《Bioresource Technology》：Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient production of dihydroartemisinic acid
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Jiachang Liu|Yunliang Chen|Hai-Yan He合成生物学在药物创新中的应用CAMS关键实验室，国家卫生健康委微生物药物生物技术关键实验室，天然药物生物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院药用生物技术研究所及北京协和医学院，北京100050摘要青
Jiachang Liu|Yunliang Chen|Hai-Yan He
合成生物学在药物创新中的应用CAMS关键实验室，国家卫生健康委微生物药物生物技术关键实验室，天然药物生物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院药用生物技术研究所及北京协和医学院，北京100050
摘要
青蒿素是一种由世界卫生组织推荐的天然抗疟疾药物。为了解决天然原料供应的限制，半合成生产提供了一种有前景的替代策略。当前的半合成路线通常依赖于含有重金属的不对称氢化反应，将青蒿酸（AA）转化为二氢青蒿酸（DHAA）。本研究旨在构建一个能够直接生产二氢青蒿酸的工程微生物平台，以支持青蒿素的半合成过程。首先，将编码关键酶AaDbr2的基因引入青蒿酸生产菌株中，该酶能够将代谢流导向二氢青蒿酸的生物合成途径，并优化了启动子强度以增强表达，从而实现了79.4毫克/升的二氢青蒿酸产量。AaDbr2基因编码的酶可以将青蒿醛和二氢青蒿醛氧化，分别生成青蒿酸和二氢青蒿酸。因此，将AaDbr2和ALDH1基因融合到基因组中，这一策略将DHAA与AA的比率从0.6大幅提升至4.2。此外，通过多种代谢工程手段进一步提高了二氢青蒿酸的产量，包括改进辅因子工程以增加NADPH的供应量、调节分批生长行为以平衡细胞增殖和产品合成，以及优化P450电子传输系统。最终，在5升生物反应器中进行的分批和连续发酵实验使二氢青蒿酸的产量达到了6.8克/升，这是迄今为止报道的最高产量。本研究展示了微生物平台在可持续、经济且可扩展地生产二氢青蒿酸方面的潜力，为青蒿素的工业半合成奠定了基础。
引言
青蒿素（AN）是一种倍半萜内酯类化合物，是从中药植物青蒿（Artemisia annua）中提取的。作为一种强效的抗疟疾药物，青蒿素对那些对氯喹和甲氟喹等传统抗疟疾药物具有抗性的恶性疟原虫（P. falciparum）菌株特别有效。因此，基于青蒿素的联合疗法（ACTs）仍然是临床治疗的首选方案（Tu, 2016; Venkatesan, 2025）。然而，青蒿素的产量目前受到其天然含量低（仅占青蒿干重的0.1–1%）以及环境变化的影响（Banyai et al., 2010; Chen et al., 2000）。此外，青蒿素复杂的化学结构（包含过氧桥和多个手性中心）使得完全化学合成在经济和技术上都具有挑战性（Yan et al., 2023）。
合成生物学的最新进展使得以前仅限于植物或特定微生物的宝贵天然产物能够通过微生物进行生产（Galanie et al., 2015; Gao et al., 2023; Jiao et al., 2024; Liang et al., 2025; Srinivasan and Smolke, 2020; Wang et al., 2022; Zhang et al., 2024; Zhang et al., 2022），其中包括青蒿酸（AA）（Paddon et al., 2013; Ro et al., 2006），这是青蒿素的生物合成前体（图1A）。像酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大肠杆菌（Escherichia coli）这样的工程微生物底盘具有生长迅速、遗传操作方便和遗传稳定性高的优点。尽管从异戊二烯单元到青蒿酸的完整生物合成途径已在工程酿酒酵母中成功重建并实现了工业化（Rydén et al., 2010; Wallaart et al., 2001; Zhang et al., 2008; Zheng et al., 2023），但负责直接生成青蒿素的关键酶步骤尚未确定（图1A）。因此，目前的工业生产过程仍然依赖于将青蒿酸通过化学方法转化为青蒿素（图1B）。所有已报道的从AA到AN的化学转化途径都需要首先将AA还原为二氢青蒿酸（DHAA）。早期工业尝试使用了Wilkinson催化剂[RhCl(PPh3)3]进行AA的氢化，虽然转化率接近完全，但选择性仅达到约90%（11R型DHAA）（图1B）。随后使用均相铑催化剂将选择性提高至约95%（Turconi et al., 2014），但尚未达到理想的立体化学纯度。这些限制增加了下游纯化的复杂性和生产成本。此外，使用贵金属催化剂在活性药物成分制造过程中还会带来控制重金属残留的挑战。
为了解决这些问题，在酿酒酵母中重建了二氢青蒿酸的生物合成途径。引入了关键生物合成酶AaDbr2，并通过不同强度的启动子对其进行了优化，以确定最佳表达水平（图1A）。接着将AaDbr2与下游脱氢酶AaALDH1融合，以实现协同生物转化，并评估了不同的连接子以提升催化效率。这种融合策略有效地改变了AA与DHAA的生产比例（图1A）。为了进一步提高细胞内的还原能力，上调了戊糖磷酸途径中的关键酶ZWF1和GND1，以增加NADPH的供应。为了提高工业生产的稳健性，将融合构建体整合到了基因组的rDNA位点中。利用酿酒酵母的分批生长调节机制，通过调节甲瓦酮途径中的FPP旁路流量和AaDbr2的表达来平衡细胞生长和DHAA的生物合成。此外，提高CPR蛋白的电子传递效率也提高了下游生物合成过程中P450介导的氧化效率。最终，在5升生物反应器中进行的分批和连续发酵实验中，二氢青蒿酸的产量达到了6.8克/升，这是迄今为止酵母生产系统中报道的最高产量。这一策略系统性地提升了底盘细胞的性能和通往DHAA生物合成的途径通量，简化了AA向青蒿素的工业转化过程，同时消除了对铑催化剂的使用，并减少了手性分离的挑战。
章节摘录
通用方法、试剂和设备
引物合成和DNA测序由Tsingke Biotechnology有限公司（北京，中国）完成。限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs，KOD One? PCR Master Mix由TOYOBO有限公司（大阪，日本）提供。凝胶提取和质粒纯化试剂盒购自Omega Bio-tek。pEASY?-Basic Seamless克隆和组装试剂盒购自TransGen Biotech（北京，中国）。所有试剂的使用均遵循相关说明。
ScAA02是一种先前在我们实验室中经过改造用于生产青蒿酸（AA）的酿酒酵母菌株（Ai et al., 2019）。AaDbr2能够催化青蒿醛（ALD）还原为二氢青蒿醛（DHALD），这是一种能够将代谢流导向DHAA生物合成的关键酶（Zhang et al., 2008）。AaDbr2的编码序列被合成并在大肠杆菌 BL21(DE3)中异源表达。体外实验结果证实AaDbr2能够有效地
在这项研究中，开发了一个工程化的酿酒酵母平台，用于直接发酵生产二氢青蒿酸，它是青蒿素半合成的关键前体。实施了系统的代谢工程策略，包括优化AaDbr2的启动子表达、通过酶融合重新定向代谢流、增强戊糖磷酸途径以增加NADPH的供应，以及构建基于分批生长调节的动态调节系统
Jiachang Liu：撰写——原始稿件、可视化处理、数据分析验证、资源协调、项目管理、方法设计、实验实施、数据分析、数据整理。Yunliang Chen：可视化处理、方法设计、数据分析验证、项目监管、资源协调、实验实施、资金获取、数据分析整理。Hai-Yan He：撰写——审稿与编辑、数据分析验证、项目监督、资源协调、项目管理、资金获取、数据分析整理。
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
