Recent development of fluorescent probes for hydrogen per/polysulfides 综述：氢过/多硫化物荧光探针的最新进展

《Current Opinion in Chemical Biology》：Recent development of fluorescent probes for hydrogen per/polysulfides

　　

三、摘要翻译 尽管人们对氢过/多硫化物（H2Sn，n ≥ 2）在人类健康中的整体重要性有了日益深入的理解，但其具体的生物学作用及作用机制仍不清楚。为了更好地阐明这些关键细节，研究人员开发了荧光探针以实时监测这些硫物种。鉴定H2Sn特异性识别基团及兼容的荧光染料，已成为开发H2Sn灵敏且选择性荧光探针的关键。2023至2026年间报道的探针涵盖了广泛的化学策略，以实现检测的选择性并优化荧光开启效果，其重点在于利用H2Sn相较于硫化氢和其他生物硫醇更强的亲核性。在这篇短篇综述中，研究人员总结了H2Sn荧光探针设计的最新策略，并讨论了其在生物系统中未来发展的关键考量及应用前景。

四、论文主体内容总结

Introduction

活性硫物种（Reactive Sulfur Species, RSS）是一类具有重要生物学意义的含硫分子，涵盖硫醇（RSH）、二硫化物（RSSR）、硫化氢（H₂S）、氢过硫化物（RSSH）及氢过/多硫化物（H₂S_n，n ≥ 2）。过去20年对H₂S的研究已确立其作为信号分子的角色，参与调控氧化还原稳态，具有心脏保护、神经保护及抗炎等有益效应。近年研究表明，H₂S_n和RSSH亦是重要的氧化还原调节因子，可通过蛋白质S-过硫化（protein S-persulfidation）介导生物学过程——与H₂S不同，H₂S_n可直接诱导蛋白质半胱氨酸残基的过硫化，进一步区分了二者的生物学功能。这些硫物种的重要性凸显了开发检测方法的价值。

荧光探针因能实时、选择性、灵敏且无创地检测细胞、动物及植物中的分子，成为研究生物系统的常用工具。SciFinderⁿ检索显示，2023-2026年约有20篇报道新型H₂S_n荧光探针的论文，反映该领域的快速发展。此前课题组已综述过这些物种的检测方法及实验室开发的基于活性的RSS荧光探针，本综述则聚焦于2023-2026年的最新进展，讨论代表性探针的反应机制、性质及应用，并展望未来方向。

2-Fluoro-5-nitrobenzoic ester-based probes

2-氟-5-硝基苯甲酸酯基团是H₂S_n探针设计的广泛模板，由Xian等2014年首次报道于DSP探针系列。其反应机制为：H₂S_n触发模板上的亲核芳香取代反应（S_NAr），生成芳基过硫化物中间体，随后经分子内环化释放含OH的荧光团，开启荧光，同时形成苯并二硫酮副产物。DSP系列中最优探针DSP-3首次成功用于HeLa细胞成像H₂S_n，后续基于此模板的探针拓展了应用场景。

2023年，Liu等报道以三苯胺苯并呋喃衍生物为荧光团的TBF-SS探针，在水/DMSO（9/1）体系中37°C测试显示，其对H₂S_n（以Na₂S₂为模型）的检测限（LOD）为0.01 μM，加入H₂S_n后荧光增强约25倍（激发/发射波长：435/575 nm），并应用于茶叶样品及MCF-7细胞。同年，Wu等采用取代苯并呋喃酮为荧光团，设计BFO-HPS探针，与Na₂S₂孵育10分钟后荧光增强约280倍（510/570 nm），对其他含硫醇物种响应可忽略，LOD达0.11 μM，还用于RAW264.7细胞中H₂S_n动态成像，发现核因子-κB配体诱导的细胞转化过程中H₂S_n水平升高。Xia等将2-氟-5-硝基苯甲酸酯基团引入萘酰亚胺衍生物，构建近红外（NIR）探针1，与Na₂S₄反应后荧光强度较空白增强156倍（560/700 nm），LOD为48.5 nM，对H₂S_n具有高选择性（不受半胱氨酸（Cys）、H₂S及其他生物离子干扰），并能检测A549细胞及斑马鱼的内源/外源性H₂S_n，定位于A549细胞的 endoplasmic reticulum（内质网）。

Dinitrophenol ether-based probes

2,4-二硝基苯酚醚（DNP）基团是RSS荧光探针设计的另一常用策略。由于苯环2位和4位的硝基吸电子基团，DNP基探针易发生S_NAr反应，释放含OH荧光团并开启荧光。生理条件下，RSH、H₂S、H₂S_n均为亲核物种，但亲核性排序为H₂S_n> H₂S > RSH（源于各自pKa差异），探针的反应性及选择性还依赖于荧光团性质。2024年Fosnacht和Pluth的综述涵盖130余种DNP基H₂S探针，虽多数未评估对H₂S_n的选择性，但后续研究通过利用H₂S_n更强的亲核性，开发出多个DNP基H₂S_n探针。

2024年，Chen等合成以香豆素衍生物为荧光团的比率型DNP基探针BCC，旨在比较对H₂S_n与H₂S的响应。在DMF-HEPES缓冲液（90% DMF）中，BCC初始最大发射峰为440 nm（激发360 nm）；加入Na₂S₂后，440 nm发射减弱，530 nm处出现新峰，体现比率特性。其对H₂S_n的选择性评估显示，100 μM其他分析物（如Na₂S、Na₂S₂O₃、Cys、谷胱甘肽（GSH））未引起荧光比率变化（F₅₃₀/F₄₄₀），而100 μM H₂S_n使比率增强约5.5倍，LOD为3 μM。另一DNP基探针P–Y经H₂S_n触发荧光团释放，在547 nm处荧光显著开启，体外实验中对H₂S_n的选择性高于Na₂S/NaHS及含硫醇物种，HepG2细胞实验中，Na₂S₂处理使荧光增强约2倍，而内源性H₂S_n抑制剂dl-炔丙基甘氨酸（cystathionine γ-lyase抑制剂）导致荧光轻微下降；该探针还用于监测Hg²⁺和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）暴露后HepG2及RAW264.7细胞中H₂S_n水平，揭示其与ROS积累的关系。

DNP基团亦用于体内检测：2025年Chen等设计含亲水性六元杂环的新型aza-hemicyanine染料（NA染料），获得无蛋白干扰、肾靶向的NIR荧光团，将最优染料NA-5与DNP基团偶联得到NA-H₂S₂探针，其荧光被光诱导电子转移（PET）效应淬灭。该探针在血清白蛋白存在下无假阳性信号，与Na₂S₂反应后680 nm处荧光增强46.4倍，LOD为24 nM，对其他氨基酸、Na₂S、H₂O₂及金属离子响应可忽略。HK-2细胞和鼠模型成像显示，其可检测erastin和顺铂诱导肾铁死亡时的细胞内H₂S₂。此外，Nakagawa等制备基于香豆素和TokyoGreen（TG）的系列探针，比较不同硝基苯磺酰及硝基苯酚醚结构的RSSH识别能力，发现DNP基团仍为最优，且荧光团影响灵敏度与选择性——TG型探针DN-TG及其硝基苯磺酰类似物DNs-TG（均经S_NAr反应）比香豆素型探针荧光增强更显著，DN-TG对Cys-SSH反应性较低但选择性更高，可在天然Cys-SH存在下标记过硫化蛋白，DNs-TG能检测A549细胞外源Cys-SSH（10 μM）。

o-Nitrobenzenesulfonate-based probes

Maeda等2023年研究表明，邻硝基苯磺酸盐（o-nitrobenzenesulfonate）是其测试结构中检测H₂S_n的最优模板。在磷酸盐缓冲液（pH 7.4，含0.1% DMSO及25 μM十六烷基三甲基溴化铵（CTAB））中，探针2与Na₂S₂反应后荧光增强约250倍（485/520 nm），加入Na₂S无明显荧光；该探针在Na₂S₂或Na₂S₄处理后分别20分钟及5分钟达到最大信号，灵敏度与常用H₂S_n探针PSP-3相当，并成功用于HeLa细胞H₂S₂成像。Wu等开发NR-BS4探针，在PBS缓冲液（pH 7.4，20% DMSO）及HepG2细胞、斑马鱼中选择性响应Na₂S₂（590/666 nm，LOD 0.14 μM）。Yu等在二氰异佛尔酮基NIR荧光探针开发中，证实邻硝基苯磺酸盐优于其他硝基及三氟甲基取代的苯磺酸盐类似物，最优探针DCICl-H₂S_n与Na₂S₄（80 μM）反应后荧光显著增强（514/675 nm），对GSH无响应，LOD为0.284 μM，静脉注射急性肝损伤（ALI）小鼠模型后，肝脏荧光信号较对照组降低一半以上，提示H₂S_n可作为ALI潜在生物标志物。

Boron-dipyrromethene–based probes

2023年Zhao等通过分子工程构建发光体，实现聚集诱导双色荧光响应，合成四个含乙烯基连接吸电子基团（EWGs）的不对称单氯硼二吡咯烷（BODIPY）染料，利用H₂S_n比H₂S更强的亲核性，经S_NAr机制实现H₂S_n特异性反应。含强EWGs的探针对Na₂S₄和Na₂S均有响应，而含中等强度EWGs的BOD-CN对Na₂S₄具选择性。BOD-CN（10 μM）初始吸收/发射峰为490/547 nm，加入Na₂S₄（100 μM）后吸收红移170 nm至660 nm，547 nm荧光减弱，740 nm处出现NIR新发射峰，对H₂S_n选择性高（LOD 293 nM），但因疏水性强需高比例乙腈助溶。为解决此问题，将BOD-CN包埋于mPEG-DSPE-2000自组装胶束疏水内核，制备纳米探针BOD-CN-NP，其光谱特性与BOD-CN相似（无H₂S_n时490/547 nm），加入Na₂S₄后出现588 nm（激发550 nm）及750 nm（激发670 nm）发射峰，作者推测源于Davydov分裂及mPEG-DSPE促进的分子紧密堆积，且保持对H₂S_n的高选择性（LOD分别为0.63 μM和0.71 μM），成功用于HeLa细胞内源性H₂S_n的双色（黄/红通道）检测。

2024年同一课题组通过增强BODIPY的EWGs（引入取代吲哚鎓）及添加噻吩基团，将探针红移至NIR-II区，获得最优探针BOD-NS。在PBS/CH₃CN（1/1，v/v，37°C）中，BOD-NS（10 μM）与Na₂S₄（100 μM）孵育3分钟后，808 nm激发下920 nm处荧光强度>2×10¹⁰a.u.，对其他分析物（如生物硫醇）响应可忽略，LOD为105 nM，腹腔注射BALB/c小鼠后可实现H₂S_n的深组织检测。

Dithiole formation–based probes

Chen等报道首个用于生物体深层组织H₂S₂可视化与定量的NIR-II荧光/光声双比率探针NIR-II-H₂S₂，采用新型识别基团：通过亲核取代反应，1,3-二氯基团与H₂S₂反应生成五元1,3-二硫戊环产物，实现高特异性。该探针对Na₂S₂呈现NIR-II荧光（I₈₄₀/I₁₀₀₀，107倍）及光声（PA₈₀₀/PA₉₀₀，6.5倍）比率响应，其他RSS无明显信号。通过脂质体仿体实验验证其深组织穿透能力（7 mm），并在LPS/二甲双胍诱导的肝毒性小鼠模型中评估体内性能，观察到肝脏NIR-II荧光（850 nm）及光声信号（800 nm）显著增强。

Aziridine-based probes

除传统基团外，研究者探索了叠氮丙啶（aziridines）等替代识别基序——通过氮原子上连接EWGs（如磺酰基、羰基）增强叠氮丙啶的亲电性，促进H₂S_n/RSSH的亲核开环。早期Xian等报道N-磺酰基叠氮丙啶探针AP，通过扭曲分子内电荷转移检测H₂S_n。近期Yang设计基于N-苯甲酰叠氮丙啶的比率型探针CRBA，采用香豆素-罗丹明dyad F?rster共振能量转移（FRET）系统：CRBA初始吸收峰为405 nm（香豆素）和527 nm（罗丹明），最大发射峰为561 nm（罗丹明，激发400 nm）；GSSH在含500 μM CTAB的磷酸盐缓冲液中触发叠氮丙啶开环，自发分子内螺内酰胺化，破坏罗丹明的π共轭结构，减少香豆素发射（465 nm）与罗丹明吸收（527 nm）的光谱重叠，抑制FRET，增强香豆素荧光，体现比率特性。其对GSSH和Na₂S₂的选择性表现为荧光比率（I₄₆₅/I₅₆₁）约1.0-1.2，相关生物硫醇无显著变化，LOD为58 nM，成功用于HeLa细胞及重金属（100 μM）处理的拟南芥根中RSSH检测，发现Cd²⁺和Ni²⁺处理的根系RSSH上调水平高于Hg²⁺和Cu²⁺。

Carbonothioate-based probes

2025年Chen等测试了一组基于碳硫代酸酯触发级联环化释放荧光团的H₂S_n反应探针：H₂S_n与探针触发器反应生成的intermediate i，再与H₂S_n反应生成ii，经分子内环化释放含OH荧光团，最优触发器为CTP-2。CTP-2（5 μM）在PBS（含100 μM CTAB）中与Na₂S₂（100 μM）孵育30分钟后荧光增强30倍（475/512 nm），对H₂S_n选择性高（LOD 63 nM）；基于此模板构建的NIR探针CTP-8（发射688 nm）因荧光团疏水性及聚集倾向不同，环化级联速率降低，LOD为115 nM，仍保持高特异性，成功用于监测氨基葡萄糖诱导胰岛素抵抗的HepG2细胞及2型糖尿病小鼠模型中的内源性H₂S_n水平，二者均观察到荧光增强，提示H₂S_n水平上调。

Cyclooctyne-based probes

环辛炔（cyclooctyne）基团亦被用于H₂S_n检测。2024年Zheng等通过氨基甲酸酯连接剂将胺基荧光团与环辛炔偶联，反应机制为：环辛炔与H₂S₂反应生成过硫化物中间体iii，经脱硫及β-消除释放荧光团，该过程对H₂S_n特异。合成的QN-RHO-CT探针在荧光团骨架上引入季胺以增强水溶性及膜通透性，324/524 nm激发/发射下15分钟内完全响应Na₂S₂，成功检测活PC12及HeLa细胞中的H₂S_n。同年该课题组采用含OH荧光团通过醚连接剂构建系列探针，反应速率更快，其中Cyne-5被用于分析细胞内蛋白质S-过硫化水平，并实现BALB/c小鼠中外源/内源性H₂S_n的体内成像。

Conclusion and outlooks

近年H₂S_n探针的发展反映了这些RSS作为重要生物学贡献者的认知提升。本文总结了近期报道的H₂S_n荧光检测策略，涵盖已建立的识别模板（如DNP）及新发现的反应（如环辛炔反应），但仍存在局限：反应选项有限，均依赖H₂S_n比H₂S/RSH更强的亲核性；细微的取代基、识别基团或荧光团变化显著影响探针灵敏度与选择性，需继续优化已知模板并探索新反应；部分探针依赖高浓度有机溶剂或表面活性剂（如CTAB）以增强溶解性或反应效率，但表面活性剂可能影响H₂S_n/RSSH的溶液形态，未来需设计兼具高选择性、灵敏度、良好生物相容性及水溶性的探针；尽管探针已在细胞、动物及植物中应用，仍需更广泛的验证研究及独立重复实验以确立可靠性。期待可靠H₂S_n特异性荧光传感器的商业化及广泛应用，以及识别基团与荧光团设计的持续创新，推动阐明H₂S_n的生物学作用及机制。