正常小鼠大脑接受放射治疗的六个月期副作用评估：FLASH与常规质子部分脑照射方法的对比

《Clinical and Translational Radiation Oncology》：Six-month evaluation of normal mouse brain side effects: Comparing FLASH and conventional proton partial brain irradiation

　　曼努埃尔·贝尔纳贝伊（Manuel Bernabei）| 辛迪·内克希皮（Sindi Nexhipi）| 伊丽莎白·博登斯坦（Elisabeth Bodenstein）| 菲利克斯·霍斯特（Felix Horst）| 阿明·卢尔（Armin Lühr）| 约尔格·帕维尔克（J?rg Pawelke）| 莫里茨·施奈德（Moritz Schneider）| 米夏埃尔·舒勒（Michael Schürer）| 罗曼·施瓦茨（Roman Schwarz）| 安杰·迪特里希（Antje Dietrich）| 埃尔克·贝洛伊特胡瑟（Elke Beyreuther）
奥恩科雷（OncoRay）——德国德累斯顿工业大学（TUD Dresden University of Technology）医学系和卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯大学医院的国家放射肿瘤研究中心，德国德累斯顿-罗森多夫赫尔姆霍兹中心（Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf）

**摘要**
**背景与目的**
临床前研究表明，超高质量率（UHDR）放射治疗能够有效控制局部肿瘤生长，同时减少对健康组织的损伤。这项方法学上的初步研究旨在建立一种辐照方案，并为未来研究提供数据，以探讨使用质子FLASH（FLASH-PT）和传统质子疗法（CONV-PT）对小鼠大脑进行长期辐照的副作用。

**材料与方法**
14只C57BL/6JRj雌性小鼠接受了单次22.5 Gy剂量的质子辐照，采用质子展宽布拉格峰（SOBP）技术。小鼠被随机分为FLASH-PT组（268 Gy/s，n=6）、CONV-PT组（0.27 Gy/s，n=6）以及未受辐照的对照组（n=2）。除了监测短期皮肤反应外，还在六个月的随访期间定期进行增强磁共振成像（MRI）。大脑样本经过福尔马林固定和石蜡包埋后进行染色，以评估小胶质细胞的活性变化。

**结果**
皮肤反应分析显示FLASH组具有明显的组织保护效果。在脑部MRI中，辐照后未观察到对比增强现象。尽管FLASH-PT组和CONV-PT组之间小胶质细胞活化程度没有显著差异，但两种处理方式都显示出活化的小胶质细胞数量增加，这种变化在脑室周围区域尤为明显。

**结论**
所建立的辐照方案为临床前FLASH-PT研究提供了可行的方法。部分脑部辐照未表现出与FLASH效应相关的特征。需要进一步的研究来全面了解大脑中FLASH效应的剂量-反应曲线及其时间机制。

**引言**
质子放射治疗（PT）被认为是治疗儿童和成人脑肿瘤患者的领先方法之一[1]。质子的特点是其剂量峰值（布拉格峰）位于能量谱的末端，与传统基于光子的放疗技术相比，这种分布方式更能保护健康组织[2]。治疗效果的提升延长了患者的生存期，因此人们对脑放射治疗的晚期副作用给予了更多关注[3]。
在临床实践中，患者可能会出现放射引起的脑损伤（RIBI），这种并发症通常通过磁共振成像（MRI）检测到的对比增强现象来发现[4]。这种放射学发现可能先于神经系统症状的出现，因为脑部辐照与长期神经认知功能下降的风险相关[5][6]。因此，研究新的质子治疗方法有助于进一步减少长期副作用并提高生存率[7]。
超高质量率（UHDR）放射治疗通过减少放射对健康组织的毒性效应来扩大治疗窗口，同时保持与传统放射治疗相当的肿瘤控制概率，这一现象被称为“FLASH效应”[8][9]。以UHDR（> 40 Gy/s）剂量进行辐照可以诱导FLASH效应；然而，该效应的强度可能因研究终点和辐照剂量参数的不同而有所差异[10][11]。大多数研究大脑FLASH效应的临床前实验采用了全脑辐照方式[12][13][14]。相比之下，临床实践中常见的部分脑部辐照可能导致不同的分子、细胞和神经认知效应[15]，从而影响FLASH效应的表现。
为阐明质子治疗的长期影响，Suckert等人[16]开发了一种临床前小鼠模型来模拟临床实践中常用的局部辐照策略。质子辐照后，临床前MRI扫描显示出对比增强的病灶（CEL），表明血脑屏障受损，反映了RIBI的临床情况。对这些辐照小鼠大脑的组织学分析显示，辐照区域的小胶质细胞和星形胶质细胞的密度和活性均有所增加[17][18]。活化的小胶质细胞会加剧辐射引起的神经炎症反应[19]。持续的小胶质细胞活化和星形胶质细胞增生会导致慢性神经炎症状态，进而影响神经发生，导致认知功能障碍[20]。

**本研究旨在通过调整Suckert等人的小鼠模型来研究UHDR质子治疗（FLASH-PT）与传统质子治疗（CONV-PT）对健康组织的长期影响。** 必要的超高质量率通过展宽布拉格峰（SOBP）质子束实现，该束流照射包含两侧海马体的一部分。随后，在六个月的随访期间定期进行MRI扫描，以监测脑部病变的发展，并通过后续组织学分析评估小胶质细胞的反应情况。同时记录小鼠的皮肤反应，以独立验证急性反应组织中的FLASH效应。

**材料与方法**
该动物实验严格遵循欧盟指令2010/63/EU、德国《动物福利法》（TierSchG）和《动物福利实验动物条例》（TierSchVersV）的规定，并获得了萨克森州政府（Landesdirektion Sachsen，DD24.15131/449/32）的批准。14只10周大的C57BL/6JRj雌性小鼠被随机分为三组：FLASH-PT组（n=6）、CONV-PT组（n=6）和对照组（n=2）。辐照在德累斯顿奥恩科雷（OncoRay）实验大厅的水平固定束流线上进行[21][22]；关于束流和剂量传递参数的详细信息见表1。简而言之，使用3D打印范围调节器（VisiJet M2S-HT250打印材料）将225 MeV质子束调制为1.5 cm宽的SOBP，穿过小鼠头部的整个内侧长度（图1A）。质子束经横向准直，形成直径5 mm的辐照场，仅照射大脑的特定区域。每只小鼠分别接受0或22.5 Gy的单次照射。FLASH-PT的剂量为268 Gy/s，主要照射区域的剂量率为268 Gy/s以上；CONV-PT的剂量为0.27 Gy/s。实际照射剂量分别为22.6 ± 0.11 Gy和22.5 ± 0.02 Gy，皮肤入口剂量为23.9 Gy，皮肤出口剂量为21.2 Gy。小鼠的麻醉方法参照Suckert等人[16]的方案进行。临床前研究表明[25][26]，FLASH效应的神经保护作用依赖于氧气饱和度，当动物在含氧混合气体中接受异氟烷麻醉时该效应会消失。为了避免辐照期间吸入氧气的影响，小鼠使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉，并置于温度控制的饲养装置中，然后用电动载物台固定。通过质子放射成像和专用软件确保海马体位于质子束的中心轴上（图1B）。

**表1. 用于UHDR和传统质子束照射小鼠大脑的参数**

**随访**
辐照后，小鼠每周接受两次监测，持续180天，按照RTOG/EORTC指南[28]评估放射引起的皮肤反应。在定义的时间点（辐照后3周、6周、9周、12周、16周、20周和24周）进行序列增强MRI扫描，并注射基于钆的造影剂（Magnevist，浓度0.5 mmol/ml，100 μl，拜耳公司，勒沃库森，德国）。麻醉采用1–2%异氟烷与氧气的混合气体。T1加权MRI扫描使用BioSpec 3T临床前MRI系统（布鲁克公司，美国比勒里卡）进行，以检测CELs。由于技术原因，第12周之前的MRI数据无法用于分析。

**组织学分析**
随访结束后，小鼠被处死，其大脑按照先前描述的步骤进行福尔马林固定和石蜡包埋[16][29]。将大脑切成每片3 μm厚的横截面，切片间隔为100 μm，共获得5–6张用于评估的组织学切片[17]。使用离子化钙结合适配分子1（Iba1，Novus Biologicals，美国科罗拉多州森蒂伦）标记小胶质细胞。Iba1调节细胞骨架动态和重塑，使其成为研究小胶质细胞形态的有用标记物。所有切片使用AxioScan.Z1切片扫描显微镜（卡尔蔡司公司，德国德累斯顿工业大学CMCB技术平台核心设施）进行染色和成像。

**图像分析**
所有全脑图像均使用图像分析软件FIJI（ImageJ 2.9.0版本，美国国立卫生研究院）进行解析[30]。小胶质细胞分析采用Nexhipi等人[17]开发的算法。该算法将小胶质细胞分段，并根据细胞形态将其分为三组：未活化、活化和高活化。活化程度的判断基于细胞的圆形度和面积计算M Score[31]。活化的小胶质细胞会重新排列细胞质结构，采用更紧凑的圆形形态，从而提高圆形度值[32]，进而提高M Score，表明活化程度更高[33]（图2）。分析涵盖整个大脑区域，排除了嗅球、小脑和桥脑。未激活的细胞具有分支形态（M分数 > 0且≤ 1），激活的细胞呈阿米巴状（M分数 > 1且≤ 2），高度激活的细胞呈圆形形态（M分数 > 2）。刻度条 = 20 μm。

统计分析
使用Mantel–Cox检验来确定FLASH-PT和CONV-PT之间辐射诱导皮肤反应发展时间的差异显著性。Welch's t检验（双尾）用于比较FLASH-PT和CONV-PT之间的不同小胶质细胞密度。统计显著性定义为不显著（p ≥ 0.05）、显著（p < 0.05），随着显著性的增加（p < 0.01, p < 0.001），表示对零假设的反对证据更加强烈。

结果
与CONV-PT相比，FLASH-PT的急性皮肤反应延迟
皮肤反应的分析针对红斑和脱毛进行，这是小鼠中唯一可见的副作用（RTOG等级1）。观察到CONV-PT和FLASH-PT小鼠组之间辐射诱导的急性皮肤反应的时间发展存在明显差异。在照射后的第五周，所有接受CONV-PT治疗的小鼠在照射区域都表现出皮肤反应。相比之下，所有接受FLASH-PT治疗的小鼠在第七周中期开始出现皮肤反应，与CONV-PT治疗相比显示出明显的延迟。从第十周开始，两组小鼠都逐渐从与皮肤相关的并发症中恢复。实际上，脱毛的小鼠在头部照射区域开始重新长出白色毛发。Mantel-Cox检验（χ2 = 2.89，df = 1，p = 0.089）证实了FLASH-PT小鼠组皮肤反应发展延迟的趋势（图3A）。

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图3. 质子治疗后辐射诱导皮肤反应的发展时间线及随访结束时的MRI扫描。（A）该图显示了FLASH-PT和CONV-PT组的皮肤反应的发展和恢复情况。数据点表示治疗组中每只小鼠在评分日的RTOG平均值。阴影代表平均值的标准差。（B）选定的每组治疗小鼠在照射后24周的T1加权MRI扫描的代表性图像：CONV-PT（左），FLASH-PT（中）和假对照（右）。图中包含一个小鼠图标，以提供关于小鼠头部方向的解剖参考。刻度条 = 5 mm。

随访期间未检测到任何增强对比度的病变
在六个月的随访期间，所有T1加权MRI图像均未显示任何受照小鼠或对照小鼠存在对比度增强的证据。图3B显示了照射后24周时，与组织切片深度相对应的脑区的代表性图像。

脑室周围区域激活的小胶质细胞密度增加
每个治疗组选取五个大脑样本和一个对照大脑样本进行切片和后续分析。图4显示了代表性小鼠在整个脑区三种不同小胶质细胞激活状态下的密度分布。在同一照射组内，观察到小胶质细胞在空间分布上的个体差异（补充材料图S4.1和S4.2）。总体而言，未激活的小胶质细胞密度在整个脑区相对均匀。随着激活状态的增加，高密度的小胶质细胞区域逐渐集中在脑室周围外侧区域。有趣的是，这种增加主要集中在靠近中脑的纤维束上。在整个脑区范围内，FLASH-PT组和CONV-PT组之间未发现未激活、激活和高度激活的小胶质细胞密度存在统计学上的显著差异（图5）。每只小鼠分析的大脑切片表格（表S1）和代表性的激活图（图S4.1和S4.2）列在补充材料中。

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图4. 整个脑区的小胶质细胞密度分布图。该图表示不同治疗组中选定小鼠在匹配的束中心位置的小胶质细胞分布情况。图像是通过绘制每个切片中小胶质细胞的质心坐标点，并根据激活状态进行颜色编码而制作的。所有地图中，总小胶质细胞数量以灰色表示作为参考。刻度系统单位为毫米。

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图5. 整个脑区不同激活状态的小胶质细胞密度。该图显示了整个脑区不同激活状态的小胶质细胞密度箱形图。对于每只小鼠，分析了5-6个大脑切片，并对密度进行了平均处理，以获得每只小鼠的单一值。这些单一值随后被用来计算FLASH-PT和CONV-PT组的平均值。箱形图表示四分位数范围，黑线表示组的中间值。点表示单个小鼠的值，超出 whiskers 的数据点被视为异常值。绿线表示对照小鼠的值（5个大脑切片的平均值，只有1只对照小鼠）。（关于此图例中颜色的解释，请参阅文章的网页版本。）

讨论
在这项初步研究中，我们评估了FLASH-PT与CONV-PT治疗后的长期脑组织并发症。尽管大多数临床前研究涉及全脑照射，但部分脑SOBP剂量传递代表了肿瘤治疗的临床实际情况。在这种情况下，FLASH效应可能有助于减少对正常组织的潜在副作用。在六个月的随访期间定期进行MRI扫描，以监测治疗可能引起的任何对比度增强。随访结束时，我们检查了小胶质细胞的激活情况，未发现FLASH-PT和CONV-PT照射之间存在差异。然而，观察到FLASH-PT的皮肤反应出现延迟的趋势。这项初步研究评估了所描述照射设置的可行性，并生成了初步数据，以指导未来FLASH-PT和CONV-PT治疗的比较。此类研究的统计功效较低，因为样本量较小。实际上，目的是估计组间变异性和效应大小，以规划更高级的确认实验。

许多临床前研究表明，FLASH-PT在早期反应组织（如皮肤[34]，[35]）中具有保护作用。在我们的研究中，与CONV-PT相比，FLASH-PT治疗的小鼠辐射诱导的红斑和脱毛出现得较晚（图3A）。这一趋势与S?rensen等人[36]的发现一致，他们报告FLASH-PT对皮肤组织有明显的保护作用。

常规MRI未显示任何对比度增强的区域（图3B）。使用当前的设置，我们照射的脑体积是Suckert等人[16]使用的体积的两倍多，后者报告称在45 Gy CONV-PT后，10周随访时可以在MRI上检测到CELs。为了补偿更大的体积，我们有意应用了较低的剂量以避免对小鼠造成痛苦；然而，22.5 Gy的剂量不足以诱导出可检测到的CELs。据我们所知，目前缺乏研究体内FLASH对CELs影响的临床前研究。我们的发现表明，无论照射的脑体积如何，可能需要Suckert等人[16]使用的剂量范围才能在MRI上检测到CELs。

照射后六个月内小胶质细胞的激活表明存在慢性神经炎症，这可能是神经元损伤的主要驱动因素[37]。根据受影响的脑区不同，持续的神经炎症可能导致不同的中枢神经系统（CNS）病理。识别易发生持续神经炎症的脑区有助于改善肿瘤患者的治疗后生活质量[38]。如图4所示，对于FLASH-PT和CONV-PT，我们都发现了沿脑室周围外侧区域散在的激活和高度激活的小胶质细胞密度增加。这种模式与Nexhipi等人[17]的发现一致，并支持该区域更高的敏感性，这一点也在临床数据中得到证实[39]。这些结果对于FLASH-PT和CONV-PT都表明，脑室周围区域的亚结构可能比其他区域更敏感，这是一个重要的假设，值得未来研究探讨。此外，小胶质细胞密度图（图4；补充材料中的图S4.1和S4.2）显示了中脑方向和前脑方向脑室周围区域之间的激活密度差异。然而，如图1A所示，脑室周围区域并未完全包含在照射范围内，这一观察结果需要进一步验证。值得注意的是，Barko等人[40]的结论支持了在中脑方向区域观察到的激活密度增加模式，他们报告了中脑与前脑驻留小胶质细胞之间的转录组特征差异，表明中脑小胶质细胞比前脑小胶质细胞更易于参与免疫反应。然而，由于所选剂量引起的效应相对较轻，因此在FLASH条件下检测潜在毒性降低的范围本身是有限的，需要在未来的研究中进行验证。

总之，在22.5 Gy单次分次部分脑FLASH-PT治疗后6个月，未发现FLASH对小胶质细胞激活有保护作用的证据。皮肤反应的分析表明有保护性FLASH效应的趋势，但在我们的治疗条件下，我们未能证明其神经保护作用。尽管如此，我们建立了一种临床前SOBP照射设置，用于小鼠的部分脑体积照射，这接近临床治疗。未来的工作将使用这种设置进行全规模研究，以评估早期皮肤反应、MRI对比度增强和长期分子标志物。未来的研究方向将是建立FLASH-PT后小胶质细胞激活密度的剂量-效应曲线，包括更多和更早的随访时间点。