《Biosensors and Bioelectronics》：Potential-resolved Single-nanoparticle Collision Electrochemistry for Simultaneous Quantification of MCF-7 and SK-BR-3 Cells
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Fuxing Qin|Wenbo Yu|Zhongmin You|Jiannan Wu|Wei Wen|Xiuhua Zhang|Shengfu Wang|Zhen Wu湖北省小分子药物精密合成重点实验室；教育部有机功能分子合成与应用重点实验室；湖北大学化学与化工学院，武汉，43
Fuxing Qin|Wenbo Yu|Zhongmin You|Jiannan Wu|Wei Wen|Xiuhua Zhang|Shengfu Wang|Zhen Wu
湖北省小分子药物精密合成重点实验室；教育部有机功能分子合成与应用重点实验室；湖北大学化学与化工学院，武汉，430062，中国
摘要
与通过单一免疫测定法检测单个目标分析物相比，多重免疫测定法（MIAs）可以在单次实验中同时检测多个分析物，从而节省更多时间并减少样品消耗。单纳米粒子碰撞电化学（SNCE）以其高通量、高灵敏度和快速响应而备受关注，并已在生物传感领域得到广泛应用。本文提出了一种创新的电位分辨SNCE生物传感器，该传感器基于铂纳米粒子（Pt NPs）催化肼反应以及银纳米粒子（Ag NPs）的自氧化过程，用于同时快速检测两种类型的乳腺癌细胞（MCF-7和SK-BR-3细胞）。通过分析两种纳米粒子的不同碰撞信号，建立了定量检测这两种癌细胞的方法。通过结合磁性珠（MBs）的稳定性和抗干扰能力以及脂质体包封-释放的信号放大策略，该SNCE生物传感器能够在1小时内检测到低至5个/毫升的乳腺癌细胞。这些基于信号分辨的MIAs也可以用于其他生物分子的检测，从而在单粒子或单分子层面阐明MIAs的原理，并为SNCE在生物传感中的应用开辟新的途径。
引言
癌症已成为21世纪对人类健康的最大威胁之一（Jassim等人，2023年）。据世界卫生组织数据显示，每年约有1020万人因此丧生。在中国，每年新增癌症病例约为530万例（国家癌症中心2025年报告），占全球总量的24%。平均每天有14500人被诊断出患有癌症，这给经济和家庭带来了沉重的负担。为应对这一日益严重的危机，中国政府推行了“健康中国2030”政策，加强癌症预防和控制工作，包括提供免费的癌症筛查项目（如乳腺癌和肺癌筛查），并投入了数百亿元人民币提升初级医疗保健能力。然而，在癌症早期阶段，癌细胞可能仅以微量存在（每毫升几到几百个细胞），这使得检测变得非常困难（Wan等人，2025年；Zhang等人，2023b年）。因此，开发高度敏感和可靠的早期检测方法对于癌症的诊断和治疗至关重要。
传统的免疫测定法本质上每次分析循环只能检测一个分析物。历史上，要分析多个目标，需要将生物样品分成多个部分进行单独定量。这种方法存在两个主要限制：（1）程序时间随目标数量的增加而呈比例增长，使得多重应用耗时过长；（2）无法满足对高通量分析的需求（Qiu等人，2023年）。如今，能够在一个测定中定量多个疾病生物标志物的MIAs越来越受到重视，显著改善了复杂疾病的诊断、监测和管理（Fan等人，2019年；Jones等人，2019年；Manjunatha等人，2022年；Mounesh等人，2020年），同时减少了样品量、缩短了检测时间并降低了成本。目前的MIAs主要基于光学读出技术（Aggarwal等人，2023年；Huang等人，2020年；Lv等人，2020年；Vashist，2021年），这些技术可以通过有效的信号转换分别读取多个光学参数（Bai等人，2019年；Guo等人，2018年；Wang等人，2019年；Yang等人，2021年；Yavas等人，2018年）。例如，Kong等人开发了一种基于原位染料生成策略的双酶响应探针，通过荧光反应检测活细胞中的内源性硝基还原酶和人奎宁氧化还原酶1的活性（Kong等人，2019年）。然而，不同光学标签之间的光谱重叠可能会影响结果的准确性。另一种广泛使用的方法是空间分辨的阵列基MIAs，通过在不同位置固定不同生物标志物的检测探针来实现（Eissa等人，2018年；He等人，2018年；Li等人，2018年；Wei等人，2018年）或使用多种不同的检测探针进行目标筛选（Lee等人，2013年；Wan等人，2014年；Zhao等人，2015年）。然而，每个生物标志物的检测探针都是独立的，因此设计一种能同时检测多个生物标志物的高密度阵列具有挑战性。因此，迫切需要一种兼具精准性、灵敏度和操作简便性的MIAs平台。
作为一种稳健且简单的单实体电化学分析方法，SNCE近年来因其高通量、高灵敏度和快速响应速度等优点而取得了显著进展（Sun等人，2025年；Zhang等人，2023a年；Zhang等人，2022年）。通过捕捉单个分子或粒子与UME表面碰撞时产生的电化学信号，可以在单实体尺度上监测电化学过程（Bai等人，2023年；Chen等人，2023年；Liu等人，2025年）。这使得能够阐明电子转移反应的本质机制（Sun等人，2024年；Xu等人，2026年；Xu等人，2023年），并揭示在批量测量中可能被掩盖的内在特性（Ding等人，2023年；Hafez等人，2019年；Su等人，2023年）。2014年，Dunevall等人利用SNCE通过监测囊泡内儿茶酚胺激素的电化学反应来检测单个肾上腺嗜铬细胞（Dunevall等人，2015年）。2016年，Dick等人通过监测单个细胞与微电极碰撞过程中的细胞内容物消耗实现了单个癌细胞的电化学检测（Dick，2016年）。Bai等人发现不同大小的Pt NPs在与电极碰撞时具有不同的电流上升时间，并开发了一种尺寸分辨的SNCE生物传感器，用于单个实验中miRNAs的检测（Bai等人，2021年）。然而，由于NPs在电极表面的复杂运动，不同大小的NPs的瞬态电流信号往往无法仅通过电流强度来区分。因此，需要开发更能够区分碰撞电流信号的SNCE生物传感器。
在这项工作中，我们发现当施加不同的电位时，由Pt NPs和Ag NPs与N2H4组成的混合溶液可以产生两种不同形状的瞬态电流信号。Pt NPs催化的N2H4氧化产生的阶跃型瞬态电流信号，以及Ag NPs氧化产生的峰值型瞬态电流信号，这两种类型的瞬态电流信号是可以区分且不会相互干扰的。基于此，我们使用Pt NPs和Ag NPs作为信号标记，结合脂质体的信号放大策略，建立了一种新的电位分辨SNCE生物传感器，用于同时检测MCF-7和SK-BR-3细胞，具体方案如图1所示。经过anti-EpCAM抗体修饰的免疫磁珠（IMBs）可以在复杂的样品中捕获MCF-7和SK-BR-3细胞。生物素修饰的脂质体I和II分别通过与生物素和链霉亲和素的特异性相互作用与Aptamer-a和b结合，从而形成信号探针I和II。目标MCF-7和SK-BR-3细胞分别被信号探针I和II特异性识别，形成IMBs-细胞-脂复合物。加入1×PBST（含有0.05% Tween-20的PBS）后，复合物上的脂质体被水解，释放出封装的Pt NPs和Ag NPs。这些NPs被收集用于SNCE实验。当Pt NPs与Au UME碰撞时，会催化N2H4的氧化反应，产生阶跃型瞬态电流信号。Ag NPs与Au UME碰撞后自氧化成银离子，产生峰值型瞬态电流信号。每个粒子的有效碰撞会产生独立的瞬态电流响应。通过检查两种NPs的碰撞频率（单位时间内的瞬态电流信号数量）与细胞浓度之间的相关性，可以实现MCF-7和SK-BR-3细胞的双重定量检测。
章节片段
生物素修饰和脂质体包封的Ag NPs或Pt NPs（Ag-Lip-Biotin或Pt-Lip-Biotin）的合成
使用1毫升氯仿溶解胆固醇、生物素偶联的磷乙醇胺和L-α-磷酸胆碱（总计5毫克），摩尔比为1:2:7，然后混合。在40°C下旋转蒸发5分钟，在瓶内形成磷脂/胆固醇薄膜。随后加入5毫升Ag NPs，去除脂质膜，1小时内形成Ag-lip-biotin。所得溶液然后加入含有400纳米
Pt NPs催化和Ag NPs自氧化的碰撞信号与施加电位的关系
本实验中使用的Ag NPs和Pt NPs是根据简单的种子介导方法合成的（详细的合成步骤见补充信息S3-S4）。合成的Ag NPs直径为24.1纳米（图S1），浓度为7.1 nM；Pt NPs直径为24纳米（图S2），浓度为0.30 nM。实验中使用的工作电极为采用火焰密封方法制备的Au UME（图S3）。
结论
总之，我们提出了一种新型的电位分辨SNCE生物传感器，用于同时检测MCF-7和SK-BR-3细胞。其主要优点包括：（1）IMBs能够在15分钟内特异性捕获超过88.9%的MCF-7细胞和88.6%的SK-BR-3细胞；（2）脂质体能够快速水解并释放大量Ag NPs和Pt NPs，从而实现目标与NPs之间的信号转换；（3）该生物传感器能够同时检测多个癌细胞。
CRediT作者贡献声明
Shengfu Wang：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源提供。Xiuhua Zhang：调查、数据分析、数据整理、概念构建。Zhongmin You：调查、数据分析、数据整理、概念构建。Wenbo Yu：调查、数据分析、数据整理、概念构建。Wei Wen：调查、数据分析、数据整理、概念构建。Jiannan Wu：调查、数据分析、数据整理、概念构建。Fuxing Qin：撰写——审稿与
?作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：无
本工作得到了中国国家自然科学基金（编号：22274037、22076042、21904032）、武汉探索计划（2024040801020307）以及湖北省自然科学基金（编号：2022CFB383）的支持。
