在多个大陆上与香蕉（Musa spp.）相关的核心根际细菌

《Applied Soil Ecology》：Core rhizosphere bacteria associated with banana (Musa spp.) across multiple continents

　　安娜-贝尔·C·克拉克（Anna-Belle C. Clarke）|克里斯蒂娜·罗斯·安塞尔（Christine Rose Ansale）|洛伦·巴纳亚格（Loren Banayag）|谢丽尔·巴扬（Sheryl Bayang）|谢丽尔·博特马（Sheryl Bothma）|科内萨万·奇塔拉特（Khonesavanh Chittarath）|梅尔丽娜·朱鲁埃纳（Merlina Juruena）|乔治娜·卡拉穆拉（Georgina Karamura）|黑兹尔·R·拉皮斯-加扎（Hazel R. Lapis-Gaza）|塞萨尔·林巴加（Cesar Limbaga）|丽贝卡·莱昂斯（Rebecca Lyons）|孙佳瑞（Jiarui Sun）|阿尔图斯·维尔约恩（Altus Viljoen）|黛安·莫斯特（Diane Mostert）|努尔·巴伊蒂·赛迪（Noor Baity Saidi）|努鲁尔·沙姆辛娜·莫赫德·苏海米（Nurul Shamsinah Mohd Suhaimi）|安东尼·B·帕蒂森（Anthony B. Pattison）|保罗·G·丹尼斯（Paul G. Dennis）

昆士兰大学环境学院，澳大利亚布里斯班，QLD 4072

摘要
香蕉（Musa spp.）对许多国家的经济和粮食安全至关重要，但受到多种问题的制约，而这些问题往往缺乏有效的解决方案。香蕉的微生物组强烈影响其宿主的健康和营养，并可能为生产限制提供新的解决方案。然而，由于微生物群在空间和时间上的变异性，管理这些微生物群具有挑战性。尽管如此，仍有少数“核心”分类单元几乎总是与它们的宿主相关联，无论地理和时间如何变化。虽然国家级的研究已经确定了香蕉的核心分类单元，但尚不清楚这些分类单元是否在多个国家和地区也存在。建立一个跨国的香蕉核心微生物组将有助于集中研究力量，开发出适用于各种生产系统的基于微生物组的管理策略。在这里，我们使用16S rRNA基因测序来表征从澳大利亚、非洲和东南亚24个农场的土壤中种植的香蕉相关的细菌群落。通过应用丰度-占据标准，我们识别出74个在这些地理位置不同的地点始终与香蕉相关的核心细菌分类单元。这些分类单元是分离和生物库保存的合理目标，这将支持有针对性的生态学和功能研究，并促进产品开发以及为种植者设计微生物组管理方法。

1. 引言
香蕉（Musa spp.）是全球消费量最大的水果之一，对许多国家的国内生产总值有重大贡献（粮农组织，2023年）。商业香蕉生产受到多种非生物和生物因素的制约（Jones，2019年；Ploetz，2003年）。除了维持产量和果实质量外，香蕉生产系统还面临着提高韧性和可持续性的压力。主要挑战包括应对重要土壤传播疾病的有效控制手段有限、对外部投入的依赖性以及难以开发在多种土壤和生产条件下都有效管理策略的问题。在这种情况下，基于微生物组的策略正受到关注，作为一种对土壤生物过程进行利用而非对抗的方法。与其他植物一样，香蕉与土壤微生物进化出了互惠关系，极大地扩展了它们的功能范围（Brugman等人，2018年）。这些关联中的许多都通过增强养分可用性、抗逆性和抵御害虫及病原体的能力来使宿主受益（Trivedi等人，2020年）。因此，这些微生物可能为目前缺乏有效控制措施的一些生产限制提供新的解决方案。然而，由于微生物组在空间和时间上的动态变化，为多个农场提供适当的微生物组管理策略建议具有挑战性（Toju等人，2018年）。尽管如此，仍有一些“核心”谱系可能是进一步研究的合理目标。核心系统发育分类单元在各种环境梯度下始终与宿主相关联，因此被认为对宿主的适应性有重要贡献（Lay等人，2018年；Simonin等人，2020年）。此外，核心分类单元在群落中占很大比例，因此可能作为关键或“枢纽”物种影响其他分类单元（Liu等人，2017年；Shade和Stopnisek，2019年）。因此，核心分类单元可以被认为是生物库收集和进一步生态研究的合理目标，因为它们更有可能在长时间内对多个地点都具有重要性（De Cáceres和Legendre，2009年）。例如，Birt等人（2022年）发现，在澳大利亚，香蕉中存在36个核心细菌操作分类单元（OTUs），尽管它们仅占观察到的总OTUs的0.002%，但占据了30-40%的相对丰度。他们还确定了这些核心系统发育分类单元是否出现在全球其他22项香蕉微生物组研究的数据集中（Birt等人，2022年）。虽然所有36个核心OTUs在所有研究覆盖的大陆上都有匹配序列，但数据无法确定澳大利亚的核心OTUs在其他地方是否也是核心OTUs。其他旨在识别Musa spp.核心分类单元的研究也集中在单个国家，如中国（Shen等人，2022年）和坦桑尼亚（Kaushal等人，2020年）。因此，目前的核心分类单元列表有助于在国家内部优先安排研究工作，但缺乏跨国间的兼容性。确定多个国家的核心分类单元列表将有助于行业参与、产品开发，并为种植者提供微生物组管理方法的依据。例如，它可以帮助指导国际分离工作，建立包含与香蕉强相关联的核心谱系的生物库。这些生物库的建立将促进对核心谱系功能和生态偏好的详细研究，并有助于设计微生物组管理方法，从而加快微生物组研究对最终用户利益的影响。

在这里，我们试图识别与多个国家香蕉植株相关的核心细菌谱系。我们使用16S rRNA基因测序来表征澳大利亚、东南亚（老挝、马来西亚和菲律宾）和非洲（乌干达和南非）香蕉相关土壤中的细菌群落多样性。通过在每个国家选取多个香蕉农场进行采样，我们捕获了广泛的土壤条件，并能够评估所有地点的多样性模式。我们测试了在不同地理位置和多样化环境梯度下存在香蕉共同细菌核心的假设。我们的研究识别出74个始终与Musa spp.相关的细菌谱系。我们认为这些分类单元对宿主非常重要，应该是未来香蕉微生物组研究的重点。

2. 方法
2.1. 土壤采集和实验设置
为了评估不同地理位置的土壤条件的影响，我们从澳大利亚、老挝、马来西亚、菲律宾、南非和乌干达的香蕉农场采集了土壤样本（图1）。所有植株都没有明显的疾病症状，且在采样前一年这些农场没有报告过镰刀菌枯萎病的发生。使用铲子从香蕉植株基部附近的不同位置采集土壤，深度约为0-20厘米，在清除表面落叶后进行采集。然后通过干净的8毫米筛子过滤土壤，并按照Moody和Cong（2008年）描述的方法测量pH值。

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图1. 采集土壤的24个香蕉农场（地点）的位置。

来自老挝、马来西亚、菲律宾和乌干达的土壤被赋予编号（例如Soil1或S1）。在澳大利亚，采样区域的土壤被分组为系列（Cannon等人，1992年；Enderlin等人，1997年），因此每个土壤的系列名称被用于标签中（Innisfail = In，Liverpool = Li，Pin Gin = Pg，Tolga = To，Tully = Tu）。在南非，土壤以其采集区域命名（Hebron = He，Langverwacht = La，Schoon Spruit = SS，Welgelegen = We）。然后使用每个国家的两位字母ISO 3166代码加上土壤标签来表示地点（例如LA.S1 = 老挝土壤1；或AU.Li = 澳大利亚Liverpool系列）。详细的地点信息和土壤性质在表S1中提供。

在每个国家，并在土壤采集后的一周内，将Musa（ABB）‘Pisang Awak’的体外组织培养（TC）小苗（冲洗掉琼脂）直接移植到含有1公斤（鲜重）土壤的灭菌120毫米×125毫米盆中。考虑到直接接种土壤的组织培养的高死亡率，每种处理方式种植了15株小苗。我们选择Pisang Awak是因为它在所有国家都有种植，尽管名称不同（在澳大利亚称为Ducasse，在乌干达称为Kayinja，在老挝人民民主共和国称为Kluai Nam Wa，在菲律宾称为Cardaba）。为了最小化交叉污染，在种植时使用4%的漂白剂对工作台和工具进行灭菌，并在处理组织培养小苗时佩戴手套。

2.2. 生长条件
由于TC小苗非常脆弱，通常会在暴露于全日照之前先进行一个月的“硬化”处理。在这一个月里，TC小苗在高温潮湿的遮荫室中成熟。之后将它们转移到主温室的地面上，并逐渐增加光照强度。在转移到主温室的同一天，小苗接受了第一剂肥料，此后每两周施肥一次。浇水频率根据每个国家的气候条件而定，干燥气候下的植物浇水更频繁。植物至少在全日照下生长六周。

由于气候和土壤类型的差异，不同国家的植物生长速度不同。当植物高度达到≥10厘米并且生长了12-16周时进行采样。对于那些在16周内未能达到≥10厘米高度的植物，无论其高度如何都会进行采样。每个国家的所有土壤同时进行采样，最慢生长的处理方式决定了采样时间。最初为每种土壤种植的15株植物中，只采样最高的10株最健康的植物。在某些处理方式中，死亡率较高，存活的植物少于10株时，也会对所有剩余的植物进行采样。例如，在菲律宾，只有来自土壤4的三个重复样本存活到了采样时间。

2.3. 采集土壤和根际外共生菌
在每个国家，使用Birt等人（2021年）概述的标准方法采集土壤和根际外共生菌样本。简而言之，将土壤轻轻摇晃到装有塑料袋的容器中（每个植物一个），并在50毫升Falcon管中收集子样本。然后用无菌剪刀从根茎上剪下根部部分。从根部的基部、中部和顶端各切下部分，并放入50毫升Falcon管中。为了分离土壤和根部，向每个管中加入40毫升1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后根据可用设备的情况，通过涡旋器振动2分钟或手动摇晃5分钟。搅拌后，用无菌镊子去除根部物质，并将剩余的悬浮液以480×g离心5分钟。去除多余的PBS，直到只剩下根际外共生菌的沉淀物。

为了防止交叉污染，所有工具（如剪刀、刀具、镊子）在处理每株植物前后都用4%的漂白剂进行灭菌。工作台也用4%的漂白剂进行灭菌，并且每次处理样本时都使用新的手套。土壤和根际外共生菌样本在DNA提取前储存在-20°C。

2.4. DNA提取和16S rRNA标记基因的PCR
为了确保各国之间的结果一致性，按照制造商的说明使用DNeasy PowerSoil Pro Kits（Qiagen）提取DNA。然后把所有国家的DNA样本送到澳大利亚昆士兰大学进行文库制备和测序。

使用引物799F（5′-AAC MGG ATT AGA TAC CCK G G-3′）和1193R（5′-ACG TCA TCC CCA CCT TCC-3′）（Redford等人，2010年）通过聚合酶链反应（PCR）扩增通用细菌16S rRNA基因，这两个引物在5′端进行了修改，以包含Illumina overhang接头，以便与i5和i7 Nextera XT指数兼容。PCR反应包含：2.5 μL DNA模板，4 μL 5× Phire Green反应缓冲液（Thermo Fisher），0.4 μL Phire Green Hot Start II DNA聚合酶（Thermo Fisher），200 μM每种dNTP，以及250 nM每种引物，总体积为20 μL。热循环条件如下：98°C预热45秒；然后30个循环：98°C 5秒，56°C 5秒，72°C 6秒；最后72°C 1分钟。使用SimpliAmp? 96孔热循环器（Applied Biosystems）进行扩增。空白提取对照和阴性扩增对照通过凝胶电泳进行验证。PCR产物使用18%的Sera-Mag Speed-beads Carboxyl Magnetic Beads（GE Healthcare）悬浮液进行纯化，添加比例为1.8:1（v/v）。然后用PicoGreen dsDNA定量试剂盒（Invitrogen）对扩增产物进行定量。从每个地点随机选取的8个重复样本中获取等摩尔浓度样本，然后将这些样本合并，并使用Illumina MiSeq仪器和30% PhiX Control v3（Illumina）以及MiSeq Reagent Kit v3（600个循环；Illumina）按照制造商的说明进行测序。2.5. 序列数据处理为了确保与Birt等人（2022年）的定义澳大利亚香蕉核心微生物组的基于操作分类单元（OTU）的框架直接比较，序列数据使用了相同的修改过的UPARSE流程（Edgar，2013年）进行处理。简要来说，正向读段使用USEARCH（v10.0.240）（Edgar，2010年）进行质量过滤，并以97%的序列同一性阈值对操作分类单元（OTUs）进行聚类。使用BLASTN（v2.3.0+）（Zhang等人，2000年）在QIIME2（Bolyen等人，2019年）中生成OTU表并分配分类学归属，参考的是Greengenes2数据库（McDonald等人，2023年）。然后使用BIOM（McDonald等人，2012年）过滤掉非细菌序列。将样本稀释至每个样本1400个读段以标准化测序工作量。所有α多样性指标都是使用QIIME2生成的。为了生成系统发育树，使用MAFFT（v7.221）（Katoh和Standley，2013年）对代表序列进行比对，并使用QIIME2（v2017.9）（Bolyen等人，2019年）进行掩码处理。使用FastTree（v2.1.9）（Price等人，2010年）根据这一比对生成以中点为根的系统发育树。为了为识别的分类单元提供初步的生态学背景，还使用FAPROTAX（Louca等人，2016年）基于16S rRNA基因的分类学进行了功能注释。每个样本中功能特征的相对丰度是转换成相对丰度后分配给每个功能的比例。FAPROTAX的输出包括完整的OTU表和74个核心OTU的子集，以及ASV表。这些注释仅作为从分类学推断出的假定性功能预测。2.6. 将序列与先前识别的核心细菌分类单元进行匹配使用USEARCH（Edgar，2010年）将我们当前研究的代表性OTU序列与Birt等人（2022年）报告的澳大利亚36个核心细菌的序列进行比较。相似度≥97%的序列被纳入潜在匹配。2.7. 建立全球核心微生物组为了建立全球核心微生物组，采用了类似于Birt等人（2022年）和Clarke等人（2026年）的方法。对于每个地点，绘制了每个OTU的出现频率（重复样本数）和相对丰度（图S1）。在≥50%的重复样本中以≥0.05%的相对丰度出现的OTU被选为每个地点每个区的候选核心OTUs。然后根据每个OTU作为候选核心的地点数量对其进行排名（排名1的占据分数最高）。排名分数≤50的OTU进一步分析，因为这涵盖了出现在四个或更多国家中的大多数候选核心OTUs。然后将大量土壤和菌根外生物圈的前50个分类单元合并，得到74个非冗余OTU。2.8. 统计分析使用ANOVA和Tukey的HSD事后比较方法评估了国家（澳大利亚、老挝、马来西亚、菲律宾、南非和乌干达）、地点和区域（菌根外生物圈和大量土壤）对单变量响应变量（α多样性指标，即观察到的（Sobs）和预测的（Chao1）OTU数量以及Shannon和Faith的系统发育多样性（PD）指数的主要和交互效应。使用PERMANOVA评估了国家、地点和区域对多变量响应（Hellinger转换的OTU相对丰度）的主要和交互效应。所有分析都是使用R（v4.3.0；R Core Team（2021）执行的）。3. 结果3.1. 国家、地点和区域对细菌α多样性的影响国家、地点和区域的主要和交互效应显著影响了细菌α多样性（表1）。来自老挝的样本中的细菌群落的α多样性低于其他国家的样本（图2）。在每个国家内，区域和地点的主要和交互效应解释了α多样性的显著比例（Shannon多样性指数），澳大利亚除外（表1）。区域在地点内对细菌α多样性有显著影响（图2中的星号表示）。表1. ANOVA和PERMANOVA模型的结果，表示国家（澳大利亚、老挝、马来西亚、菲律宾、南非和乌干达）、地点（采样位置）和区域（大量土壤与菌根外生物圈土壤）对细菌群落的α（Shannon多样性指数）和β（Hellinger转换的OTU相对丰度）多样性的主要和交互效应。星号表示P < 0.001（***）；P < 0.01（**）；P < 0.05（*）；P < 0.10（）。国家预测因子Shannon多样性指数群落组成dfF值P值空白单元F值R2（%）P值空白单元所有国家5208.7<0.001***25.519.6<0.001***地点1818.3<0.001***6.417.6<0.001***区域1192.2<0.001***24.33.7<0.001***国家:地点:区域2325.8<0.001***3.110.9<0.001***澳大利亚地点410.1<0.001***6.425.4<0.001***区域13.20.079.5.85.8<0.001***地点:区域41.30.2671.35.30.003**老挝地点310.9<0.001***5.115.6<0.001***区域1169.2<0.001***17.817.9<0.001***地点:区域311.5<0.001***4.012.1<0.001***马来西亚地点452.6<0.001***6.622.2<0.001***区域111.9<0.001***13.010.9<0.001***地点:区域43.80.008**2.58.4<0.001***菲律宾地点421.6<0.001***3.515.6<0.001***区域114.6<0.001***7.30.1<0.001***地点:区域422.1<0.001***2.00.1<0.001***南非地点323.3<0.001***11.635.8<0.001***区域15.40.025*4.95.1<0.001***地点:区域314.0<0.001***1.85.6<0.001***乌干达区域15.60.033*2.917.20.002**图2. 按国家分组的每个地点的细菌群落的α多样性（Shannon多样性指数），A) 大量土壤和B) 菌根外生物圈。误差条表示所有地点平均值的标准误差。大写字母表示基于Tukey事后分析的国家间显著差异。小写字母表示基于Tukey事后分析的同一国家内地点间的显著差异。星号表示不同区域的地点间有显著差异（P < 0.05）。3.2. 国家和地点对细菌群落组成的影响所有地点的细菌群落主要由Acidobacteriota、Actinobacteriota、Firmicutes和Proteobacteria组成（图3）。Gemmатимонадота在所有地点都以较低的相对丰度存在，而Bacteriodota的成员存在于除澳大利亚以外的所有国家。老挝、澳大利亚和马来西亚的Myxococcota相对丰度较高，而菲律宾、乌干达和南非的Nitrospirota代表性最强。pH <6.5的土壤倾向于含有更多的Dormibacterota（图3）。图3. 堆叠条形图显示了在至少一个地点中平均相对丰度≥1%的细菌类群的频率，A) 大量土壤和B) 菌根外生物圈样本。在每个门内，相对丰度<1%的类群被归类为“其他”。任何门没有类群达到≥1%相对丰度的被归类为“其他门”。A面板中条形上方显示了每个土壤的pH值。B面板中条形上方的星号表示不同区域的细菌群落组成有显著差异。在OTU水平上，细菌群落组成受到国家、地点和区域的主要和交互效应的显著影响，其中国家和区域解释了最大方差（表1）。地理位置较接近的地点（即同一国家和/或纬度的地点）的细菌群落组成更为相似，菲律宾的群落最为独特（图4A）。然而，在绘制加权UniFrac距离时，菲律宾的群落与其他国家的群落更为相似（图4B）。在东南亚国家（老挝、马来西亚和菲律宾），区域对群落组成的影响大于地点（表1），特别是在老挝，菌根外生物圈区域与众不同（图4B和S2B）。排序显示澳大利亚、马来西亚和南非的地点形成了不同的组，在这些组内，样本按区域聚集（图4A和S2A、C和F）。除了PH·S4地点外，每个地点内的细菌群落组成有显著差异，由于盆栽实验期间高死亡率，该地点只有三株植物（图3和S2D）。图4. A) 通过国家约束的加权UniFrac距离表示的细菌群落组成的冗余分析（RDA）排序，突出显示了差异。B) 通过国家约束的原则坐标（CAP）排序突出显示了细菌群落组成的差异。三角形和圆圈分别代表大量土壤（BS）和菌根外生物圈（ER）样本。A面板中的深蓝色数字代表OTU ID，与其他图中的ID一致。3.3. 定义跨国Musa spp.相关细菌分类单元列表在应用了≥50%的普遍性和≥0.5%相对丰度的阈值后（图S1），在所有24个地点中共识别出200个大量土壤的候选核心OTUs和243个菌根外生物圈的候选核心OTUs。其中，114个同时存在于两个区域，共计329个独特的候选核心OTUs（补充文件）。我们观察到一个OTU作为候选核心的地点数量（此后称为OTU的“占据率”）与它所占据的国家数量之间存在正相关（图5A）。候选分类单元根据其占据率进行排名，排名1到50之间的OTU占据率急剧下降，排名50之后趋势开始趋于平稳（图5B）。在四个或更多国家中检测到的所有OTU都排在1-50位之间（图5C），除了菌根外生物圈区域的OTU 110，它出现在四个国家中，但由于只在四个地点中被检测到，因此排名分为54位。此外，只在单个国家中检测到的OTU没有排在前50位之内（图5C），除了大量土壤中的OTU 158和OTU 222，它们分别排在第45和46位，因为它们在所有五个菲律宾地点都被检测到（图5C和S3）。图5. A) 每个OTU被识别为候选核心的地点和国家数量。B) OTU的排名分数及其占据的国家数量，以及C) OTU的排名分数与其被识别为候选核心的地点数量之间的关系；虚线红线表示区分候选核心分类单元和较低排名OTU的阈值（50）。D) 在排名前10、前20等中的候选核心OTUs与Birt等人（2022年）定义的核心分类单元的匹配百分比。平均组合相对丰度相对于大量土壤样本中的总OTU群落；红线表示所有核心OTU的平均相对丰度，虚线表示±1标准差。F) 相对于菌根外生物圈样本中的总OTU群落，识别出的核心OTU的平均组合相对丰度；红线表示所有核心OTU的平均相对丰度，虚线表示±1标准差。3.4. Musa spp.的74个核心细菌分类单元然后将来自大量土壤和菌根外生物圈的排名前50的核心分类单元合并成一个非冗余列表，得到74个核心OTUs（补充文件）。这些74个核心OTU仅占所有分类单元的0.6%（12,138个OTUs中的74个），但在大量土壤和菌根外生物圈中的总相对丰度中分别占25-52%（平均值=35.8，标准差=5.8）和24-74%（平均值=39.5，标准差=13.3）（图5E和F）。这74个核心分类单元主要由Acidobacteriota、Actinobacteriota、Firmicutes和Proteobacteria组成，其中许多排名最高的core OTUs属于Firmicutes，特别是Bacilliales_B目（图6）。此外，核心还包括来自Chloroflexota、Desulfobacterota、Dormibacterota、Gemmатимонадота、Nitrospirota和Verrucomicrobiota的代表（图6）。图6. 热图总结了使用占据率-排名框架从大量土壤和菌根外生物圈的Musa（ABB）‘Pisang Awak’的24个农场中识别出的74个非冗余核心细菌OTU的相对丰度（澳大利亚（AU）=绿色，老挝（LA）=红色，马来西亚（MY）=橙色，菲律宾（PH）=黄色，南非（ZA）=粉色，乌干达（UG）=紫色）。热图左侧的排名分数用浅蓝色（大量土壤）或紫色（菌根外生物圈）表示。排名分数为0表示该OTU在任何地点都不是该区域的候选核心。OTU ID显示在家族和属标签旁边的方括号中。图中显示的红色OTU与Birt等人（2022年）识别出的核心OTU的序列（相似度≥97%）相匹配。最后，我们旨在确定本研究中确定的74个突出OTU是否也在我们之前仅定义澳大利亚核心分类单元的研究中被识别（Birt等人，2022年）。由于我们只采样了大量土壤和菌根外生物圈，我们没有期望识别出Birt等人（2022年）所采样的其他区域（如假茎和叶子）的核心分类单元。我们确认了所有七个澳大利亚核心OTU在大量土壤中的密切相关分类单元（序列相似度≥97%）以及在我们列出的74个跨国OTU中，15个OTU中有11个在菌根外层中存在（见图6和S4；Birt等人，2022年）。此外，我们还检测到了其他组别中的四个核心OTU，表明Birt等人（2022年）确定的核心OTU在多个国家的香蕉系统中都有存在。所有匹配的OTU序列及详细信息均包含在补充文件中，同时使用了FAPROTAX.4生成了基于分类学的潜在功能注释。讨论：世界各地的研究一致报告香蕉微生物组中存在类似的细菌属，这表明可能存在在全球范围内持续存在的核心谱系（Cabanás等人，2021年；Kaushal等人，2020年；Ong等人，2024年；Shen等人，2022年，Shen等人，2015年）。对于其他作物，如咖啡（Bez等人，2023年）、苹果（Abdelfattah等人，2021年）、大麦（Zhou等人，2024年）、小麦（Simonin等人，2020年）和柑橘（Xu等人，2018年），已经通过正式分析确定了跨国界的细菌谱系。相比之下，关于香蕉核心细菌的研究范围在地理上较为有限，这意味着虽然已经描述了国家或区域性的核心群落，但尚未建立跨国界的香蕉核心微生物组。在这里，我们研究了从澳大利亚、非洲和亚洲的24个农场收集的土壤中生长的香蕉的核心细菌微生物组。我们的实验设计基于Birt等人（2022年）建立的框架，用于描述澳大利亚香蕉的核心微生物组，并涵盖了广泛的土壤、气候和管理条件。关键的是，我们识别出了74个核心细菌分类单元，其中包括Birt等人（2022年）在同一组别中确定的22个核心OTU的18个密切相关分类单元（序列相似度≥97%）（见补充文件）。这74个核心OTU是生物库建设、功能研究和生态学研究的合理目标，以利用微生物组带来的好处，从而提升香蕉生产系统。未来的工作应研究香蕉核心分类单元与其他作物之间的重叠程度。这样的比较有助于确定某些核心谱系是否广泛存在于不同的植物宿主中，或者与特定作物谱系有更强的关联。对于香蕉来说，这个问题特别有趣，因为栽培的Musa基因型之间关系密切且通过克隆方式繁殖，先前的研究表明与土壤变异相比，香蕉基因型对细菌群落组成的影响相对较小（Birt等人，2022年）。然而，更广泛地说，宿主的系统发育距离通常与根微生物组的相似性呈负相关（Yeoh等人，2017年）。因此，澄清香蕉与其他作物核心微生物组之间的重叠程度有助于指导跨作物生物库建设、功能研究和合作开发基于微生物组的策略。

4.1. 不同国家和地区的相似性和差异：在定义核心微生物组时，捕捉已知影响因素（如地理和土壤特性）的变化是必不可少的（Xu等人，2018年）。先前的研究表明环境和土壤条件对香蕉的微生物多样性和组成有特别强的影响（Souza等人，2013年；Kaushal等人，2020年；Birt等人，2022年；Shen等人，2022年）。相比之下，不同Musa物种基因型和品种之间的微生物组差异似乎相对较小（Birt等人，2022年）。因此，我们描述了每个国家多个地点的单一种植基因型（Pisang Awak，ABB）的微生物组，以捕捉与土壤、气候和管理相关的代表性变异。澳大利亚、老挝、马来西亚、菲律宾、乌干达和南非的Musa物种的细菌群落主要由放线菌门、厚壁菌门和变形菌门的代表组成，这与巴西（Souza等人，2013年）、中国（Zhou等人，2019年；Shen等人，2022年）、印度（Thomas和Soly，2009年）和越南（Tran和Nguyen，2024年）的研究结果一致。绿弯菌门、休眠杆菌门、 Gemmatimonadota门和硝螺菌门的成员也在多个国家中普遍存在，但并非在所有国家都被检测到。当考虑群落内分类单元之间的进化距离时，香蕉的微生物组差异较小，表明不同的OTU属于密切相关的谱系（见图4B）。然而，在OTU层面，不同国家之间的细菌群落成员存在显著差异，强调了考虑多个国家的重要性（见表1和图4A）。尽管每个地点的历史细节不可用，但国家间香蕉微生物组的差异可能部分反映了不同的管理实践、土地利用和种植历史，以及土壤和气候条件。虽然我们的研究并非旨在全面分析环境因素，但所有国家的土壤pH值都进行了测量，为群落组成的模式提供了一些额外的背景信息。补充分析显示，土壤pH值与整个细菌群落及包含74个核心分类单元的子集的变化显著相关，而组别也是变化的重要来源（见图S5）。由于pH值是在站点层面测量的，而不是针对单个盆栽进行的，因此这些分析应谨慎解释；尽管如此，它们支持土壤化学成分，特别是pH值的变化会导致国家间香蕉相关细菌群落差异的观点。

4.2. Musa物种的常见细菌谱系：通过使用丰度-流行度阈值，我们分别从大量土壤和菌根外层识别出了200个和243个候选核心分类单元。为了优先考虑核心分类单元，我们根据它们的“核心性”（即在丰度-流行度阈值以上出现的站点数量）对候选OTU进行了排序。这种方法避免了任意的核心分类，并尊重一些分类单元可能局限于一个国家的分布情况。此外，这种方法可以更广泛地应用，例如许多原生动物和后生动物分类单元由于体型较大而更难以被动传播（Martiny等人，2006年）。重点关注每个组别中的前50个OTU，我们生成了一个在多个国家都存在的74个核心分类单元的最终列表（见图6）。在74个核心OTU中，我们确认了所有七个澳大利亚核心OTU在大量土壤中的存在，以及Birt等人（2022年）最初确定的15个菌根外层OTU中的11个（见图6和S4）。值得注意的是，这些OTU是所有国家中排名最高的OTU之一（即接近排名第一），再次证实了它们作为Musa物种核心分类单元的空间持久性和地位（见图5D和S4）。此外，之前在澳大利亚检测到的七个大量土壤和九个菌根外层核心OTU（Birt等人，2022年）在澳大利亚土壤中再次被确认为核心，表明这些核心分类单元不仅在空间上是一致的，在时间上也是一致的。鉴于本研究中的植物是无病状态的，这些核心分类单元很可能是“健康”微生物组的成员，它们要么有益，要么是无害的。核心分类单元非常丰富，占总相对丰度的24-74%，而仅占检测到的总OTU的0.6%（见图S4）。核心分类单元在多样化的环境中高度丰富的事实表明它们在宿主适应度中起着重要作用（Lasa等人，2019年）。此外，它们在群落中的显著地位表明它们可能对其他分类单元有影响力。然而，由于这些生态系统的复杂性和变异性，解码单个分类单元在微生物组中的具体角色及其与宿主植物的相互作用是具有挑战性的。因此，本研究中确定的74个核心OTU为未来探索它们对可持续农业实践的潜在贡献提供了有针对性的起点。

4.3. 核心分类单元是未来工作的合理焦点：越来越多的人认为，要利用微生物组在农业中的益处，我们需要识别与每种作物相关的核心分类单元（Toju等人，2018年）。识别核心分类单元为分离工作和后续的生态学研究提供了焦点，这有助于产品开发和产业参与。因此，识别在多个国家中都属于香蕉核心微生物组的分类单元是迈向基于微生物组的管理策略的关键第一步。从管理角度来看，我们的结果表明，操纵香蕉微生物组的努力应优先考虑持续存在的核心分类单元作为分离、生物库建设和功能测试的候选对象。下一步是确定这些分类单元中的哪些贡献了理想的功能，以及农艺措施（如施肥、覆盖作物管理、有机改良和病害抑制轮作）如何在田间条件下影响它们的丰度和活性。强调核心分类单元很重要，因为根际的竞争性质通常限制了引入细菌的建立能力，从而导致效果和持久性的差异（Trivedi等人，2020年）。相比之下，在地理上不同的生产系统中反复出现为核心成员的分类单元可能为基于微生物组的管理提供更稳健的目标（见图5）。因此，培养这些核心分类单元是下一步的关键。Paterson（2024年）已经从澳大利亚分离出了36个香蕉相关分类单元的24个密切相关分类单元（Birt等人，2022年），其中大多数我们现在已证明在多个国家中普遍存在且为核心成员。这样的分离物将允许更详细地研究核心OTU的生态学和功能，帮助确定它们可能为香蕉生产系统提供的生态系统服务及其管理方式。文献中的间接证据或补充文件中提供的潜在功能推断可以与核心分类单元列表结合使用，以指导研究人员从何处开始。例如，Sphingomonas（即OTU 16）、Sphingobium（即OTU 10）和Streptomyces（即OTU 18和12）属的成员已被证明具有抗真菌特性，鉴于它们在抑制Musa物种病害的土壤中的一致存在，被认为是对抗镰刀菌枯萎病的候选者（Shen等人，2019年；Hong等人，2020年；Qi等人，2021年；Zhu等人，2021年）。因此，如果研究人员想要确定一个可能抑制镰刀菌枯萎病的核心分类单元，他们应该从OTU 10、12、16和18的分离物培养开始进行研究，而不是其他核心分类单元。然而，为此，我们必须首先为每种作物生成核心分类单元列表，获得分离物培养物，并将分离物存储在国际可用的生物库中。鉴于核心分类单元的高相对丰度和已知作为枢纽或“关键”物种的作用（Birt等人，2022年），进一步研究农业管理措施如何影响这些分类单元也同样重要。这可以通过非培养方法实现，特别是在培养不可行的情况下。未来的和现有的研究可以通过与核心分类单元进行序列匹配来增强对香蕉微生物组动态的研究。例如，Clarke等人（2024年）研究了磷肥施用对香蕉相关微生物组的影响，并与Birt等人（2022年）提供的核心列表进行了序列匹配，从而增强了研究的影响。通过这种方式，核心分类单元列表促进了非正式的全球合作。

5. 结论：在这里，我们对来自多个国家和地区24个农场的Musa物种的大量土壤和菌根外层微生物组进行了大规模的生态学研究。我们的结果揭示了香蕉微生物组在不同国家之间的显著差异，强调了在广泛的土壤、气候和管理条件下定义核心分类单元的重要性。通过应用丰度-占用标准，我们识别出74个核心分类单元，它们占大量土壤和菌根外层总群落的很大比例（24-74%）。22个OTU与Birt等人（2022年）之前的研究结果重叠，表明它们在空间和时间上都是持续的。正如Birt等人（2022年）所展示的，不同的植物组别有不同的核心分类单元，我们仅捕获了来自大量土壤和菌根外层的核心分类单元，未来的工作应该研究内生层和叶层中的其他组别，以定义全植物的跨国界核心微生物组。这个列表可以指导国际努力，为Musa物种的核心分类单元建立生物库，从而促进对其生态作用和实际应用的研究。作为这项研究的一部分，所有合作实验室都准备了大量土壤和根际样本的甘油储存，以便利分离工作，为香蕉属（Musa spp.）微生物组的国际生物库奠定了基础。即使没有分离出的菌株，任何研究香蕉属微生物组的研究人员也可以将这些序列与74个核心分类单元进行比较，从而在广泛的实验和环境条件下分析这些分类单元的生态学特性。通过在作物生态系统中应用这些方法，我们可以开始全面了解如何以及何时实施特定的管理措施来有效调控微生物群落，推动可持续农业的发展。

**CRediT作者贡献声明：**

- Anna-Belle C. Clarke：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、项目管理、方法学研究、数据分析、数据整理
- Christine Rose Ansale：撰写、审稿与编辑、方法学研究、数据分析、数据整理
- Loren Banayag：撰写、审稿与编辑、方法学研究、数据分析、数据整理
- Sheryl Bayang：撰写、审稿与编辑、方法学研究、数据分析、数据整理
- Sheryl Bothma：撰写、审稿与编辑、方法学研究、数据分析、数据整理
- Khonesavanh Chittarath：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源调配、项目管理工作、方法学研究、资金筹集、数据分析、数据整理
- Merlina Juruena：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源调配、项目管理工作、方法学研究、资金筹集、数据分析、数据整理
- Georgina Karamura：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源调配、方法学研究、数据分析、数据整理
- Hazel R. Lapis-Gaza：撰写、审稿与编辑、监督工作、方法学研究、数据分析、数据整理
- Cesar Limbaga：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源调配、项目管理工作、资金筹集
- Rebecca Lyons：撰写、审稿与编辑、监督工作、方法学研究、数据分析
- Jiarui Sun：撰写、审稿与编辑、监督工作、软件开发、方法学研究、数据整理
- Altus Viljoen：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源调配、项目管理工作、方法学研究、数据分析、数据整理
- Diane Mostert：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源调配、项目管理工作、方法学研究、数据分析、数据整理
- Noor Baity Saidi：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源调配、项目管理工作、方法学研究、数据分析、数据整理
- Nurul Shamsinah Mohd Suhaimi：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源调配、项目管理工作、方法学研究、数据分析、数据整理
- Anthony B. Pattison：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源调配、项目管理工作、资金筹集、概念构思
- Paul G. Dennis：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证工作、监督工作、软件开发、资源调配、项目管理工作、方法学研究、资金筹集、数据分析、概念构思

**资助说明：**
我们衷心感谢澳大利亚国际农业研究中心通过研究项目 Hort/2018/192 对本研究的资助和支持。