关键的接头蛋白，将受体酪氨酸激酶与下游信号级联（包括PI3K/AKT通路）联系起来。本研究发现，在缺氧和索拉非尼处理条件下，GRB2与PI3K/AKT同时被上调，而抑制GRB2表达可抑制PI3K/AKT通路活性并降低耐药性，这与PI3K抑制剂LY294002的效果一致，支持了GRB2与PI3K在同一信号轴中起作用。研究也指出了局限性，包括主要使用了Huh7细胞和短期缺氧模型，缺乏直接的分子相互作用证据和体内验证，以及使用的正常肝细胞HL-7702可能存在系谱问题。未来需要进一步研究GRB2作为治疗靶点的潜力。

研究结论部分翻译如下：我们的研究结果表明，缺氧降低了HCC细胞对索拉非尼的敏感性，而GRB2通过激活PI3K/AKT通路在此过程中发挥作用。靶向GRB2可能是一种潜在的策略，以增强索拉非尼在缺氧条件下治疗HCC的疗效。