针刀疗法通过TGF-β1/Smad通路改善膝关节骨关节炎兔模型的关节软骨纤维化

《Orthopedic Research and Reviews》：Acupotomy Ameliorates Articular Cartilage Fibrosis in a Rabbit Model of Knee Osteoarthritis via the TGF-β1/Smad Pathway

　　摘要
目的：本研究旨在探讨针刀术是否能够调节与TGF-β1/Smad通路相关的因子活性，从而减轻膝关节骨关节炎（KOA）中的软骨纤维化程度，并缓解软骨退化。

方法：采用改良的Videman长期膝关节固定方法在伸展位建立KOA模型。在针刀干预前后，分别使用Lequesne MG行为评分系统进行评估。通过光镜和扫描电子显微镜（SEM）观察软骨的形态和结构。利用Western blotting和实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测针刀处理后的KOA兔软骨组织中Smad3、Smad7、TGF-β1、I型胶原（Col-I）、II型胶原（Col-II）和III型胶原（Col-III）的蛋白水平和mRNA表达。

结果：与对照组相比，KOA组的Lequesne MG评分显著升高。组织学上，KOA组的软骨出现裂纹、基质溶解、Col-II含量减少以及明显的纤维化。TGF-β1/Smad通路中的TGF-β1和Smad3表达显著上调，而Smad7表达下调。针刀治疗降低了Col-I和Col-III的蛋白及mRNA表达水平，减轻了软骨细胞外基质的Col-II丢失，并有效延缓了KOA兔的软骨退化。这一过程可能是通过调节TGF-β1/Smad通路相关的因子实现的。

结论：在KOA兔模型中，针刀术通过调节与TGF-β1/Smad通路相关的因子，减轻了纤维化程度，从而延缓了软骨退化。

关键词：软骨纤维化；TGF-β1/Smad通路；针刀术；膝关节骨关节炎

引言：
膝关节骨关节炎（KOA）是由关节囊增厚和退化、继发性骨赘形成、滑膜炎症病变、软骨退化以及软骨下骨硬化等退行性病理变化引起的。预计到2050年，其发病率将上升至74.9%。

KOA的主要病理特征是关节软骨的退化。关节软骨的形成和功能受机械力的影响。研究表明，异常的机械应力可通过氧化应激、凋亡和铁死亡等机制导致软骨退化。膝关节中机械力的不平衡通常被认为是KOA发生和发展的关键致病因素。因此，研究机械刺激对软骨细胞的影响对于更好地理解该疾病的病理生理机制并开发有效的临床干预措施至关重要。

关节软骨纤维化是KOA的重要病理特征。关节软骨是一种无血管的结缔组织，依赖于滑液中的氧气和营养物质扩散。在健康状态下，软骨细胞主要通过糖酵解维持代谢平衡，仅有25%的能量依赖氧化磷酸化。然而，膝关节的损伤或异常负荷会破坏这种平衡，导致免疫代谢紊乱、糖酵解级联反应失调、乳酸积累和局部微环境酸化。这些变化会干扰细胞外基质（ECM）的生成，影响ATP合成，限制细胞活力和存活，并触发或加剧软骨纤维化过程。软骨纤维化与胶原网络的不平衡密切相关。在KOA中，II型胶原（Col-II）含量减少而I型胶原（Col-I）含量增加，从而影响软骨的结构完整性。此外，III型胶原（Col-III）以更细的纤维形式存在，与其他胶原类型协同作用，提供必要的结构支持和机械强度，并参与软骨的纤维化过程。纤维化过程中，积累和交联的胶原会降低ECM的柔韧性，妨碍关节活动；蛋白聚糖的紊乱会影响水分保持和减震能力，损害软骨的正常生物力学特性。

TGF-β/Smad信号通路在细胞生物学和疾病进展中起着关键作用，主要通过调节细胞增殖、生长、分化、凋亡和ECM重塑等过程。近年来的研究表明，该通路在纤维化疾病中具有重要意义。机制上，TGF-β的激活通过Smad2/3介导的信号通路促进ECM成分（包括胶原和纤维连接蛋白）的合成和沉积。Jihee Kim的研究发现，瘢痕组织这种常见的皮肤纤维化疾病的特点是局部机械张力增加以及TGF-β和Col-I的显著上调，提示TGF-β/Smad通路可以被机械刺激激活。

针刀术是一种结合针灸和外科刀具技术的疗法，通过放松膝关节周围的软组织（包括肌肉、肌腱和韧带）来缓解关节疼痛并改善活动能力。我们之前的研究已证明，“肌腱调节促进骨骼修复”的针刀疗法可以改善膝关节周围软组织的生物力学特性并延缓软骨退化。然而，目前尚不清楚针刀术的机械效应是否能够调节KOA软骨的纤维化变化。因此，本研究聚焦于软骨纤维化问题，旨在探讨针刀术的机械效应是否可以通过TGF-β/Smad信号通路有效延缓KOA软骨的纤维化变化，从而对软骨发挥保护作用。

材料与方法：
动物种类与分组：
从中国北京福龙腾飞实验动物研究院购买了18只健康的6个月大新西兰雄性兔子（体重2.5±0.5 kg，证书编号：SYXK2018–0041），并将它们饲养在同一研究所的实验室中。饲养环境为12小时光照/12小时黑暗周期、单笼饲养、自由进食和饮水、恒温23±1°C及相对湿度50%。适应一周后，使用随机数字表法随机选取6只兔子作为对照组。剩余兔子采用改良的Videman方法（左后肢伸展位固定）建立KOA模型。模型建立后，将兔子随机分为模型组（KOA组）和针刀组（针刀组），每组各6只。所有实验操作均严格遵守2006年中华人民共和国科技部发布的《实验动物福利管理指南》，并经过北京大学人民医院动物护理与使用委员会的伦理审查（批准编号：2020pHE100）。

模型建立与评估：
适应一周后，采用改良的Videman方法建立KOA模型。禁食12小时后，通过边缘耳静脉注射3%戊巴比妥钠溶液（Bioway，北京）进行麻醉（剂量为30 mg/kg）。若角膜反射明显减弱或消失，且皮肤用止血钳夹住时无疼痛感，则表明麻醉效果合适。麻醉期间每15分钟向兔子眼睛滴入2–3滴润滑剂以防干燥。将兔子固定于手术台上，剃除左后肢的毛发。保持左后肢伸展位，用双面泡沫胶带从腹股沟区域缠绕至踝关节下方。在腹股沟根部放置吸水棉布以防擦伤，并在泡沫胶带表面缠绕树脂绷带并施加适度张力。再用聚合物绷带加固，最后覆盖防咬合绷带以固定住肢体。为监测肢体血供，保留兔子的脚趾和部分足背暴露在外。若发现轻微肿胀，应及时调整固定装置；出现严重肿胀、溃疡或组织坏死等症状时，应立即移除固定装置。肿胀消退后，继续固定4周。四周后，使用Lequesne MG行为评分系统进行模型评估。

干预方法：
对照组：在无任何治疗干预的相同条件下饲养兔子，在其他组的干预期间以相同方式操作。
KOA组：干预措施与对照组相同。
针刀组：在成功建立模型后进行针刀治疗。固定兔子并剃除受影响膝关节上的皮肤以暴露干预部位。选择股内侧肌、股外侧肌、股直肌和股二头肌的肌腱附着点以及膝关节周围的1–2个肌筋膜触发点作为针刀治疗点。使用一次性针刀（0.3 mm×25 mm）按四步程序进行治疗，每周一次，连续四周。

行为评估：
使用Lequesne MG行为评分系统，在干预前后分别使用改良的Lequesne MG膝关节骨关节炎评分系统对两组进行行为评估，包括膝关节对刺激的反应、步态变化、活动范围（ROM）和肿胀情况。正常兔子的膝关节评分为0分，1–4分为轻度KOA，5–8分为中度KOA，8分以上为重度KOA。

样品收集：
行为评估后，对所有兔子实施深麻醉并空气栓塞处死，严格按照无菌操作规程进行。然后打开左膝关节以完全暴露关节腔。用无菌手术刀小心准确地刮取足够量的软骨组织，确保收集组织的完整性和准确性。收集的软骨组织立即放入预标记的冷冻管中，用于Western Blot和RT-PCR分析，随后迅速转移到液氮罐中，并储存在-80°C以最大程度保留蛋白活性和稳定性。

关节软骨的扫描电子显微镜（SEM）分析：
将取得的骨-软骨下组织先用生理盐水冲洗，再用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗3次，每次3分钟。将标本修剪成3×3×5 mm的块状，置于戊二醛-多醛溶液中固定24小时。固定后的标本用0.1 mol/L醋酸镉缓冲液冲洗，然后用1%锇四氧化物进行后固定2小时。冲洗后，用乙醇进行梯度脱水处理，转移至异戊酸丁酯中过夜保存。干燥后，用二氧化碳临界点干燥器处理标本，将其贴在标本支架上，真空条件下镀金以增强导电性，并在扫描电子显微镜（SEM）下观察和拍摄图像。

关节软骨的Masson染色：
关节软骨组织先用10%中性缓冲甲醛固定，随后进行常规脱水和石蜡包埋。切割3 μm厚的连续切片，在室温下甲醇脱蜡8–12小时，然后每次用蒸馏水冲洗3分钟。接着用天蓝试剂染色2–3分钟，再用蒸馏水冲洗两次。在酸性分化溶液中差异染色几秒钟后用蒸馏水冲洗，再用藏红溶液染色10分钟，用磷酸钼酸处理后用苯胺蓝溶液染色5分钟。多余染料用弱酸溶液冲洗，再用覆盖剂处理2分钟，脱水两次后用二甲苯透明包埋。

Western Blotting：
从-80°C的冰箱中取出关节软骨样本进行研磨，收集到离心管中。按RIPA裂解缓冲液（Servicebio，武汉）与PMSF（Servicebio）100:1的比例配制裂解液用于总蛋白提取。使用BCA蛋白测定试剂盒（Solarbio，武汉）定量蛋白质浓度。电泳在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上进行，电压为80伏特，持续2小时，然后将凝胶转移到0.22微米的PVDF膜（Millipore，波士顿，马萨诸塞州，美国）上，并在100伏特下处理30分钟。随后，将PVDF膜放入快速封闭溶液中（Solarbio，北京，中国）。接着，将膜在4°C下与一级抗体稀释缓冲液一起孵育过夜。使用的一级抗体包括：Col-I（1:1000）、Col-II（1:2000）、Col-III（1:5000）、TGF-β1（1:1000）、Smad-3（1:2000）、Smad-7（1:5000）和β-actin（1:10,000）。第二天，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）结合的二级抗体在室温下孵育1小时，并使用超高灵敏度的ECL化学发光试剂盒检测蛋白质条带。所使用的成像系统软件是Image Lab? Touch Software（版本2.4.0.03），成像器型号为ChemiDoc? MP。化学发光印迹用于成像。在化学发光过程中，优先选择最佳自动曝光模式；如果该模式无法显示标记，则选择手动曝光模式。蛋白质条带的灰度值使用ImageJ软件（罗克维尔，马里兰州，美国）进行分析。

**实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）分析**
关节软骨样本的获取方法与Western blotting相同。总RNA使用RNA提取试剂（Servicebio，武汉，中国）进行匀浆处理。根据制造商的说明，将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix（Servicebio，武汉，中国）进行cDNA的实时定量聚合酶链反应扩增。针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、Col-I、Col-II、Col-III、TGF-β1和Smad-7设计了特异性PCR引物。rt-PCR的反应条件如下：初始变性95°C 5分钟，接着是45个循环，每个循环包括95°C 30秒变性、60°C 30秒退火和72°C 30秒延伸。目标基因的相对表达水平通过2^(-ΔΔCt)方法计算，并以GAPDH的mRNA表达水平为基准进行归一化。正向和反向引物的序列列在表1中。

**统计分析**
所有数据使用SPSS 20.0进行分析，结果表示为平均值±标准差（±s）。对于符合正态分布和方差同质性的数据，进行单因素方差分析（ANOVA），并使用最少显著差异（LSD）检验进行组间比较。如果数据同时不符合正态分布和方差同质性，则应用非参数检验（Mann–Whitney U检验）。统计显著性水平设定为α=0.05。

**结果**
**针刺术降低骨关节炎评分**
在建模后（干预前），与对照组相比，KOA组和针刺组的Lequesne MG评分显著更高（P<0.01，P<0.05）。然而，KOA组和针刺组之间的Lequesne MG评分无显著差异（P>0.05），这表明经过4周的左后肢固定（采用改良的Videman方法），两组兔子均表现出明显的行为变化，如运动障碍和受损肢体的跛行，表明模型建立成功，基线一致，组间具有可比性。干预后，与对照组相比，KOA组的Lequesne MG评分显著升高（P<0.01）；与KOA组相比，针刺组的Lequesne MG评分呈现明显下降趋势（P>0.05），表明针刺治疗可以改善KOA兔子的行为表现（图1）。

**针刺术改善KOA兔子的软骨形态损伤**
使用Masson染色观察关节软骨和胶原纤维。通常，胶原纤维和软骨被染成蓝色，细胞质和纤维蛋白被染成红色，细胞核被染成蓝黑色。在对照组中，四层软骨结构清晰可见。KOA组的软骨表面粗糙，有裂纹，染色丧失，纤维化明显，胶原纤维紊乱、局部断裂和降解。在界标附近观察到许多火焰形状的深红色突起，这些突起相对较高且分布广泛。关节软骨表面的损伤明显。与KOA组相比，针刺组的软骨染色丧失减少，纤维排列更有序，纤维化显著减轻，界标完整（图2）。

**SEM观察软骨纤维化**
使用SEM观察软骨基质和胶原纤维。在对照组中，软骨基质均匀，未见软骨下骨暴露，胶原纤维大小一致，呈松散连续的网络状排列，表面附着少量蛋白质颗粒。KOA组的软骨基质广泛溶解，有明显的凹陷，胶原纤维部分增厚，伴有大量溶解、断裂和排列紊乱。针刺组中，软骨基质在小范围内溶解，胶原纤维略微增厚并部分溶解，表面附着大量蛋白质颗粒（图3）。

**Western blotting和RT-PCR检测**
Western blotting和RT-PCR用于检测Col-I、Col-II和Col-III的蛋白质和基因表达水平，以评估软骨纤维化的程度。与对照组相比，KOA组的Col-I和Col-III蛋白质表达异常高（P<0.01），而Col-II蛋白质表达异常低（P<0.01）。与KOA组相比，针刺组的Col-I蛋白质含量显著降低（P<0.05），Col-III蛋白质含量显著降低（P<0.01），Col-II蛋白质含量显著增加（P<0.01）。这些结果表明针刺疗法可以调节不同类型胶原的合成和沉积，从而缓解软骨纤维化（图4）。图4 针刺对KOA兔子软骨胶原蛋白的影响。(A) Col-I、Col-II和Col-III的Western Blot图像；(B–D) 各组之间Col-I、Col-II和Col-III蛋白表达的比较；(E–G) 各组之间Col-I、Col-II和Col-III基因表达的比较。与对照组相比：**P < 0.01；与KOA组相比：##P < 0.01, #P < 0.05。阅读该图的详细描述。

图像A显示了带有柱状标签（Control、KOA、Acupotomy）的Western Blot图像。行标签：Col minus I（120KD）；Col minus II（134KD）；Col minus III（140KD）；beta minus actin（42KD）。图像B显示了各组之间Col minus 1蛋白表达的条形图。X轴标签：（不清晰），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Col minus 1的蛋白表达（单位：无），范围为0.0到1.5，刻度为0.0、0.5、1.0、1.5。条形图高度：Control约为0.5；KOA约为0.9（带双星号）；Acupotomy约为0.75（带波浪线）。图像C显示了各组之间Col minus 2蛋白表达的条形图。X轴标签：（不清晰），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Col minus 2的蛋白表达（单位：无），范围为0.0到1.5，刻度为0.0、0.5、1.0、1.5。条形图高度：Control约为1.0；KOA约为0.45（带双星号）；Acupotomy约为0.7（带波浪线）。图像D显示了各组之间Col minus 3蛋白表达的条形图。X轴标签：（不清晰），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Col minus 3的蛋白表达（单位：无），范围为0.0到1.5，刻度为0.0、0.5、1.0、1.5。条形图高度：Control约为0.2；KOA约为0.9（带双星号）；Acupotomy约为0.6（带波浪线）。图例标签：Control、KOA、Acupotomy。图像E显示了各组之间Col minus 1相对mRNA表达的条形图。X轴标签：（不清晰），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Col minus 1的相对mRNA表达（单位：无），范围为0到6，刻度为0、2、4、6。条形图高度：Control约为2.0；KOA约为4.0（带双星号）；Acupotomy约为2.5（带波浪线）。图像F显示了各组之间Col minus 2相对mRNA表达的条形图。X轴标签：（不清晰），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Col minus 2的相对mRNA表达（单位：无），范围为0.0到1.5，刻度为0.0、0.5、1.0、1.5。条形图高度：Control约为1.0；KOA约为0.45（带双星号）；Acupotomy约为0.7（带波浪线）。图像G显示了各组之间Col minus 3相对mRNA表达的条形图。X轴标签：（不清晰），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Col minus 3的相对mRNA表达（单位：无），范围为0到8，刻度为0、2、4、6、8。条形图高度：Control约为3.0；KOA约为5.0（带双星号）；Acupotomy约为3.5（带波浪线）。图例标签：Control、KOA、Acupotomy。在图像B至D和E至G中，比较了相同的三个组中的Col minus 1、Col minus 2和Col minus 3，KOA组的Col minus 1和Col minus 3表达高于对照组，而Col minus 2的表达低于对照组；在每个对应的条形图中，Acupotomy的值介于KOA和对照组之间。

**针刺调节与TGF-β1/Smad信号通路相关的蛋白质和基因表达**
与对照组相比，KOA组的TGF-β1和Smad3蛋白含量显著增加（P<0.01），而Smad-7蛋白含量显著减少（P<0.01）。相比之下，针刺组显示TGF-β1和Smad3蛋白表达显著下调（P<0.01），而Smad-7蛋白含量显著上调（P<0.01）。与对照组相比，KOA组的TGF-β1和Smad3 mRNA水平显著增加（P<0.05），而Smad-7 mRNA水平显著降低（P<0.05）。相反，针刺组显示TGF-β1和Smad-3 mRNA水平显著下调（P<0.05），而Smad-7 mRNA水平显著上调（P<0.05）。这些发现表明，通过调节与TGF-β1/SMAD信号通路相关的蛋白质和基因表达，针刺疗法可以缓解软骨纤维化并延缓软骨退化（图5）。

图5 针刺对KOA兔子软骨中TGF-β1/Smad信号通路的影响。(A) TGF-β1、Smad3和Smad7的Western Blot图像；(B–D) 各组之间TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白表达的比较；(E–G) 各组之间TGF-β1、Smad3和Smad7基因表达的比较。与对照组相比：**P < 0.01；与KOA组相比：##P < 0.01。阅读该图的详细描述。

图像A显示了带有通道标签（Control、KOA、Acupotomy）的Western Blot图像。条带标签分别为TGF beta one 55KD、Smad three 50KD、Smad seven 46KD、beta actin 40KD。图像B显示了各组之间TGF beta one蛋白表达的条形图。X轴标签：（组），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：TGF beta one的蛋白表达，单位未显示，范围为0.0到1.5。数值：Control约为0.9；KOA约为1.2（带双星号）；Acupotomy约为1.0（带数字）。趋势：KOA高于Control；Acupotomy低于KOA。图像C显示了各组之间Smad three蛋白表达的条形图。X轴标签：（组），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Smad three的蛋白表达，单位未显示，范围为0.0到1.5。数值：Control约为0.6；KOA约为1.1（带双星号）；Acupotomy约为0.8（带数字）。趋势：KOA高于Control；Acupotomy低于KOA。图像D显示了各组之间Smad seven蛋白表达的条形图。X轴标签：（组），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Smad seven的蛋白表达，单位未显示，范围为0.0到1.5。数值：Control约为1.0；KOA约为0.7（带双星号）；Acupotomy约为0.9（带数字）。趋势：KOA低于Control；Acupotomy高于KOA。图像E显示了各组之间TGF beta one相对mRNA表达的条形图。X轴标签：（组），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：TGF beta one的相对mRNA表达，单位未显示，范围为0到4。数值：Control约为1.0；KOA约为3.0（带双星号）；Acupotomy约为1.8（带数字）。趋势：KOA最高；Acupotomy介于KOA和Control之间。图像F显示了各组之间Smad three相对mRNA表达的条形图。X轴标签：（组），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Smad three的相对mRNA表达，单位未显示，范围为0到4。数值：Control约为1.4；KOA约为2.5（带双星号）；Acupotomy约为1.6（带数字）。趋势：KOA最高；Acupotomy介于KOA和Control之间。图像G显示了各组之间Smad seven相对mRNA表达的条形图。X轴标签：（组），类别为Control、KOA、Acupotomy。Y轴标签：Smad seven的相对mRNA表达，单位未显示，范围为0到1.5。数值：Control约为1.0；KOA约为0.7（带双星号）；Acupotomy约为1.0（带数字）。趋势：KOA最低；Acupotomy接近Control。图例标签：Control、KOA、Acupotomy。在图像B至D和E至G中，比较了相同的三个组中的Col minus 1、Col minus 2和Col minus 3，KOA组的Col minus 1和Col minus 3表达高于对照组，而Col minus 2的表达低于对照组；在每个相应的条形图中，Acupotomy的值介于KOA和对照组之间。

**讨论**
本研究的结果表明，针刺可以降低KOA兔子模型中的Lequesne MG评分，有效减少Col-I和Col-III的沉积，抑制Col-II的降解，减轻软骨胶原的降解，并缓解软骨纤维化变化。这些发现表明，通过减轻软骨纤维化变化，针刺可以改善KOA模型兔子的行为结果，如疼痛缓解和关节活动度提高，从而延缓软骨退化。此外，我们的研究还揭示了针刺对软骨纤维化的抑制作用是通过调节TGF-β1/Smad信号通路实现的。

KOA是最常见的关节疾病之一，其特征包括软骨退化、合成减少、软骨下骨重塑、滑膜炎症和骨赘形成，导致关节疼痛和活动受限。软骨纤维化是KOA的病理特征。

**引用**
26 一旦软骨受损，软骨细胞会异常增生。最终，增生的软骨细胞会转变为类似成纤维细胞的表型，通过合成Col-I并诱导邻近透明软骨的降解和去分化，形成一层厚厚的纤维软骨样组织。
27、28 这些变化使软骨变得更硬，降低了其生物力学性能，使其容易受到外力的损害，从而改变关节软骨的表型，加剧KOA。
Liu QC的研究表明，上调DDX5可以下调Col-I的表达并上调Col-II的表达，从而抑制软骨纤维化和降解，延缓KOA的进展。Kuang的研究发现，Panaxatriol通过靶向UFL1发挥抗衰老作用，减轻软骨修复纤维化，从而保护软骨。我们之前的研究表明，针刺可以通过释放关节周围软组织有效延缓软骨退化。通过Masson染色和SEM，这项研究进一步揭示了针刺可以缓解软骨纤维化，从而在软骨中起到保护作用。

**纤维化发生在各种组织中，关节软骨纤维化也在OA中发生，在病理进展和软骨破坏中起关键作用。**膝关节软骨是一种透明软骨，其光滑的表面具有润滑作用，可以吸收外部力量以保护骨头。尽管软骨细胞是增殖能力较低的静止细胞，但它们具有高度活跃的蛋白质合成能力。软骨细胞的ECM包含多种类型的胶原蛋白，其分泌水平随关节内环境的变化而变化，软骨的质量通过不同胶原蛋白的降解和合成之间的平衡得以维持。在健康的关节软骨中，Col-I仅占总胶原面积的1.7%，而Col-II约占100%。生化分析还显示，关节软骨中0.2%的胶原蛋白是Col-I，96%是Col-II。Col-II和Col-I的表达减少或增加分别是关节软骨纤维化的关键特征。在KOA进展过程中，增殖的软骨细胞转变为类似成纤维细胞的表型，并在细胞形态、代谢和细胞骨架结构方面发生显著变化。这最终导致Col-I的合成增加，aggrecan和Col-II的表达停止，形成难以修复的纤维软骨样组织，从而破坏软骨结构。Col-III在正常关节软骨中的含量较低；然而，在软骨退化或损伤期间其表达可能会增加。研究表明，在软骨纤维化过程中Col-III的表达会上调。与这些发现一致，我们的研究发现KOA组的Col-I和Col-III的蛋白和mRNA表达水平增加，而Col-II的表达降低。相比之下，针刺促进了Col-II的蛋白和mRNA表达，抑制了Col-I和Col-III的表达，从而延缓了KOA患者的软骨纤维化进展。

**纤维化是一种病理过程，涉及胶原蛋白和其他ECM成分在组织中的过度积累，导致组织硬化和功能损伤。**TGF-β1/SMAD通路是组织纤维化的关键致病机制。TGF-β1是一种多功能细胞因子，在调节细胞过程和ECM成分（包括胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白）中起基本作用，并在组织纤维化和炎症的发展中起关键介导作用。TGF-β1通过激活下游介质（包括Smad-2和Smad-3）发挥其生物学效应，并受到Smad-7表达的负调控。Smad-3是TGF-β1信号通路的核心组成部分，在细胞内信号转导和基因表达调节中起关键作用。Smad-3的激活促进了成纤维细胞的激活和分化，增加了胶原蛋白和其他基质蛋白的合成，并推动了纤维化过程。Smad-3还可以通过形成正反馈回路增强细胞对TGF-β的响应性。这意味着，一旦纤维化过程开始，它可能是自我维持的，甚至会进一步加剧。Smad-7属于Smad蛋白家族，作为一种抑制因子，它能够与TGF-β1受体结合，阻止Smad-2和Smad-3的激活，从而抑制TGF-β1信号通路的激活。在本研究中，我们发现KOA（膝关节骨性关节炎）组患者的关节软骨中TGF-β1和Smad-3的蛋白质及mRNA表达水平上调，而Smad-7的表达水平下调。相比之下，与KOA组相比，针灸组中TGF-β1和Smad-3的蛋白质及mRNA表达水平下调，而Smad-7的表达水平上调。结合形态学结果以及软骨中Col-I、Col-III和Col-II的蛋白质及mRNA表达的变化，这些发现证实针灸可以通过调节TGF-β1/Smad信号通路来抑制软骨纤维化的进程，从而对软骨起到保护作用，并延缓KOA的进展。本研究存在一定的局限性。为了减少手术因素对结果的影响，所有针灸操作均由同一人完成。然而，由于针灸操作是在非可视化条件下进行的（无法直接观察到病变部位），因此无法完全避免操作上的差异。因此，在未来的研究中需要使用超声引导技术来提高操作的准确性。此外，膝关节骨性关节炎分为不同的病理阶段，我们的团队仍需对不同病理阶段的KOA进行比较研究，以明确针灸的最佳干预时机和治疗方案。

总体而言，本研究表明针灸通过调节TGF-β1/Smad通路，减少软骨基质降解并抑制KOA患者的软骨纤维化，从而对软骨起到保护作用。作为一种补充性和替代疗法，针灸可能为KOA患者提供新的治疗思路和方法。