环状RNA Phc3通过调控miR-93/PHF6和ACTN4信号通路来促进肠道黏膜屏障的损伤修复

《Burns》：The circular RNA Phc3 promotes the repair of damage to the intestinal mucosal barrier by regulating the miR-93/PHF6 and ACTN4 pathways

　　otation朱梦梦 | 李冉 | 王一文 | 山宁 | 王志 | 王佩佩 | 王文生 | 张芳 | 周佳云 | 孟超 | 孙勇中国江苏省徐州市徐州医科大学附属淮海医院烧伤外科，邮编221004abstract authorabstract背景非编码RNA（如环状RNA（circRNA）在人体中含量丰富，能够影响多种疾病的发病和发展。然而，它们在修复肠黏膜损伤中的作用尚不清楚。方法本研究使用RT-qPCR技术分析烧伤损伤肠黏膜中circRNA和信使RNA的表达水平，并通过荧光原位杂交（FISH）技术检测circPhc3的定位。在CCK8和划痕实验模型中，通过体外和体内实验验证了circPhc3过表达的效应。在机制层面，采用了免疫组化染色、染色质免疫沉淀（ChIP）、Luciferase报告基因实验、Western blotting、串联亲和纯化结合质谱（TRAP-MS）分析和RNA免疫沉淀（RIP）等技术。结果研究发现，烧伤小鼠的肠黏膜中circPhc3的表达水平下调。这种蛋白质的高表达与受损肠黏膜的完整性呈正相关。体外和体内实验表明，circPhc3的过表达显著增强了小鼠肠上皮细胞的迁移和增殖能力。分子机制分析表明，circPhc3特异性结合miR-93，从而上调PHF6的表达，最终促进细胞增殖和迁移。此外，circPhc3还能招募ACTN4蛋白，从而促进肠黏膜的修复过程。结论综上所述，circPhc3通过两种机制促进细胞迁移和增殖能力：ceRNA海绵机制和RNA结合蛋白（RBPs）机制。这加速了受损肠黏膜的修复。介绍肠道是受到创伤应激影响最大的器官之一。在烧伤[1]、创伤或大手术后，压力、组织缺血和缺氧以及感染等因素都可能导致肠黏膜屏障受损。细菌移位[2]、内毒素扩散和无法控制的炎症反应可能导致多器官功能障碍综合征（MODS），这在重症监护医学中一直是一个重要问题[3]。据统计，MODS的死亡率超过30%，每年导致全球约500万人死亡。MODS也是全球导致死亡、残疾和医疗支出的主要原因之一；因此，保护肠黏膜免受有害因素的损伤并促进受损肠黏膜的修复对于维持重症监护环境中的器官功能具有重要的科学意义，同时也是一个亟待解决的临床挑战。近年来，环状RNA（circRNA）作为一种非编码RNA逐渐被发现和研究。circRNA具有闭合环状结构，不会被核酸外切酶降解，因此比传统的线性RNA更稳定。这一特性使circRNA在基因治疗靶向和疾病分子生物标志物的开发方面具有独特优势[4]。circRNA现在被认为是基因表达的关键调节因子。它们主要作为microRNA（miRNA）海绵，调节转录并与RNA结合蛋白（RBPs）相互作用，从而影响各种生理和病理过程[5]。CircPhc3来源于母体Phc3基因的2-7外显子，该基因位于3号染色体30953520-31023564位点，全长896 bp，属于Polycomb蛋白家族。研究表明，这类蛋白在调控细胞增殖和分化中起核心作用[6][7]，其功能障碍与多种疾病密切相关，使其成为癌症治疗的重要靶点[8]。PHF6基因包含11个外显子，转录产生的mRNA长度为4.5 kb，随后翻译成由365个氨基酸组成的41 kDa蛋白质。PHF6蛋白在脊椎动物中高度保守，结构上包含两个植物样 Zinc finger（PHD）结构域、两个核定位序列和一个核仁定位序列，表明PHF6可能在转录调控中发挥作用。PHD结构域中的Cys4-His-Cys3基序与两个Zn2?离子结合，稳定了PHF6蛋白的结构。PHD指结构域还能识别特定的组蛋白修饰，并通过招募多功能蛋白复合物调节表观遗传读物的转录功能[10]。现有研究表明，PHF6能够促进细胞迁移[11]。ACTN4是一种F-actin交联蛋白，属于参与调控细胞骨架动态的actin结合蛋白家族。最初作为与癌细胞运动密切相关的非肌肉α-actin蛋白被描述，后续研究证明该蛋白具有多种功能，包括组织细胞骨架内的细胞质结构[12]、调节核转录因子活性[13]和病毒复制[14]。近年来的证据表明，ACTN4能促进结直肠癌的迁移和淋巴结转移[15]，以及宫颈癌的上皮-间质转化和癌变[16]，进一步证实了其在细胞增殖、运动和EMT中的重要作用[16]。本研究利用RNA-seq技术发现，受损肠黏膜组织中circPhc3的表达显著下调，并与预后密切相关。提高circPhc3的表达可增强细胞增殖和迁移能力，同时改善跨上皮电抵抗（TEER）值，表明肠黏膜屏障的完整性得到改善。研究还发现，circPhc3通过两种途径调节细胞增殖和迁移：它作为一种竞争性内源性RNA（ceRNA）与miR-93和PHF6结合，同时与RNA结合蛋白ACTN4相互作用。circPhc3为未来基于circRNA的基因治疗和肠黏膜屏障损伤后的小分子化疗提供了理论基础。章节片段细胞培养使用的Kedinger（MODE-K）小鼠十二指肠上皮细胞来源于中国上海生物科学研究所。该细胞系在含有10%胎牛血清（FBS；Clark Biotechnology Co., China）和1%抗生素/抗真菌剂的DMEM培养基（Gibco，目录编号11965092）中培养，培养环境为37°C、5% CO2的湿润条件。细胞转染使用的阴性对照siRNA（si-NC）、circPhc3 siRNA、PHF6 siRNA、ACTN4 siRNA、miR-93模拟物等。circPhc3的特征Mmu_circ_35212来源于Phc3基因的2-7外显子，基因位于3号染色体30953520-31023564位点，全长896 bp，属于Polycomb蛋白家族（图1A）。由于环状RNA的独特结构，它们比线性基因更耐RNase R酶的降解[18]。内源性circPhc3对RNase R酶的降解具有抗性；然而，小鼠十二指肠上皮细胞（MODE-K）中的Phc3线性mRNA含量...讨论肠道是人体内的重要器官，具有消化、吸收、蠕动、分泌和免疫等功能，这些功能有助于维持正常的生理过程[20]。早在1986年，Meakins就提出“胃肠道是多器官衰竭（MOF）的起始器官”；1988年，Wilmore进一步指出“肠道是外科应激的中心器官”[21]。此后，肠道功能逐渐成为研究的重点...伦理声明所有动物实验均经徐州医科大学动物伦理委员会批准（批准编号202501T012）。参与者知情同意不适用。图像使用知情同意不适用。数据可用性不适用。临床试验编号不适用。资金支持本研究得到了国家自然科学基金（批准编号82302798）、江苏省卫生健康委员会医学研究项目（M2024032）和中国人民解放军第71集团军医院基金（YNMS-2021006，YNZD-2022002）的支持。作者贡献声明朱梦梦：概念设计、数据整理、数据分析、资金获取、监督、写作及审稿编辑；李冉：数据整理、数据分析、研究方法设计、项目管理、软件使用；王一文：数据整理、数据分析、研究方法设计、项目管理、软件使用；山宁：资源提供、验证、监督；王志：资源提供、验证、监督；王佩佩：软件使用、数据可视化；王文生：软件使用...声明作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。