具有“一体化健康”关注点的临床与非临床鸡源大肠杆菌的抗菌药耐药性模式分析

《Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases》：Clinical and non-clinical Escherichia coli from chickens reveal antimicrobial resistance patterns of One Health concern

　　

研究人员评估了在24年间，从具有或不具有大肠杆菌病临床症状的鸡中分离出的大肠杆菌，对头孢西丁、头孢他啶、环丙沙星、亚胺培南和黏菌素的耐药性流行率，以及相关耐药基因的存在情况。黏菌素耐药分离株进一步通过全基因组测序（WGS）进行了表征。总计196株分离株接受了抗菌药物敏感性测试。黏菌素敏感性通过最低抑菌浓度测定，而头孢西丁、头孢他啶、环丙沙星和亚胺培南的敏感性则通过纸片扩散法评估。通过聚合酶链式反应（PCR）检测了耐药基因（blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、qnrA、qnrB 和 qnrS）的存在。对四株黏菌素耐药分离株进一步通过使用Illumina MiSeq平台进行全基因组测序，以表征其耐药决定因子、毒力相关基因和多位点序列分型（MLST）。在分离株中，42.9%对环丙沙星不敏感，8.2%对头孢西丁不敏感，6.6%对头孢他啶不敏感，1.5%对亚胺培南不敏感。在4.59%的分离株中检测到多重耐药基因，其中 blaTEM和 blaCTX-M最为常见。在22.45%的分离株中观察到黏菌素耐药。基因组分析识别出先前与禽致病性大肠杆菌（APEC）相关的序列分型（ST）ST345、ST648和ST23，以及一个被指定为ST18020的新型序列分型。这些发现突显了抗菌药耐药大肠杆菌在家禽生产中的持续存在和遗传多样性，并强化了持续分子监测的重要性。

论文解读

研究背景与问题

巴西家禽养殖业在全球占据重要地位，是第三大鸡肉生产国和第一大出口国。在这种集约化生产体系中，商品家禽已成为携带抗菌药耐药基因细菌的重要储库。大肠杆菌是禽类胃肠道中的一种共生菌，但某些被归类为禽致病性大肠杆菌的菌株可引起称为大肠杆菌病的严重全身性感染，该病与高发病率、屠宰场胴体废弃和家禽业的重大经济损失相关。此外，大肠杆菌在人类和其他动物胃肠道中广泛分布，并因其通过结合等水平基因转移机制获取和传播耐药基因的显著能力，在抗菌药耐药性生态学中扮演着核心角色。因此，大肠杆菌被广泛用作抗菌药耐药性监测项目（例如美国的国家抗菌药耐药性监测系统NARMS和巴西的农业抗菌药耐药性监测与监控计划）的指示生物。

巴西家禽生产的经济重要性，加上家禽系统中多重耐药大肠杆菌的反复检出，凸显了对这些细菌进行持续抗菌药耐药性监测的必要性。然而，目前对于家禽中（无论是否表现出大肠杆菌病临床症状）分离到的大肠杆菌菌株的耐药性模式和耐药基因分布，尤其是在长时间跨度下的变化，仍需深入探究。为了解耐药性的流行和演变，并为制定有效的干预策略提供依据，开展此项研究至关重要。

研究方法概述

本研究评估了2000年至2024年期间，从巴西南部（巴拉那州和南里奥格兰德州）的养鸡场获得的196株大肠杆菌分离株的抗菌药耐药性谱和耐药基因的存在情况。样本来源于有临床症状（146株）和无临床症状（50株）的鸡。研究人员对分离株进行了抗菌药物敏感性测试，包括对头孢西丁、头孢他啶、环丙沙星、亚胺培南（采用纸片扩散法）和黏菌素（采用最低抑菌浓度测定法）的敏感性评估。对耐药菌株进行了聚合酶链式反应，以检测与喹诺酮类（qnrA、qnrB、qnrS）和头孢菌素类（bla_CTX-M、bla_TEM、bla_SHV）耐药相关的基因。此外，选取了四株黏菌素耐药分离株进行全基因组测序，以深入表征其耐药决定因子、毒力相关基因和多位点序列分型。对临床状态与多重耐药性之间的关联进行了统计分析。

研究结果

3.1. 抗菌药物敏感性

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  在196株分离株中，42.9%对环丙沙星不敏感，8.2%对头孢西丁不敏感，6.6%对头孢他啶不敏感，1.5%对亚胺培南表现为中等（非耐药）。有44株菌对黏菌素耐药，占22.45%。对环丙沙星和黏菌素的耐药性与鸡出现临床症状显著相关。仅有3株分离株表现出多重耐药性，且均来自有临床症状的鸡。

3.2. 聚合酶链式反应

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  在12.7%的分离株中检测到质粒介导的耐药基因，其中4.59%携带一个以上基因。bla_TEM是最普遍的β-内酰胺酶基因（13株），其次是 bla_CTX-M（7株）和 bla_SHV（5株）。在喹诺酮类耐药方面，qnrB 基因在10株菌中检出，qnrS 在3株菌中检出，未检出 qnrA。携带耐药基因的菌株主要来自有临床症状的鸡（9.69%），但在无症状鸡中也检测到耐药基因型（3.06%）。

3.3. 全基因组测序

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  对四株黏菌素耐药菌株进行了全基因组测序，鉴定出序列分型ST345、ST648、ST23和一个新型分型ST18020。ST18020在系统发育树上形成了一个独立分支。这些菌株携带了多样的抗菌药耐药基因组合，包括β-内酰胺酶基因（bla_CFE-1、bla_TEM-1B和 bla_CMY-64）、四环素耐药基因（tet(34)、tet(A)）以及外排泵基因（mdf(A)、oqxA/B）等。毒力基因分析显示，所有菌株共享一套核心毒力基因谱，涉及粘附、运动、趋化和铁摄取等。ST648和ST23显示出最广泛的毒力基因谱，包括编码分泌系统、毒素和免疫逃避因子的基因。新发现的ST18020菌株则展现出扩展的毒力基因谱和最高的潜在耐药谱。

讨论与结论

讨论

研究表明，在抗菌药物敏感性测试中表现出表型耐药的菌株数量高于携带质粒介导耐药基因的菌株数量。这种差异可能源于染色体突变或其他未被检测的耐药机制。环丙沙星耐药性与临床症状存在显著关联。尽管巴西已限制喹诺酮类和β-内酰胺类作为促生长剂使用，但家禽生产中这些药物的耐药性仍频繁被检出。研究中观察到了质粒介导的 qnr 基因和编码超广谱β-内酰胺酶的基因（bla_CTX-M、bla_TEM、bla_SHV）检测率随时间增加的趋势。全基因组测序揭示了四株黏菌素耐药大肠杆菌在巴西家禽生产系统中循环的遗传多样性。检测到的序列分型包括已知的家禽相关或人畜共患病谱系（ST23、ST345、ST648）和一个新型分型ST18020。ST648被认为是一个高风险肠外致病谱系，具有人畜共患潜力。在菌株中检测到 bla_CFE和 bla_CMY基因，它们介导对超广谱头孢菌素的耐药性，尽管其表型耐药并不总是表达。四株分离株在无 mcr 基因的情况下对黏菌素表现耐药，检出的 pmrB Y358N 替代突变可能涉及染色体介导的耐药机制。研究结果强调了耐药基因在家禽和人类来源的细菌群体中快速传播的风险，以及对家禽生产系统进行持续基因组监测以支持抗菌药物管理政策和一体化健康策略的重要性。

结论

质粒介导的耐药基因的检出，凸显了这些决定因子在动物和人类来源的细菌群体中快速传播的风险，对公共卫生具有直接影响。全基因组分析表明，在巴西肉鸡生产中循环的黏菌素耐药性禽致病性大肠杆菌样菌株，由异质性的克隆谱系、毒力谱和耐药决定因子组成，包括ST23、ST345、ST648和新型ST18020。在巴西家禽中鉴定出 bla_CFE，连同 bla_CMY和其他临床相关耐药基因，突显了耐药基因组的复杂性，并强化了在一体化健康框架下进行综合监测和负责任地使用抗菌药物的必要性。