利用平菇（Pleurotus ostreatus）产生的蘑菇介导银纳米颗粒作为对抗多重耐药细菌的抗菌候选物质：对其进行物理化学、计算机模拟、细胞毒性和免疫生物学评估

《Bioorganic Chemistry》：Mushroom-mediated silver nanoparticles from Pleurotus ostreatus as antimicrobial candidates against multidrug-resistant bacteria: Physicochemical, in-silico, cytotoxicity, and immunobiological evaluation

　　

加达·S·阿布萨利姆（Ghadah S. Abusalim）| 穆罕默德·阿利萨（Mohammed Alissa）

沙特阿拉伯阿尔-哈尔杰（Al-Kharj）萨塔姆·本·阿卜杜勒阿齐兹大学（Prince Sattam bin Abdulaziz University）应用医学科学学院（College of Applied Medical Sciences）医学实验室（Department of Medical Laboratory），邮编11942

摘要

抗微生物耐药性的增加提高了对传统抗生素替代品的需求，尤其是针对多重耐药（MDR）菌株的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。我们研究了由乳菇（Pleurotus ostreatus）介导的银纳米颗粒（AgNPs）是否具有改善的抗菌效果，并且同时具备可接受的细胞毒性和免疫生物学效应。这些银纳米颗粒是从乳菇的水提取物中合成的，通过紫外-可见光谱（UV–visible spectroscopy）、动态光散射（dynamic light scattering）、透射电子显微镜（TEM）、Zeta电位分析（zeta potential analysis）、傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectrometry，FTIR）和气相色谱-质谱（gas chromatography–mass spectrometry，GC–MS）进行了表征。抗菌活性通过肉汤微量稀释法（broth microdilution）、时间杀灭试验（time-kill）和抗菌膜测试（antibiofilm tests）进行了评估。细胞毒性和免疫生物学效应通过MTT试验、细胞因子检测、一氧化氮生成（nitric oxide）和活性氧物种测定（reactive oxygen species assays）在巨噬细胞（macrophages）中进行评估。银纳米颗粒在428纳米处显示出等离子体共振峰（plasmon resonance peak），水动力直径为38.6纳米（SD 4.8），核心直径为22.4纳米（SD 6.1），Zeta电位为-27.8毫伏（SD 2.4）。其对MRSA的最小抑制浓度为4微克/毫升（4 μg/mL），对大肠杆菌为8微克/毫升，对肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌均为16微克/毫升。24小时后，银纳米颗粒将MRSA的存活数量从6.2 log10 CFU/mL减少到1.2 log10 CFU/mL。抗菌膜抑制效果介于68.4%到86.5%之间。巨噬细胞的半数杀伤浓度（CC50）为61.3微克/毫升。银纳米颗粒使TNF-α的水平从384降至149微克/毫升，并使IL-10的水平从35增至69皮克/毫升。乳菇介导的银纳米颗粒在体外表现出显著的抗菌、抗菌膜抑制和免疫调节作用，同时具有良好的细胞毒性特征，值得进一步进行临床前研究。

引言

抗微生物耐药性（AMR）对全球健康构成了严重威胁，降低了现有抗生素的效果，增加了疾病持续时间、治疗失败和死亡的风险。世界卫生组织（WHO）估计，2019年细菌抗微生物耐药性直接导致了127万人死亡，并在全球范围内导致了495万人死亡。其2024年的优先病原体更新继续将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等问题的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌确定为重要的公共卫生威胁[1]，[2]。日益严重的负担促使人们寻找能够对抗多重耐药（MDR）病原体的新方法，以恢复治疗效果。

天然产物因其作为抗菌和免疫活性化合物的来源而持续受到关注。乳菇（Pleurotus ostreatus）因其广泛的栽培、可食用性、成本效益以及丰富的生物活性化合物（包括多糖、蛋白质、甾醇、酚类、萜类和挥发物质）而特别有前景。最近的评估表明，乳菇具有抗氧化、抗菌、抗炎和免疫调节特性，凸显了其作为功能性食品和药物资源的重要性[3]，[4]。然而，虽然粗提物可能具有有益的生物活性，但其效果可能受到稳定性不足、成分不一致以及对抗高度耐药感染效力不足的限制。

银纳米颗粒（AgNPs）由于具有广谱作用和多靶点机制（如膜破坏、诱导氧化应激、干扰细胞呼吸和损害细胞内大分子[5]），已成为抗菌开发的强大候选者。最近的研究表明，绿色合成方法制备的AgNPs尤为吸引人，因为这种方法避免了使用刺激性化学试剂，并可能保留表面结合的天然生物分子[6]，[7]，从而提高了稳定性和生物活性[8]，[9]。蘑菇介导的合成方法具有双重优势：蘑菇提取物既作为还原剂又作为封端剂，而生成的纳米颗粒则结合了乳菇代谢物的固有生物活性和银的抗菌特性。

尽管如此，不能仅凭抗菌活性来评估生物合成AgNPs的生物学效果。银纳米颗粒可能与哺乳动物细胞和免疫途径发生相互作用，这种作用可能是有益的，也可能是有害的，具体取决于其大小、表面化学性质、剂量和暴露条件。当前的经合组织（OECD）指南强调了通过结构化的体外方法检测免疫毒性和免疫调节作用的必要性，而不能假设一种生物活性化学物质本质上就是安全的或能增强免疫的[10]，[11]。细胞毒性筛查对于确定任何检测到的抗菌效果是否在哺乳动物细胞可接受的浓度范围内至关重要。

先前的报告已经展示了添加了银纳米颗粒的蘑菇的生物活性[12]，[13]，[14]。

使用乳菇提取物进行银纳米颗粒的绿色合成方法特别独特，因为它避免了传统银纳米颗粒合成方法中通常需要的刺激性化学试剂。使用乳菇等天然来源不仅使过程更加环保和可持续，还把蘑菇中的生物活性分子整合到了纳米颗粒配方中。这种基于生物的方法确保了纳米颗粒保留了蘑菇的天然生物活性，赋予了化学合成纳米颗粒所不具备的额外抗菌特性[15]，[16]。此外，乳菇表面结合的化合物可以提高纳米颗粒的稳定性，并提供额外的功能基团，从而更有效地与细菌膜相互作用，使其比传统方法更具优势[17]。

这种独特的合成方法在纳米技术研究领域具有很大的潜力，它不仅解决了环境问题，还引入了一类新的生物纳米复合材料，这些复合材料可以进一步探索其在多种生物医学应用中的潜力。将天然化合物整合到合成过程中为开发具有治疗和生物相容性的多功能纳米颗粒开辟了新途径。对绿色合成技术的兴趣日益增加，这与推动可持续和环保纳米材料生产的广泛趋势相一致。

本研究利用乳菇提取物进行了银纳米颗粒的绿色合成，并评估了这些纳米颗粒对特定多重耐药细菌（包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌）的功效。本研究的主要目的是探讨乳菇介导的银纳米颗粒的机制和具体生物活性。

节摘

蘑菇材料的收集、鉴定和制备

从认可的蘑菇农场或当地栽培设施获取了新鲜的乳菇子实体，并由相关科室或标本馆的真菌学家进行了鉴定。样品用蒸馏水冲洗以去除污物，在室温下风干后研磨成细粉。这种粉末状物质被保存在密封的无菌容器中直至提取。

结果

在将蘑菇提取物与硝酸银混合后的25分钟内，颜色从淡黄色明显变为深棕色，表明纳米颗粒合成速度较快。紫外-可见光谱显示在428纳米处有明显的表面等离子体共振带，表明银纳米颗粒已经生成（见图1）。动态光散射显示了平均直径为38.6±4.8纳米的单一分布（见图1），而模拟的透射电子显微镜（TEM）计算出的核心直径为...

讨论

本研究表明，乳菇作为银离子转化的生物还原剂，并可能作为影响纳米颗粒合成后行为的表面活性代谢物的潜在来源。在绿色AgNP平台上，用于合成的生物基质被广泛认为是最终治疗结构的重要组成部分，因为提取物的含量会影响颗粒大小、胶体稳定性、表面化学性质以及最终的生物活性。

结论

由乳菇合成的银纳米颗粒对多重耐药感染表现出显著的抗菌和抗菌膜抑制效果，同时保持了巨噬细胞的存活能力并引发了特定的免疫调节作用。将蘑菇衍生的代谢物整合到纳米颗粒表面提高了稳定性、生物活性和抗炎特性，其效果超过了纯提取物或单独使用硝酸银的效果。

作者贡献声明

加达·S·阿布萨利姆（Ghadah S. Abusalim）：撰写——审稿与编辑、原始草稿撰写、方法学设计、分析方法、概念构思。穆罕默德·阿利萨（Mohammed Alissa）：撰写——审稿与编辑、原始草稿撰写、监督工作、方法学设计、研究实施、分析方法、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢萨塔姆·本·阿卜杜勒阿齐兹大学通过项目编号（PSAU/2025/03/37458）资助了这项研究工作。