《Bioorganic Chemistry》：3,3′,4,4′-Tetrahydroxy-2-methoxychalcone from Glycyrrhiza uralensis roots inhibits HIF-1α and Nrf2, suppressing hypoxia-induced angiogenesis
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甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)作为一种传统药物，已被广泛用于治疗感染、胃炎、癌症和疼痛。虽然其抗癌特性，特别是针对胃癌、肺癌、结肠癌和肝癌的抗癌特性，最近引起了越来越多的关注，但其潜在机制，特别是与其抗氧化和抗血管生成活性
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甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)作为一种传统药物，已被广泛用于治疗感染、胃炎、癌症和疼痛。虽然其抗癌特性，特别是针对胃癌、肺癌、结肠癌和肝癌的抗癌特性，最近引起了越来越多的关注，但其潜在机制，特别是与其抗氧化和抗血管生成活性相关的机制，仍很大程度上未被探索。本研究旨在从乌拉尔甘草甲醇提取物中分离和表征生物活性化合物，并评估它们对缺氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1α) 及相关通路的影响。在液相色谱-质谱联用分析的辅助下，对乌拉尔甘草根甲醇提取物进行植物化学研究，导致分离出6种化合物 (1–6)，通过光谱分析（主要是电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)、紫外光谱(ultraviolet, UV)和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)数据）将其结构表征为甘草查尔酮A (1)、甘草查尔酮B (2)、甘草素 (3)、甘草苷 (4)、异甘草苷 (5) 和3,3′,4,4′-四羟基-2-甲氧基查尔酮 (tetrahydroxy-2-methoxychalcone, TMC, 6)。其中，TMC对HIF-1α和Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) 信号通路均显示出最强的抑制作用。在人结直肠癌细胞HCT-116中，TMC显著降低了缺氧诱导的HIF-1α蛋白积累，而不改变其mRNA水平，并且该效应可被MG132 (一种蛋白酶体抑制剂) 逆转，这表明蛋白酶体依赖性机制有助于降低HIF-1α蛋白水平。TMC也降低了血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 的表达。此外，TMC抑制了Nrf2和血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1) 的表达，并在缺氧条件下降低了Nrf2的mRNA稳定性。尽管抑制了Nrf2/HO-1轴，TMC仍降低了细胞内活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 水平，并在1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH) 测定中显示出轻微的清除自由基活性，这表明TMC可能在缺氧条件下有助于氧化还原平衡。在人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) 中，TMC抑制了VEGF诱导的迁移和管形成，并减弱了血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2) 的磷酸化。在斑马鱼中，TMC降低了HIF-1α蛋白水平，而没有明显的发育或心脏毒性。总而言之，这些研究结果表明，TMC通过靶向HIF-1α/VEGF通路、调节VEGFR2活化以及通过降低Nrf2的mRNA稳定性来抑制Nrf2/HO-1信号，从而发挥抗血管生成活性，凸显了其作为缺氧相关肿瘤血管生成治疗候选物的潜力。
论文解读：
研究背景与问题
缺氧是实体瘤的常见特征，与肿瘤侵袭、转移风险增加和患者死亡率升高相关。缺氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor 1, HIF-1) 是细胞适应低氧环境的核心调节因子，其稳定可促进包括血管内皮生长因子 (VEGF) 在内的多种基因转录，驱动血管生成，支持肿瘤生长和存活。同时，细胞在缺氧应激下会激活核因子E2相关因子2 (Nrf2) 信号通路，诱导血红素加氧酶-1 (HO-1) 等抗氧化基因的表达，以维持氧化还原稳态并促进细胞存活。HIF-1α/VEGF 和 Nrf2/HO-1 这两个通路是癌症治疗中极具前景的靶点。然而，尽管有研究显示甘草 (Glycyrrhiza uralensis) 具有抗癌、抗氧化等多种药理活性，但其在抗氧化和抗血管生成方面的具体活性成分、作用机制及其对上述关键信号通路的影响，此前研究甚少，相关机制仍有待阐明。因此，从甘草中发掘具有抗血管生成和抗氧化活性的化合物，并阐明其分子机制，对于开发针对缺氧相关肿瘤的治疗策略具有重要意义。
研究概要与意义
针对上述问题，研究人员从乌拉尔甘草 (G. uralensis) 根中分离活性化合物，并评估其对HIF-1α和Nrf2通路的抑制作用。该研究发表于《Bioorganic Chemistry》。研究发现，分离得到的化合物3,3′,4,4′-四羟基-2-甲氧基查尔酮 (TMC) 能够通过蛋白酶体途径降低HIF-1α蛋白水平，并降低Nrf2的mRNA稳定性，从而在体外和体内模型中抑制血管生成。这项工作不仅揭示了一种源自甘草的查尔酮类化合物的双重作用机制，也为开发通过靶向HIF-1α和Nrf2来对抗肿瘤血管生成的新型治疗候选物提供了科学依据。
主要技术方法
研究主要采用了以下技术方法：1) 植物化学分离与鉴定：通过液液萃取、柱层析和高效液相色谱 (high-performance liquid chromatography, HPLC) 从乌拉尔甘草根的甲醇提取物中分离化合物，并综合运用紫外光谱、电喷雾电离质谱和核磁共振 (特别是850 MHz高场NMR) 进行结构鉴定。2) 细胞生物学实验：使用人结直肠癌细胞HCT-116和人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 进行体外研究。通过蛋白质印迹法 (Western blot) 检测蛋白表达，实时定量聚合酶链式反应 (quantitative polymerase chain reaction, qPCR) 分析mRNA水平，活性氧 (ROS) 检测评估氧化应激水平，划痕实验和Matrigel基质胶管形成实验分别评估内皮细胞迁移和血管形成能力。3) 分子机制研究：利用蛋白酶体抑制剂MG132探讨HIF-1α降解途径；通过检测mRNA稳定性评估Nrf2的转录后调控。4) 体内模型验证：使用转基因斑马鱼Tg(fli1:EGFP) 在体评估化合物的抗血管生成活性和毒性。
研究结果
化合物分离与鉴定：研究人员从乌拉尔甘草根的甲醇提取物中分离并鉴定了6个黄酮类化合物，分别为甘草查尔酮A (1)、甘草查尔酮B (2)、甘草素 (3)、甘草苷 (4)、异甘草苷 (5) 和3,3′,4,4′-四羟基-2-甲氧基查尔酮 (TMC, 6)。
TMC抑制HIF-1α蛋白积累：在HCT-116细胞中，TMC显著抑制了由缺氧诱导的HIF-1α蛋白积累，但对其mRNA水平无影响。蛋白酶体抑制剂MG132可逆转TMC对HIF-1α的降解作用，表明TMC通过蛋白酶体依赖性途径促进HIF-1α蛋白降解。
TMC下调VEGF表达：与抑制HIF-1α一致，TMC处理降低了缺氧条件下VEGF的mRNA和蛋白表达水平。
TMC抑制Nrf2/HO-1通路：研究发现TMC在缺氧条件下能抑制Nrf2及其下游靶基因HO-1的表达。进一步机制探究表明，TMC降低了Nrf2的mRNA稳定性，而非直接影响其转录。
TMC的抗氧化活性：尽管抑制了Nrf2/HO-1这一经典的抗氧化通路，TMC处理仍降低了HCT-116细胞内的ROS水平，并在DPPH自由基清除实验中显示出温和的抗氧化活性，提示TMC可能通过其他途径帮助维持缺氧条件下的氧化还原平衡。
TMC抑制内皮细胞功能：在HUVEC细胞中，TMC处理抑制了VEGF诱导的内皮细胞迁移和体外血管样结构 (管) 的形成。同时，TMC还减弱了VEGF诱导的VEGFR2磷酸化，表明其抗血管生成作用与抑制VEGFR2活化有关。
TMC在斑马鱼模型中的抗血管生成活性：在斑马鱼体内实验中，TMC处理降低了HIF-1α蛋白水平，并显示出抗血管生成效果，且未观察到明显的发育或心脏毒性。
讨论与结论总结
讨论：研究讨论部分强调了肿瘤缺氧微环境的复杂性及其对癌症治疗的挑战。缺氧诱导的HIF-1α稳定和Nrf2激活是肿瘤细胞适应和存活的关键。该研究发现的化合物TMC能够同时靶向这两个关键通路。通过促进蛋白酶体介导的HIF-1α降解，TMC阻断了促血管生成信号VEGF的产生。同时，通过降低Nrf2的mRNA稳定性，TMC抑制了细胞的抗氧化防御反应，这可能使肿瘤细胞对氧化应激更敏感。值得注意的是，TMC在抑制经典Nrf2/HO-1通路的同时仍表现出降低细胞内ROS的效应，这揭示了其调节氧化还原平衡的一种非典型或更为复杂的作用模式。TMC还能抑制VEGFR2的磷酸化，从而直接干扰VEGF介导的内皮细胞活化。这些多靶点作用共同赋予了TMC强效的抗血管生成活性。该研究结果将一种传统药用植物——甘草中的特定成分，与调控肿瘤缺氧微环境的核心分子机制直接联系起来，为开发源自天然产物的多靶点抗肿瘤药物提供了新的思路和候选分子。
结论：研究人员得出结论，在针对潜在生物活性植物化学物质的持续研究中，他们研究了来自乌拉尔甘草根的潜在抗血管生成和抗氧化化合物，以验证其抗癌的潜在作用和靶点。对乌拉尔甘草根甲醇提取物的植物化学研究，借助柱层析和LC-MS辅助的HPLC纯化，分离出六种黄酮衍生物 (1–6)。在分离的化合物中，TMC (6) 对HIF-1α和Nrf2信号通路显示出最强的抑制作用。在HCT-116细胞中，TMC通过蛋白酶体依赖性机制降低了缺氧诱导的HIF-1α蛋白积累，并下调VEGF表达。此外，TMC在缺氧条件下通过降低mRNA稳定性来抑制Nrf2和HO-1的表达。在人脐静脉内皮细胞中，TMC通过减弱VEGFR2磷酸化来抑制VEGF诱导的迁移和管形成。在斑马鱼体内，TMC降低了HIF-1α蛋白水平，且无明显的发育或心脏毒性。总而言之，这些发现表明，TMC通过靶向HIF-1α/VEGF通路、调节VEGFR2活化以及通过降低Nrf2的mRNA稳定性来抑制Nrf2/HO-1信号传导，从而发挥抗血管生成活性，突显了其作为缺氧相关肿瘤血管生成治疗剂的潜力。
