基于热稳定蛋白纳米笼的支架结构，用于高效实现聚酯的降解

《Bioresource Technology》：Thermostable protein Nanocage–Based scaffold for robust polyester depolymerization

　　

徐东|郑杜乐|施豆娟|程晓琪|徐曼莉|马立新|江文学|邢琼

中国湖北大学生命科学学院，武汉430074

摘要

聚酯塑料的积累给高效回收策略带来了重大挑战。酶促解聚是一种有前景的生物技术方法，但往往受到酶不稳定性和昂贵纯化程序的限制。在这里，我们报道了一种来自大肠杆菌BetT蛋白（BetTC）C末端结构域的热稳定自组装蛋白质纳米笼支架，用于聚酯解聚。一种聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）水解酶变体（ICCG，一种工程化的角质酶）通过合理设计的接头与纳米笼基因融合，构建了一种生物杂化纳米催化剂。对不同接头结构的系统评估表明，酶在纳米笼上的呈现方式对催化活性有重要影响。特别是，刚性的脯氨酸-甘氨酸（PG）接头结构使PET的降解速率比游离的ICCG高出约两倍，同时其对聚丁酸 adipate-对苯二甲酸酯（PBAT）的活性也得到增强。该纳米笼还赋予了卓越的热稳定性，在50℃下长时间孵育后仍保持结构完整性。值得注意的是，这种纳米催化剂在未纯化的大肠杆菌裂解液中仍保持活性，从而实现了一个简化、无需纯化的生物催化过程。总体而言，本研究建立了BetTC纳米笼作为一种有效且可工程化的蛋白质支架，用于开发用于聚酯解聚的稳健生物催化剂，这是回收过程中的关键一步。

引言

合成聚酯塑料的快速积累已成为全球性的环境挑战。PET和PBAT分别是广泛用于包装和可生物降解材料的代表性聚酯聚合物。传统的聚酯塑料处理和回收方法通常涉及能源密集型过程或产生混合废弃物流（Damayanti；Wu, H. S. Strategic Possibility Routes of Recycled PET. Polymers-Basel, 2021, Clark and Shaver, 2024）。例如，聚酯塑料的机械回收涉及反复熔化，这会导致高能耗、氧化和降级。另一方面，化学回收需要高压和大量溶剂（Bohre et al., 2023, Damayanti; Wu, H.-S. Strategic Possibility Routes of Recycled PET. Polymers-Basel, 2021）。这些挑战促使人们开发替代的回收策略。因此，人们对开发高效且可控的聚酯基材料解聚和回收策略越来越感兴趣。

聚酯水解酶已在受控条件下被广泛研究作为聚酯解聚的生物催化剂（Zeng et al., 2022, Guo et al., 2024, Son et al., 2019, Lee et al., 2024, Lee et al., 2023, Tournier et al., 2020）。然而，在工艺相关条件下实现稳定和持久的酶性能以及简化制备过程方面仍存在挑战。人们已经探索了固定化策略来调节酶的稳定性和再利用（Wang et al., 2024, Jia et al., 2021, Kotnis et al., 2025, Schwaminger et al., 2021, Aer et al., 2024）。尽管在酶工程方面取得了进展，但大多数报道的系统仍依赖于纯化的酶或外部载体的固定化，这增加了处理的复杂性和成本。此外，一些传统载体材料对酶的方向和空间组织控制有限，可能会限制催化效率。这些局限性促使人们开发能够精确和可编程地展示酶的替代支架。

在这方面，基因编码的蛋白质纳米材料因其精确定义的架构、遗传可编程性和结构可调性而成为一类有前景的生物支架（Zhang et al., 2018, Mak et al., 2025, Mezgec et al., 2024, Li et al., 2024, Meng et al., 2025, Ledesma-Fernandez et al., 2023）。它们有序的几何结构允许合理设计表面功能性和催化模块的空间排列，这对于构建高效的生物催化系统是非常理想的属性。然而，虽然有几项研究探讨了固定化策略来提高聚酯水解酶的性能（Wang et al., 2024, Jia et al., 2021, Kotnis et al., 2025, Schwaminger et al., 2021, Aer et al., 2024），但将蛋白质纳米支架作为聚酯解聚的集成和模块化平台的使用——特别是在长期支架稳定性和最小化处理条件下的操作方面——仍然缺乏系统的研究。

在这项研究中，我们提出了一种来自大肠杆菌胆碱转运蛋白BetT C末端结构域的热稳定自组装蛋白质纳米笼。这种纳米笼作为一种多功能蛋白质支架，用于组织和稳定降解聚酯的酶。首先，BetTC纳米笼具有多孔结构，并暴露出C端功能化位点。这种结构允许PET水解酶变体（ICCG）（Tournier et al., 2020）与BetTC纳米笼表面共价结合。由此产生的纳米催化剂在测试条件下增强了PBAT和PET的降解效率，并且在未纯化的细胞裂解液中保持了较高的催化活性。这使得操作无需纯化，并简化了整个生物催化过程。总体而言，我们的发现提供了一种基于蛋白质的支架策略，用于开发用于聚酯解聚的稳定且模块化的生物催化剂，这是回收过程中的关键一步。

章节片段

蛋白质样品制备

编码大肠杆菌BetTC蛋白（残基501至667）的基因被克隆到带有sfGFP标签的pET23a载体中。使用QuikChange方法引入了BetTC和ICCG之间的连接，并在表S1中显示了野生型和连接引物的序列。该质粒被转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株（Sigma-Aldrich）中进行蛋白质表达。细胞培养最初在Luria–Bertani（LB）培养基中进行

基于蛋白质的聚酯解聚生物催化剂平台的结构基础

为了开发一个稳健的基于蛋白质的生物材料平台，我们专注于大肠杆菌胆碱转运蛋白BetT（BetTC）的C末端结构域。编码BetTC C末端结构域的基因（残基501至667）从大肠杆菌中克隆出来，并插入pET23a表达载体中，带有自动分泌的sfGFP标签（Zhang et al., 2017）。BetTC在BL21(DE3)中过表达，并且可以从细胞中轻松提取，产量约为200mg/L（图S1A），表明其

结论

在这项研究中，我们将BetTC蛋白纳米笼设计为一种热稳定且结构明确的生物催化聚酯解聚支架。ICCG与BetTC的融合增强了催化活性和热稳定性，其中刚性的PG接头被证明是酶的最佳定位方式。性能的提高可以通过几个机制因素来解释：1. 多价纳米笼增加了酶与底物的有效接触机会；2. 与刚性笼体的融合

CRediT作者贡献声明

徐东：写作 – 审稿与编辑，撰写原始稿件，项目管理，概念构思。郑杜乐：研究，数据管理。施豆娟：研究。程晓琪：研究。徐曼莉：研究。马立新：写作 – 审稿与编辑，资金获取。江文学：写作 – 审稿与编辑，资金获取，概念构思。邢琼：写作 – 审稿与编辑，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本项目得到了湖北省技术创新计划（2024BCA001，针对邢琼和马立新）、湖北省科技计划项目（2021CSA066，针对邢琼和马立新）以及国家自然科学基金（32371277，针对邢琼；32301028，针对江文学）的支持。