整合单细胞转录组学分析鉴定与自身免疫性疾病免疫失调相关的PF4+/PPBP+巨核细胞样粒细胞

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Integrated single-cell transcriptomic analysis identifies PF4+/PPBP+ megakaryocyte-like granulocytes associated with immune dysregulation in autoimmune diseases

　　

巨核细胞（MKs）和低密度粒细胞（LDGs）与自身免疫性疾病（ADs）中的免疫失调和血管病变有关，然而其精确的亚群及病理相互作用仍不明确。研究人员旨在利用单细胞转录组分析表征MK和LDG亚群，并阐明其在AD中的潜在细胞间通讯。研究人员对10名初治AD患者（4名原发性干燥综合征[pSS]、3名类风湿关节炎[RA]和3名系统性红斑狼疮[SLE]）和3名健康对照者（HCs）的外周血单个核细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。对MKs和LDGs进行重新聚类以识别转录亚群，并使用CellChat分析其细胞间通讯。在一个独立的scRNA-seq数据集中验证了独特的巨核细胞样粒细胞群体。采用批量RNA测序（n=139）和血浆酶联免疫吸附测定（ELISA）实验来支持相关的分子特征。至关重要的是，通过对AD患者（n=5）和HCs（n=4）外周血的流式细胞术分析，对该鉴定的巨核细胞样粒细胞进行了蛋白水平的验证。MKs分离为免疫活性和血小板生成亚型，两者在AD中均表现出信号改变。LDGs包含一个独特的PF4+/PPBP+巨核细胞样亚群，具有增强的干扰素活性、促炎信号以及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成增加的转录特征。流式细胞术证实了这些粒细胞的存在，并显示其在AD患者中的比例高于HCs。这些粒细胞显示出通过ITGB2-ICAM2和APP-CD74轴与MKs进行预测的通讯。研究结果在一个外部的scRNA-seq数据集中得到了一致的验证，并通过批量RNA测序反卷积和升高的血浆髓过氧化物酶水平得到了证实。研究人员鉴定了一个潜在的与AD免疫失调相关的PF4+/PPBP+巨核细胞样粒细胞亚群。虽然流式细胞术为该群体提供了蛋白水平的证据，但仍需进一步的机制研究来充分阐明其在疾病发病机制中的功能作用。

本研究聚焦于自身免疫性疾病（ADs）中先天免疫细胞的异质性及其在病理过程中的作用。自身免疫性疾病如类风湿关节炎（RA）、原发性干燥综合征（pSS）和系统性红斑狼疮（SLE）影响着全球约3.2%的人口，其核心特征包括I型干扰素信号失调、慢性炎症及自身抗体产生，这些过程常与中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成相关。尽管巨核细胞（MKs）传统上被视为血小板前体，但其作为免疫细胞的功能日益受到关注，而低密度粒细胞（LDGs）则被证实是一种具有促炎特性的中性粒细胞亚群。然而，MKs与LDGs之间在自身免疫背景下的具体相互作用及潜在机制尚不明确。为此，研究人员开展了此项整合单细胞转录组学研究，相关成果发表于《Biochemistry and Biophysics Reports》。

在研究技术方法上，研究人员构建了包含10名初治AD患者（涵盖RA、pSS、SLE）和3名健康对照者（HCs）的发现队列，利用10× Genomics平台进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），并对PBMCs中的MKs和LDGs进行重聚类分析。通过CellChat算法推断细胞间通讯。此外，利用包含119名AD患者和20名HCs的批量RNA测序数据进行BayesPrism反卷积验证，并收集独立队列样本（AD患者n=5，HCs n=4）进行流式细胞术蛋白水平验证，辅以血浆ELISA检测。外部验证则使用了多个GEO数据库的独立scRNA-seq数据集。

研究结果方面，首先，研究人员在自身免疫性疾病中观察到巨核细胞（MKs）和低密度粒细胞（LDGs）的扩增与功能重编程。通过UMAP分析鉴定出九大主要免疫细胞群，发现MKs和LDGs在AD样本中显著富集。功能富集分析显示，AD来源的MKs从血栓生成向促炎表型转变，而LDGs则表现出TNF、NF-κB和Toll样受体信号的激活。

其次，针对MK亚群的功能表征显示，MKs被重新聚类为四个转录上不同的亚群（MK0-MK3）。其中MK1和MK3在AD患者中显著扩增。MK1表现出强烈的T细胞受体信号和NK细胞活化特征，而MK3则与造血干细胞增殖和炎症重编程相关，表明MKs在AD中向具有抗原呈递能力的免疫活性状态转变。

第三，在对LDG亚群的深入分析中，虽然初步的无监督聚类未发现明显的巨核细胞特征群体，但通过靶向分析，研究人员鉴定出一个表达巨核细胞标志物PF4和PPBP的独特LDG亚群，命名为巨核细胞样LDGs（MK-LDGs）。这些细胞分布于所有三个LDG子聚类中，且在AD患者中比例显著高于HCs。WebCSEA分析和多重身份评分进一步证实了其混合谱系特征。功能富集显示MK-LDGs参与先天免疫反应、血小板活化及NET形成通路，并高表达组蛋白相关基因。

第四，细胞通讯分析揭示了MK-LDGs与MKs之间存在独特的交流模式。在AD患者中，MK-LDGs与MKs（特别是MK2和MK3）之间的通讯显著增强，主要通过ITGB2-ICAM2、APP-CD74以及ITGB2-CD226等配体-受体轴进行，这些通路涉及免疫细胞黏附、活化和抗原加工。

第五，在外部队列的验证中，利用GEO数据库的scRNA-seq数据（包含pSS、RA、SLE样本）再次证实了MK-LDGs的存在。这些细胞同样表现出血小板活化和NET形成相关的通路富集，并且与发现队列一致，观察到了MK-LDGs与造血MKs之间通过ITGB2-ICAM2轴的活跃信号传导。

第六，关于NET形成与MK-LDG的相关性，批量RNA测序的GSEA分析显示AD患者中NET形成通路显著激活。ELISA结果证实AD患者血浆中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）浓度升高。BayesPrism反卷积分析显示MK-LDG比例与NE浓度呈正相关。最重要的是，流式细胞术成功在外周血中鉴定出CD16b⁺PF4⁺细胞，并在蛋白水平证实了该群体在AD患者中的扩增。

在讨论与结论部分，研究人员指出，本研究鉴定了一种先前未被识别的LDG亚群，即PF4⁺/PPBP⁺巨核细胞样粒细胞（MK-LDGs）。这些细胞并非真正的巨核细胞，而是获得了巨核细胞和血小板相关特征的粒细胞亚群，在AD中显著扩增。它们可能通过同时驱动NET形成和促血栓形成信号，在连接系统性炎症与血管病变中发挥关键作用。尽管emperipolesis（细胞入胞现象）可能在AD中存在，但本研究的数据更倾向于支持炎症性转录重编程而非直接的细胞入胞事件导致了MK-LDGs的出现。研究的局限性在于尚未完全阐明MK-LDGs的确切起源及命运。综上所述，该研究揭示了MK-LDGs作为一种潜在的生物标志物和免疫治疗靶点，为理解自身免疫性疾病的先天免疫失调提供了新的细胞基础和理论框架。