批量RNA测序技术有助于识别瘢痕组织中与线粒体及程序性细胞死亡相关的生物标志物

《Burns》：Bulk RNA sequencing identifies biomarkers for mitochondrial and programmed cell death in keloids

　　

李素月|魏峰|张丽华|王梦琪|金玉梅|李彦玲

河北省医科大学第二医院皮肤科，石家庄，050000，中国

摘要

目的

基本程序

进行了批量RNA测序，以识别差异表达基因（DEGs），并研究KD与对照组之间最相关的模块基因。候选基因来自DEGs、加权基因共表达网络分析模块基因、与PCD相关的基因以及与线粒体相关的基因。通过两种互补的基于机器学习的方法筛选KD生物标志物，随后对其生物学功能、网络特性和药物相互作用潜力进行了全面分析。最后，分析了KD组中差异浸润的免疫细胞。

主要发现

在这项基于24个样本（12个KD vs. 12个对照）的初步探索性研究中，确定了三个生物标志物。所有生物标志物均参与氧化磷酸化和核糖体功能。随后预测了4个miRNAs和10个转录因子（TFs）；6个TFs由PRDX4预测，58个miRNAs和10个TFs由PDK2预测。此外，KD组和对照组中存在六种不同的免疫细胞，如中央记忆CD8⁺ T细胞。最后，双酚A在分子对接实验中显示出对生物标志物的强结合亲和力。然而，由于其众所周知的多系统毒性，它没有直接的临床治疗价值。因此，双酚A应仅作为机制研究的结构探针考虑，而不是治疗候选物。

主要结论

本研究确定了UQCRC1、PRDX4和PDK2作为瘢痕疙瘩（KD）的候选生物标志物，为阐清楚线粒体和编程性细胞死亡在KD中的调控机制提供了理论支持。所有结论仅基于生物信息学分析，没有体外或体内实验验证，因此这些发现仍然是假设性的，需要在未来的研究中进行严格确认。

引言

作为参与有氧呼吸的主要细胞器，线粒体通过氧化磷酸化为细胞产生能量，生成三磷酸腺苷（ATP）[4]。它们具有多功能性，调控着关键的生物过程，包括编程性细胞死亡（PCD）和活性氧（ROS）的稳态[5]、[6]。PCD是一种基因调控的细胞死亡机制，对多细胞生物的稳态维持和发育至关重要[7]。这种进化保守的过程包括至少18种不同的死亡方式，如凋亡、坏死性凋亡、自噬、铁死亡、焦亡、铜死亡、溶酶体依赖性细胞死亡和氧死亡[8]。PCD与线粒体膜电位和Ca²⁺浓度的变化等因素密切相关[9]。相比之下，坏死性凋亡是由线粒体损伤引起的，导致ATP合成减少和ROS过度产生[10]。线粒体是自噬体形成和自噬性细胞死亡过程中降解的重要靶点[11]。KD组织中的线粒体凋亡途径已被激活。线粒体功能障碍影响细胞代谢功能，观察到线粒体DNA控制区域变异与KD形成之间存在相关性[12]。此外，线粒体功能障碍可能通过改变能量代谢、氧化应激和凋亡等机制促进KD的形成和发展[13]。KD的标志性病理特征包括成纤维细胞过度增殖和异常的ECM沉积。通过抑制增殖和诱导凋亡来针对成纤维细胞过度生长的治疗策略在减轻KD进展方面显示出显著潜力[14]。总之，线粒体和PCD在KD中起着关键作用；它们之间也相互影响。共分析了与线粒体相关的基因（MRGs）和与PCD相关的基因（PCD-RGs），以探索它们在KD中的共同作用机制，并为KD的治疗设计提供科学参考。

鉴于线粒体和PCD在KD中的这些关键作用，本研究收集了KD的临床样本进行高通量转录组测序。进行了一系列生物信息学分析，以识别与线粒体和PCD相关的生物标志物，并探索它们在KD中的作用机制。这些发现可能有助于建立一个理解线粒体-PCD相互作用的知识库，促进精准疗法的发展。

节片

收集了12例KD和正常皮肤组织（对照组）的样本进行高通量RNA-seq。提取RNA后，使用Bioanalyzer评估RNA完整性（RNA完整性数（RIN）> 7.0），并通过琼脂糖凝胶电泳验证。然后，使用Dynabeads Oligo(dT)进行两轮纯化以富集poly(A) RNA。对于文库制备，将94°C下处理5–7分钟的片段RNA逆转录为双链DNA

获得了11个候选基因

WGCNA显示数据中没有异常样本（图1A），当R² = 0.85时，最佳软阈值是15（图1B）。获得了所有八个共表达模块，包括无法聚类的灰色模块（图1C）。棕色模块（cor = 0.82）和青绿色模块（cor = ?0.70）与KD的相关性最高（p < 0.05）（图1D）。通过筛选GS > 0.2和MM > 0.8，共获得了1,397个WGCNA模块基因（图1E, F）。总共

讨论

KD是由于皮肤过度纤维化形成的，这种情况可能发生在任何皮肤创伤之后，导致向周围正常皮肤突出的突起，通常不会自行消退[25]、[26]。KD的发生率很高[27]，通常发生在手术、创伤、耳洞穿刺等之后。目前的治疗方法容易导致疤痕复发且效果不佳[28]。在这项研究中，进行了高通量转录组测序

伦理批准（适用的研究伦理委员会编号）

本研究按照赫尔辛基声明的指南进行，并得到了伦理委员会的批准（协议代码2024-R354，批准日期为2024年5月28日）。已获得人类受试者的知情同意。

知情同意

NA

临床试验编号

20250499

资助

本研究得到了河北省医学科学研究项目（20250499）的支持。

CRediT作者贡献声明

李素月：概念化、数据管理、验证、可视化、撰写–初稿、撰写–审阅与编辑；魏峰：数据管理、验证、可视化、撰写–审阅与编辑；张丽华：验证、撰写–审阅与编辑；王梦琪：数据管理、验证；金玉梅：数据管理、验证；李彦玲：概念化、项目管理、监督、撰写–审阅与编辑。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

撰写过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

NA

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：本研究得到了河北省医学科学研究项目（20250499）的支持。