《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Endosomal escape and cytosolic delivery of Cell-penetrating peptide conjugates
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研究人员利用split荧光素酶内涵体逃逸定量（SLEEQ）法评估了细胞穿膜肽（CPP）将含DINNN序列的肽段递送至巨噬细胞胞质的能力。该序列是含SPRY结构域的SOCS盒（SPSB）蛋白1、2、4与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）相互作用的高亲和力抑制剂，可作
研究人员利用split荧光素酶内涵体逃逸定量（SLEEQ）法评估了细胞穿膜肽（CPP）将含DINNN序列的肽段递送至巨噬细胞胞质的能力。该序列是含SPRY结构域的SOCS盒（SPSB）蛋白1、2、4与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）相互作用的高亲和力抑制剂，可作为宿主导向抗生素的候选分子。研究通过对荧光强度差异进行校正后，采用SLEEQ法检测了多种CPP-肽偶联物在巨噬细胞系中的胞质递送效率。结果表明，TAT、(RW)4和CPP9均可增强含DINNN肽段的胞质递送，但其作用机制主要是促进内涵体摄取而非增强内涵体逃逸。在偶联物中引入荧光基团sCy5可普遍提升胞质摄取水平，但该效应因所用CPP不同而存在显著差异。共聚焦成像结果与SLEEQ数据一致，提示在使用荧光基团法研究细胞摄取时，需注意区分CPP效能与染料效应的干扰。总细胞结合量与内涵体逃逸的定量分析支持以下机制：CPP介导的胞质递送主要由膜相互作用及内涵体内化驱动，而非内涵体逃逸效率决定。尽管CPP提升了含DINNN肽段的胞质摄取，但内涵体逃逸效率极低，所测试的CPP均未显著增强货物的内涵体逃逸能力。
该研究针对极性肽类药物难以穿透细胞膜的瓶颈问题，聚焦细胞穿膜肽（CPP）介导的内涵体逃逸与胞质递送机制，旨在解决CPP效用评价方法局限、机制争议及药物递送效率低等关键科学问题。研究以SPSB（含SPRY结构域的SOCS盒）-iNOS（诱导型一氧化氮合酶）相互作用抑制剂DINNN肽为模型货物，通过定量方法揭示CPP的作用规律，为宿主导向抗生素开发提供实验依据，相关成果发表于《Bioorganic》。
研究人员采用的关键技术方法包括：构建稳定表达LgBiT蛋白的RAW 264.7巨噬细胞系作为检测细胞模型；应用split荧光素酶内涵体逃逸定量（SLEEQ）法，通过HiBiT标签与LgBiT重组形成纳米荧光素酶的特性，分别检测活细胞胞质递送信号与digitonin裂解后的总细胞关联信号，计算内涵体逃逸效率；结合共聚焦成像技术，利用溶酶体追踪剂与早期内涵体标记物，验证肽段在细胞内的亚定位分布；通过流式细胞术分析细胞活力，排除毒性干扰。
研究结果如下：
3.1 肽偶联物合成
研究人员采用Fmoc固相肽合成法，构建了含不同CPP（TAT、(RW)4、线性CPP9m、环化CPP9m、CPP9）及荧光基团sCy5的7mer-HiBiT偶联物库。设计采用模块化结构：N端为CPP/sCy5，中间为DINNN抑制剂序列（KDINNNV），C端为HiBiT标签，并通过Ahx与β-丙氨酸连接子优化合成效率与功能活性。
3.2 HiBiT偶联物无细胞毒性
通过碘化丙啶（PI）染色法检测显示，所有浓度达5 μM的CPP-肽偶联物处理24小时后，RAW 264.7细胞存活率均超过90%，证实其生物安全性符合细胞摄取实验要求。
3.3 肽偶联物荧光活性校正
研究发现CPP与HiBiT的共价连接会降低纳米荧光素酶复合物的发光效率，降低幅度与CPP分子量呈正相关。通过建立各肽段的相对发光活性校正因子，消除了标签效应对定量结果的影响，为后续数据分析提供了标准化基础。
3.4 CPP增强肽类货物递送
SLEEQ检测显示，TAT、(RW)4与线性CPP9m使7mer的胞质递送提升约5倍，三者效能无统计学差异；环化CPP9m进一步提升至14倍，但仅为预期值的1/3。CPP9较TAT仅高出4倍，远低于文献报道的31倍差异，提示递送效率受细胞系、货物类型与检测方法共同影响。
3.5 总细胞关联与胞质递送正相关
总细胞关联（膜结合+内涵体滞留+胞质递送）与胞质递送量呈线性相关，表明CPP的膜相互作用能力与内涵体内化效率是决定胞质递送水平的核心因素，而非内涵体逃逸过程。
3.6 内涵体逃逸效率极低
所有偶联物的内涵体逃逸率均低于1%，且CPP组与无CPP对照组无显著差异。即使环化CPP9m的逃逸率（~0.5%）也与TAT相当，否定了“CPP通过增强逃逸提升递送”的传统假设。
3.7 CPP9结构改变对效能影响有限
原始CPP9序列较CPP9m的胞质递送仅提升1.4倍，且两者逃逸率无显著差异，证实货物连接会削弱CPP自身的逃逸优势，强调“CPP效能需在目标货物背景下评价”的重要性。
3.8 荧光基团sCy5调控肽摄取
sCy5可使7mer-HiBiT递送提升3倍，但对TAT-7mer-HiBiT无增强作用，甚至因降低TAT的正电荷而减弱其效能；sCy5-CPP9m-7mer-HiBiT递送提升至23倍，其效应取决于CPP本身的膜相互作用特性，再次验证荧光基团会干扰CPP效能的客观评价。
3.9 共聚焦成像验证亚细胞定位
成像结果显示，sCy5标记的肽段主要呈点状分布于溶酶体区，与早期内涵体标记物几乎无共定位，仅微量弥散于胞质。其中sCy5-CPP9m-7mer-HiBiT的溶酶体滞留率最高，与SLEEQ的逃逸数据完全一致，揭示了荧光法易高估胞质递送的原因。
讨论部分指出，本研究通过标准化定量方法证明：CPP介导的胞质递送主要依赖膜结合与内涵体内化效率，而非传统认为的逃逸效率；荧光基团会通过改变膜相互作用特性干扰CPP效能评价，需谨慎用于摄取机制研究；货物性质显著影响CPP表现，开发针对极性药物的定制化CPP是未来优化方向。研究结论强调，在评估CPP时需综合考虑细胞类型、货物属性与方法学差异，为肽类药物递送系统设计提供了重要的机制依据。
