探索基于NGS的MET扩增评估中基因拷贝数截断值的确定及其与非小细胞肺癌MET抑制剂疗效的临床相关性

《Lung Cancer: Targets and Therapy》：Exploratory Identification of Gene Copy Number Cut-Off for NGS-Based MET Amplification Assessment and Clinical Relevance to MET Inhibitor Outcomes in Non-Small-Cell Lung Cancer

　　

摘要 MET扩增是非小细胞肺癌（NSCLC）的关键致癌驱动因素，也是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）获得性耐药的主要机制。目前，基于下一代测序（NGS）的检测在临床实践中应用日益广泛，但不同NGS平台缺乏统一的MET扩增判定标准及潜在可行动阈值。本研究为多中心联合研究，旨在通过肿瘤组织与NGS分析优化MET扩增的截断值。训练队列采用5种NGS panel检测MET基因拷贝数（GCN），并以荧光原位杂交（FISH）为参考标准，通过受试者工作特征（ROC）曲线分析确定最优截断值（特异性100%，敏感性66.7%）。结果在独立队列中验证，并探索MET扩增与NSCLC患者MET抑制剂疗效的相关性。训练队列（n=21）中，MET GCN最优截断值为6.55，曲线下面积（AUC）为0.9，准确率为85.7%；FISH检出的所有MET多体（n=2）均可通过NGS检出，5种NGS panel与FISH的一致性良好，准确率范围为75.0%–85.7%。验证队列（n=29）中，NGS检测性能良好，准确率为79.3%；MET GCN≥6.55的患者中位无进展生存期显著长于MET GCN<6.55的患者（风险比=0.42；p=0.03）。本研究发现，NGS检测的MET GCN截断值6.55与MET扩增及MET靶向治疗患者的更长无进展生存期相关，但由于研究为回顾性设计且样本量有限，该结果属于探索性发现，需在更大规模前瞻性队列中进一步验证后方可推广至临床。

论文解读

研究背景

间质上皮转化因子（MET/c-MET）基因编码肝细胞生长因子（HGF）的跨膜酪氨酸激酶受体，其通路异常激活可促进肿瘤细胞增殖、迁移、存活及侵袭转移。MET激活方式包括MET第14号外显子跳跃突变、MET基因扩增、c-MET过表达及MET融合。MET扩增可分为原发性和获得性，原发性MET扩增仅在1%–5%的非小细胞肺癌（NSCLC）中作为主要驱动变异，而5%–50%携带表皮生长因子受体（EGFR）突变的NSCLC患者在接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）治疗后，会获得性出现MET扩增介导的耐药。目前MET扩增检测方法包括荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学（IHC）和下一代测序（NGS），其中FISH是临床判定的金标准。既往临床试验显示，MET抑制剂在MET扩增阳性NSCLC患者中疗效与MET基因拷贝数（GCN）水平相关，但不同研究中NGS定义的MET扩增阈值存在差异，且中国多家独立医学检验实验室采用的NGS平台、数据分析流程及生物信息学算法不统一，缺乏统一的截断值选择标准，导致NGS与FISH检测结果一致性波动较大，给临床解读带来困扰。因此，探索统一的NGS检测MET扩增截断值，并明确其与MET靶向治疗疗效的相关性具有重要临床意义。该研究发表于《Lung Cancer: Targets and Therapy》。

关键技术方法

本研究分为训练队列与验证队列两部分。训练队列纳入21例经组织学或细胞学确诊的局部晚期或转移性NSCLC患者，收集足够肿瘤组织分别进行FISH检测及5家实验室（燃石医学、艾德生物、世和基因、吉因加、臻和科技）的独立NGS平行盲测。验证队列纳入29例接受MET抑制剂治疗的NSCLC患者，均具备治疗前FISH与NGS数据。NGS检测采用各实验室常规panel，有效测序深度≥500×，通过覆盖均一化、正常样本池比对计算拷贝数（CN），结合肿瘤细胞含量校正得到MET绝对基因拷贝数（GCN）。FISH检测采用商业化探针试剂盒，由两名病理医师独立判读，争议病例由第三位资深病理医师裁定。统计分析采用ROC曲线确定最优截断值，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Cox回归模型计算风险比（HR）。

研究结果

临床特征

训练队列中位年龄63岁（范围47–79岁），男性占61.9%，腺癌占66.7%；验证队列中位年龄58岁（范围32–76岁），男性占61.9%，腺癌占66.7%，96.6%为IV期，58.6%携带EGFR突变并接受EGFR-TKIs联合MET-TKIs治疗，41.2%为EGFR突变阴性仅接受MET-TKIs治疗。FISH结果显示，训练队列MET扩增阳性率为42.9%（9/21），含7例局灶性扩增、2例多体；验证队列MET扩增阳性率为58.6%（17/29），均为局灶性扩增。

探索性MET GCN截断值的确定

训练队列中整合5种NGS panel的MET GCN数据，以FISH为参考进行ROC分析，AUC为0.94（95%CI=0.84–1.00）。为避免将患者错误归类为MET扩增阳性而导致不恰当治疗，优先保证特异性，最终选定特异性100%、敏感性66.7%、准确率85.7%的截断值6.55，此时阴性预测值为80.0%，阳性预测值为100%，且FISH检出的2例MET多体均被NGS正确识别。与临床常用截断值5相比，截断值6.55的特异性更高（各panel特异性81.8%–100% vs 63.6%–83.3%），准确率相近（71.4%–85.7% vs 71.4%–85.7%），可将3例FISH阴性但截断值5判定为阳性的病例正确归类为阴性。此外，以FISH GCN≥10为参考时，NGS最优截断值为8.63，AUC为88.7%，特异性100%，敏感性60.0%。

MET GCN最优截断值的验证及其与MET靶向治疗疗效的关系

验证队列中，以FISH为参考，NGS检测MET扩增的AUC为0.86（95%CI=0.68–1.00），截断值6.55的特异性为91.7%，敏感性为70.6%，准确率为79.3%，优于截断值5的特异性（83.3%）。疗效分析显示，MET GCN≥6.55的患者中位无进展生存期（mPFS）为7.3个月，显著长于MET GCN<6.55患者的2.5个月（HR=0.42，95%CI：0.20–0.96，p=0.027）；客观缓解率（ORR）为76.9%，是后者的2.5倍（31.3%，p=0.032）。单因素及多因素Cox回归分析证实，MET GCN≥6.55是MET靶向治疗PFS获益的独立影响因素（HR=0.42，p=0.031），年龄、性别、EGFR突变状态、治疗线数及脑转移状态均与PFS无显著相关性。

讨论与结论

MET扩增既是NSCLC的致癌驱动因素，也是EGFR-TKIs的重要获得性耐药机制。尽管FISH是当前MET扩增检测的金标准，但NGS可同时检测多种基因组变异，具有节省样本、缩短周转时间及成本效益高的优势，已成为肺癌常规分子诊断的重要组成部分。然而，不同NGS平台的MET扩增定义尚未统一，导致临床解读困难。本研究通过多中心数据整合，探索性提出NGS检测MET扩增的最优GCN截断值为6.55，在训练队列和验证队列中均表现出高特异性及良好的临床疗效分层能力，可帮助富集更可能从MET靶向治疗中获益的患者。与常用截断值5相比，截断值6.55显著降低了假阳性率，减少了不必要的治疗暴露。

研究同时指出局限性：一是回顾性设计且样本量有限，虽在独立队列验证但仍需更大规模前瞻性研究确认；二是不同NGS平台的技术差异可能影响结果可比性；三是治疗方案不统一（含单药及联合治疗），部分患者因临床实际情况在FISH阴性但NGS提示高拷贝数时接受了MET-TKIs治疗；四是未分析截断值在不同治疗线中的预测价值差异。

结论部分明确，本研究探索性确定的NGS检测MET GCN截断值6.55与MET扩增及MET靶向治疗患者的更长无进展生存期相关，但由于研究设计的限制，该结果仍需在前瞻性多中心队列中进一步验证，并在临床决策应用前完成标准化与可重复性测试。