综述：多硫化物荧光探针的设计原理及其生物应用研究进展

《Coordination Chemistry Reviews》：Research progress in the design principles and biological applications of polysulfide fluorescent probes

　　王俊平|周娜|杨彦彦|尹彩霞|霍芳军
教育部化学生物学与分子工程重点实验室，山西省生物医药与健康实验室，山西大学分子科学研究所，太原030006，中国

**摘要**
多硫化物（H?S?，n > 1）是生物体内硫代谢的关键中间体。它们通过氧化、还原或歧化反应调节蛋白质功能，并参与多种生理过程，包括细胞信号转导、氧化还原平衡维持、代谢调控以及免疫细胞活性的调节。多硫化物与心血管疾病、癌症、神经退行性疾病和代谢性疾病密切相关。对其精确标记和动态分析有助于阐明其特定的分子作用机制。鉴于小分子有机荧光探针在监测生物活性分子中的广泛应用，本文综述了荧光探针的构建策略，根据不同的反应位点对它们进行了分类，并系统总结了从小分子有机荧光探针首次出现至今的发展进展。该综述将促进多硫化物荧光探针的研发和应用，从而可能推动相关分子机制的研究以及药物靶点的发现。这在化学生物学、分析化学、药物化学和生命科学领域具有重大意义。

**引言**
硫在生物体内作为一种重要的非金属元素，其关键作用在于能够经历多种氧化态的循环变化，从H?S的?2到硫酸盐的+6 [1]。其中，常见的硫化氢（H?S）常作为内源性气体信号分子，调节多种生理过程。其主要机制涉及蛋白质中半胱氨酸残基的过硫化。这一过程属于氧化反应，与H?S的还原性质形成对比，表明它不是单步反应，而是由某些中间体介导的多步骤过程 [2] [3]。随着研究的深入，人们发现这一过程首先通过H?S的部分氧化形成多硫化物，然后这些多硫化物对蛋白质中的半胱氨酸残基进行修饰 [4] [5]。这一发现激发了研究人员对多硫化物的兴趣。从路易斯酸碱理论的角度来看，多硫化物（H?Sn，n > 1）属于活性硫物种（RSS）；链状硫链表现出独特的亲电特性。具体而言，SS键的低能量σ*反键轨道成为亲核硫醇电子对捐赠的优先受体。这种电子构型促进了高效的硫醇-二硫化物交换和可逆的链式连接，体现了动态共价化学的原理。因此，许多涉及H?S的生理过程主要由这些活性硫物种介导 [6] [7]。

生物体内相关的硫物种包括多硫化物（RSnH，n > 1）、硫化氢（H?S）以及具有生物活性的硫醇，如半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）。与单硫醇相比，多硫化物通过未成对电子的离域作用使半胱氨酸过硫化物（R-S-S•）更加稳定，使其成为更稳定的自由基和较弱的氧化剂（图1A）。相应的多硫化物（RSSH）具有增强的酸性及双亲核-亲电反应性，而半胱氨酸过硫化物阴离子（RSS?）由于相邻硫原子的孤对电子的协同效应而表现出显著增强的亲核性（α效应）。值得注意的是，多硫化物的pKa值介于3至5之间，远高于H?S（6.9）和上述生物相关硫醇（半胱氨酸：8.3；同型半胱氨酸：8.9；谷胱甘肽：9.2）（图1B）。这种酸性的显著差异意味着多硫化物在生理pH下主要以阴离子形式存在，赋予其高化学活性，而H?S部分解离，生物相关硫醇主要以中性硫醇形式存在。这些结构、酸碱性质和反应性的差异确立了多硫化物的独特化学性质，使其在生物氧化还原信号传导和蛋白质过硫化中发挥关键作用 [8] [9]。

目前，体内多硫化物的合成途径可分为酶促和非酶促途径。酶促合成途径主要涉及以下几种关键酶（图2）：半胱氨酸β-合成酶（CBS）和半胱氨酸γ-裂解酶（CSE）。CBS和CSE以L-半胱氨酸或丝氨酸为底物，催化半胱氨酸的合成和裂解，同时产生硫化氢（H?S）。3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）在过氧化物酶体中参与反应，其中D-半胱氨酸在D-氨基酸氧化酶（DAO）的作用下转化为3-巯基丙酮酸（3MP），然后进入线粒体。在吡哆醛磷酸（PLP）辅因子的存在下，接下来的反应由半胱氨酸氨基转移酶（CAT）和3-MST协同完成。醌硫化物氧化还原酶（SQR）可催化H?S的氧化过程，将电子转移给线粒体醌库（呼吸链的重要组成部分），同时将H?S转化为半胱氨酸过硫化物阴离子（HS2?）。该产物可与线粒体内的还原型谷胱甘肽（GSH）结合形成谷胱甘肽过硫化物（GSSH），或与活性氧物种（ROS），如超氧阴离子（O2•?）和过氧化氢（H2O2）反应生成三硫化氢（H2S3）和四硫化氢（H2S4）。 rhodanese（Rhod）催化硫从硫供体（如硫代硫酸盐S2O32?）转移到硫醇受体（如GSH、CysSH），生成GSSH和半胱氨酸过硫化物（Cys-SSH），并释放亚硫酸盐（SO32?）。此外，在催化CysSH和tRNACys的氨基酰化过程中，半胱氨酸-tRNA合成酶（CARS）利用腺苷三磷酸（ATP）的γ-磷酸基团将其自己的活性位点上的硫酰基转移至CysSH，形成中间体CARS-S-SH，进一步将过硫化基团转移到CysSH，生成CysSSH。后者可参与tRNACys的修饰并进入蛋白质翻译过程（介导蛋白质的过硫化修饰）。非酶促合成途径在细胞内普遍存在，主要包括H?S与ROS之间的自氧化反应以及巯captan与二硫化物之间的交换反应。

近年来，研究人员逐渐认识到多硫化物的多种生物功能。多硫化物广泛参与多种生物过程，包括信号转导 [10] [11]、氧化还原平衡维持 [12] [13]、代谢调控 [14] 和免疫细胞活性调节 [16]。多硫化物对蛋白质的过硫化修饰是其调节细胞功能的核心分子机制。例如，在多硫化物的影响下，核因子-红细胞2相关因子2（Nrf2）被转运至细胞核，促进谷胱甘肽合成和神经元发育 [17]。多硫化物直接将蛋白质中的半胱氨酸残基（-SH）转化为半胱氨酸过硫化物（-SSH），包括瞬时受体电位锚定蛋白1、Kelch样ECH相关蛋白1、10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物以及蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）[18] [19] [20] [21] [22] [23]。多硫化物（蛋白质-SnH，n > 1）通过硫醇-二硫化物交换反应形成，从而改变蛋白质的构象和活性等 [24]。此外，多硫化物（如蛋白质结合的多硫化物）通过硫链的亲核性直接与甲基乙二醛（MG）和晚期糖基化终产物（AGEs）等活性羰基化合物结合，作为有效的直接羰基清除剂 [25]。尽管现有研究取得了一定的进展，但多硫化物的生物功能仍需进一步深入探索。

**总结**
作为高生物活性分子，多硫化物通过影响蛋白质功能与心血管疾病、神经系统疾病、癌症和多种代谢性疾病的发病和发展密切相关。因此，多硫化物的原位高精度检测有助于更深入地理解相关的生理和病理机制。本文全面介绍了针对多硫化物的小分子荧光探针的设计和生物成像方法，这些探针根据不同的响应策略进行了分类，已被广泛用于多硫化物的原位标记和动态监测 [25] [26] [27] [28]。该综述旨在支持多硫化物荧光探针的研发和应用，有望推动其分子机制的研究和药物靶点的发现。

**多硫化物响应策略的分类**
H?Sn的独特α效应使其具有强大的亲核性和还原性，而相邻的硫原子同时表现出亲电性。基于这些独特的化学性质，H?Sn响应探针主要分为三类：亲核型、亲电型和还原型反应（表1）。在亲核型中，策略进一步分为级联亲核型和一步亲核型途径。目前，H?Sn介导的亲核芳香取代和分子内环化是一种常用的多硫化物探针开发策略。

**结论与展望**
过去十年中，基于活性感应策略的H?Sn荧光探针取得了快速进展，为解析多硫化物的生理和病理作用提供了不可或缺的工具。利用H?Sn的独特化学性质（如增强的亲核性），研究人员开发了多种感应平台，包括亲核取代、亲核加成-环化等机制。

**利益声明**
作者声明不存在可能影响本文工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

**致谢**
感谢国家自然科学基金（项目编号22307091、U23A6009）和山西省基础研究计划支持的研究项目（项目编号202203021222203、202203021221009）、山西省留学人员科学技术活动资助项目（项目编号2022-002）、山西省2024年三晋人才计划-科技创新领域项目（项目编号2024001）的支持。