《Computational Biology and Chemistry》：In silico Designing of a Novel Multiple Epitope Vaccine Against Vancomycin Resistant Enterococcus faecalis; An Immunoinformatic-Guided Approach
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穆罕默德·穆塔亚布·贾瓦伊德（Muhammad Mutayyab Javaid）、拉明·纳西尔（Rameen Nasir）、拉欣·雷赫曼（Raheen Rehman）、里姆莎·阿巴西（Rimsha Abbasi）、穆尼布·卡利德（Muneeb Khalid）、阿赫桑·易卜拉欣（A
穆罕默德·穆塔亚布·贾瓦伊德（Muhammad Mutayyab Javaid）、拉明·纳西尔（Rameen Nasir）、拉欣·雷赫曼（Raheen Rehman）、里姆莎·阿巴西（Rimsha Abbasi）、穆尼布·卡利德（Muneeb Khalid）、阿赫桑·易卜拉欣（Ahsan Ibrahim）
希法药学院（Shifa College of Pharmaceutical Sciences），希法塔米尔-埃-米拉特大学（Shifa Tameer-e-Millat University），H-8，伊斯兰堡，巴基斯坦
摘要 耐万古霉素的粪肠球菌 （Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis ）持续成为一个主要的治疗挑战，尤其是随着像稀有VanE 基因这样的耐药基因在全球范围内不断增加。随着抗菌素耐药性的加剧，目前还没有可用的商业疫苗，因此需要采取替代的预防策略。本研究利用免疫信息学工具设计了一种针对耐万古霉素E. faecalis 的新多表位疫苗候选物。预测的T细胞和B细胞表位通过基于免疫信息学的工具进行了致敏性、抗原性和毒性筛查，重点关注T细胞表位。成功的表位与适当的佐剂（L7/L12核糖体蛋白）和连接子（EAAAK、AAY、GPGPG）结合，从而制备出多表位疫苗。我们设计的疫苗表现出理想的抗原性，Vaxigen得分为0.6132，无致敏特性，溶解度得分为0.583，并且具有较高的理论群体覆盖率。蛋白质的二级和三级结构分别使用PsiPred和trRosetta等工具进行建模，三级结构通过GalaxyRefine服务器进行了优化。ERRAT得分为92.4303，93.9%的残基位于Ramachandran图的可接受区域内，证实了最终构建物的可靠性和质量。对接研究表明其与TLR-2受体的结合具有良好潜力。该疫苗构建体通过SnapGene使用PET28a载体克隆，以便在E. coli 中进行表达研究。该疫苗构建体在C-ImmSim测试中激活了细胞介导的免疫和体液免疫。这些计算机模拟 分析为开发能够诱导免疫反应并控制多重耐药E. faecalis 的疫苗奠定了基础，并值得在实验模型中进一步研究。
引言 肠球菌（Enterococci）是临床上重要的细菌，与菌血症、心内膜炎和尿路感染（UTI）有关，在医疗环境中偶尔也会导致脑膜炎和腹腔感染（Scharloo等人，2024年）。它们属于乳酸菌（LAB）类，因为它们是革兰氏阳性、不产孢且过氧化氢酶阴性。它们以成对或短链的形式形成球菌，并从葡萄糖中产生乳酸（Purkayastha等人，2020年）。鉴于日益增强的耐药性和生物膜形成能力，肠球菌属于ESKAPE病原体，对公共卫生构成威胁（Venkateswaran等人，2023年；Pandey等人，2021年）。这些细菌可以在多种动物（包括昆虫、蠕虫、哺乳动物和鸟类）的正常微生物群中找到（Zaidi等人，2024年）。
耐抗生素的粪肠球菌 （Antibiotic-resistant Enterococcus faecium ）被列入世界卫生组织2024年《细菌优先病原体名单》的高优先级类别（WHO %J Bacterial Pathogens of Public Health Importance to Guide Research, Development, Strategies to Prevent, and Control Antimicrobial Resistance（2024年））。近年来，对临床相关抗生素（如万古霉素）具有耐药性的E. faecalis 菌株不断增加（Guan等人，2024年）。这导致死亡率上升（尤其是在血流感染中），住院时间和重症监护室（ICU）停留时间延长，医疗费用增加，以及全球范围内的发病率升高（Iqbal等人，2024年）。耐万古霉素肠球菌（VRE）感染的流行情况令人担忧且多样，不同国家和研究环境间的发病率存在差异。非洲的总体发病率为26.8%（Alemayehu和Hailemariam，2020年）。在巴基斯坦，最早关于VRE的报道来自卡拉奇（Khan等人，2002年）。此后，其他基于医院的研究也在拉合尔、伊斯兰堡、拉瓦尔品第、斯瓦比、卡拉奇和白沙瓦等地报告了VRE的阳性病例（Qamar等人，2023年）。
万古霉素是一种重要的临床抗生素，用于革兰氏阳性细菌的定向治疗、经验性治疗和预防性治疗（Legg等人，2025年）。这种药物可以覆盖革兰氏阳性杆菌和球菌、革兰氏阳性厌氧菌、凝固酶阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌（Rubinstein和Keynan，2014年）。它通过与D-丙氨酸-D-丙氨酸结合来抑制葡萄糖基转移酶和P-磷脂载体，从而阻止N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAM）在肽聚糖层的合成和聚合，导致细胞壁完整性受损，最终使革兰氏阳性细菌细胞裂解（Lee等人，2019年；Patel等人，2024年）。D-丙氨酸-D-丙氨酸的修饰，用D-丝氨酸或d-乳酸替代，是产生耐药性的原因（Ranotkar等人，2014年）。
值得注意的是，耐药性通常是后天获得的，而不是与生俱来的，通常通过含有Van 基因的操纵子实现（Chong等人，1998年）。负责耐药的十个Van操纵子包括D-丙氨酸-D-丝氨酸操纵子（VanC、VanE、VanG、VanL和VanN ），这些操纵子可将药物结合亲和力降低约7倍；而D-丙氨酸-D-乳酸操纵子（VanA、VanB、VanD、VanM和VanP ）则可将结合亲和力降低多达1000倍（Almeida-Santos等人，2025年）。VanE 基因簇由五个基因组成，包括vanTE （丝氨酸外消旋酶）、vanXYE （D, D-二肽酶/D, D-羧肽酶）和vanE 基因（D-丙氨酸-D-丝氨酸连接酶），以及调控操纵子vanSE 和vanRE （Boyd等人，2002年）。欧洲首次报道含有VanE基因的VRE faecalis病例属于不可转移的Tn6202整合子（Al Rubaye等人，2024年）。VanE 引起的耐药机制如图1所示。
VRE耐药性的增加导致了治疗失败率的上升和死亡率的提高（Verma和Kashyap，2024年）。研究表明，预防性疫苗可以通过减少抗生素使用、预防感染和增强免疫力来对抗抗菌素耐药性（Zavaleta-Monestel等人，2024年）。计算机模拟 疫苗开发是一种系统化的技术，用于设计对多种多重耐药（MDR）感染具有潜在疗效的候选疫苗（Chao等人，2024年；Huemer等人，2020年）。基于免疫信息学工具开发的疫苗可以作为预防VRE感染的候选方案，因其安全性和有效性（Rawat等人，2023年；Oli等人，2020年）。VRE菌株的显著增加要求制定替代策略（超出传统抗生素的范围），包括疫苗设计。本研究旨在利用免疫信息学工具设计针对VRE faecalis的多表位疫苗，重点关注保守的表位。这项研究工作可以为疫苗候选物的优先选择提供有用的计算数据，为实验室验证提供基础。计算机模拟疫苗设计针对VRE faecalis在科学文献中是一个尚未充分研究的领域。此外，目前尚无针对耐万古霉素的E. faecalis的商业疫苗。本研究的目标是从VRE. faecalis 的VanE 蛋白中筛选出T细胞表位（由于该蛋白的细胞内性质），并探索B细胞表位作为次要和辅助功能，评估其抗原性、致敏性和毒性潜力。研究目标还包括探索理论群体覆盖率、序列保守性分析、分子对接、正常模式分析、免疫模拟以及计算机模拟克隆，以获得初步的计算见解，这些可能有助于实验验证本研究的结果。
部分摘录 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_048366.1 VanE 属于D-丙氨酸-D-丝氨酸操纵子，通过影响万古霉素与其靶蛋白的结合亲和力来赋予E. faecalis 耐药性（Kankalil George等人，2021年）。为了预测VanE 蛋白的亚细胞定位，使用了PSORTb、SignalP和TMHMM 2.0等工具。(Design and BIOVIA，2014年；Du等人，2021a) 阿赫桑·易卜拉欣（Ahsan Ibrahim）： 项目监督、项目管理、概念构思。拉明·纳西尔（Rameen Nasir）： 方法论、调查、正式分析。穆罕默德·穆塔亚布·贾瓦伊德（Muhammad Mutayyab Javaid）： 方法论、调查、数据管理。拉欣·雷赫曼（Raheen Rehman）： 方法论、调查。穆尼布·卡利德（Muneeb Khalid）： 写作——审稿与编辑、初稿撰写、方法论、调查。里姆莎·阿巴西（Rimsha Abbasi）： 方法论、调查。穆罕默德·穆塔亚布·贾瓦伊德和拉明·纳西尔（Muhammad Mutayyab Javaid和Rameen Nasir）负责计算机模拟 研究及初稿撰写；拉欣·雷赫曼和里姆莎·阿巴西（Raheen Rehman和Rimsha Abbasi）负责计算机模拟 研究及最终手稿的撰写；穆尼布·卡利德（Muneeb Khalid）负责最终手稿的编辑和整理；阿赫桑·易卜拉欣（Ahsan Ibrahim）负责项目监督和最终手稿的校对
