动物双歧杆菌J12通过“代谢物-神经-内分泌”框架重塑酸奶风味平衡并缓解便秘的机制

《Current Research in Food Science》：Mechanisms of Bifidobacterium animalis J12 in Reshaping Yogurt Flavor Homeostasis and Alleviating Constipation via the "Metabolite-Nerve-Endocrine" Framework

　　张雅杰|邓宇|宋晓东|谢元红|高敬玉|张红星|金 Junhua
中国北京市农林大学食品科学与工程学院食品质量安全实验室，邮编102206

**摘要**
双歧杆菌在发酵乳制品中的应用常常受到储存稳定性不足以及微生物代谢与宿主益处之间机制联系不明确的限制。本研究探讨了动物双歧杆菌J12共发酵酸奶（J12-Y）的技术特性、香气稳定性以及缓解便秘的机制。J12共发酵产品在28天的冷藏期间保持了优异的理化稳定性，活菌计数仍高于7.0 log CFU/mL，并保留了经典的黄油奶油香气特征（2,3-丁二酮含量稳定在41–42）。在洛哌丁胺诱导的便秘小鼠模型中，J12-Y通过缩短首次排便时间（约110分钟对比131分钟）、增加粪便含水量（约56%对比28%）以及提高肠道传输速率（约67%对比45%）改善了肠道功能。从机制上讲，J12-Y引发了协调的代谢和神经内分泌事件链。粪便代谢组学分析显示短链脂肪酸（SCFAs）显著富集，尤其是乙酸、丙酸和丁酸，并调控了吲哚衍生物和胆汁酸相关代谢物。这些代谢变化伴随着促进肠道运动的神经内分泌特征，表现为兴奋性神经递质和激素（5-HT、ACh、SP、GAS、MTL）水平升高，抑制性信号（SS、VIP）水平降低。斯皮尔曼相关性分析进一步揭示了关键的功能联系：丁酸与5-HT（r=0.62）和肠道传输速率（r=0.80）呈正相关；乙酸与粪便含水量（r=0.67）呈正相关；脱氧胆酸与肠道传输速率（r=?0.82）和5-HT（r=?0.74）呈负相关。总体而言，这些发现支持了一种“代谢物-神经-内分泌”框架，即J12-Y通过整合的微生物代谢和神经内分泌调节机制缓解便秘。

**1. 引言**
随着消费者健康意识的提高，功能性发酵乳制品因具有益生菌作用（如调节肠道菌群和增强免疫力）而受到青睐[1]。双歧杆菌作为人体肠道中的核心益生菌，常被添加到酸奶中以赋予其特定的功能性[2]。然而，传统的商业发酵剂（如嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌亚种）在肠道中的存活能力有限，或在发酵和储存过程中活性容易下降[3]。例如，Meng等人（2024年）指出，外源添加的益生菌在发酵和冷藏过程中经常面临活性下降、风味劣化和质地不稳定等问题[3]。因此，筛选具有优异发酵特性、储存稳定性及显著改善宿主健康能力的新双歧杆菌菌株对于开发高质量功能性酸奶至关重要[1]。

本研究聚焦从婴儿肠道中分离出的动物双歧杆菌J12菌株。选择该菌株是因为它在食品工业中广泛应用，具有较好的安全性和稳定性，并且已被证明能在乳制品中良好存活[2]。与其他双歧杆菌种类（如长双歧杆菌或短双歧杆菌）相比，动物双歧杆菌具有更强的酸耐受性和氧耐受性，特别适合用于酸奶发酵和延长冷藏储存。先前研究发现，J12能够显著改善妊娠期高血糖情况并通过调节机体免疫系统增强口腔溃疡的免疫力[4]。本研究的核心假说是：酸奶中的动物双歧杆菌J12通过重塑风味代谢网络（如稳定关键黄油香气化合物2,3-丁二酮）的同时，通过其代谢物（如短链脂肪酸SCFAs）调节宿主肠道的神经内分泌功能，从而缓解便秘。这促使我们提出了一个“代谢物-神经-内分泌”综合模型。此外，利用非靶向代谢组学和GC-MS技术探究了J12重塑酸奶挥发性风味化合物的机制[5]，并通过洛哌丁胺诱导的便秘小鼠模型深入探讨了J12酸奶缓解便秘的潜在机制，重点关注关键指标、神经内分泌调节和肠道代谢物的变化[6]。值得注意的是，尽管一些先前研究表明双歧杆菌可能通过调节肠道微生物群来改善便秘，但本研究将产品级别的风味稳定性与宿主级别的神经内分泌结果相结合，并提出了一个统一的“代谢物-神经-内分泌”框架，将特定的微生物代谢物（尤其是SCFAs）与肠道神经系统信号传导联系起来。这种综合方法多维度地解释了单一益生菌菌株如何同时影响食品质量和宿主生理。

**2. 材料与方法**
**2.1. 菌株来源及酸奶制备工艺**
2.1.1. 菌株来源
J12（CGMCC编号25005）由我们的研究小组从3个月以下母乳喂养婴儿的肠道中分离获得。所使用的商业发酵剂（YoFlex-premium）来自Chr. Hansen公司，主要用于混合培养嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌亚种。
2.1.2. 酸奶制备
选取三种不同蛋白质含量的纯牛奶（2.8 g/100 mL、3.0 g/100 mL、3.2 g/100 mL），加热至50°C，加入6%（w/v）白砂糖，在95°C的水浴中灭菌5分钟后冷却至42°C进行接种。J12的接种量为1×10^7 CFU/mL，Chr. Hansen商业发酵剂的接种量为0.004%（v/v）。J12的接种量基于其在牛奶中的生长活力和产酸能力的初步优化，以确保其在共发酵体系中的主导地位，同时避免过量产酸影响质地。商业发酵剂的添加量严格遵循供应商的建议（Chr. Hansen YoFlex premium产品手册）。实验组（J12组）同时接种J12（1×10^7 CFU/mL）和Chr. Hansen商业发酵剂（0.004%）。对照组（YoF-P组）仅接种Chr. Hansen商业发酵剂。接种后，将样品置于42°C下发酵。发酵终点设定为70°C，因为这一酸度是酸奶达到良好凝胶状态的行业标准[7]。尽管不同蛋白质含量下的达到70°C所需时间略有差异（2.8%：约4.5小时，3.0%：约4.2小时，3.2%：约4.0小时），但采用相同的终点以确保后熟和后续储存条件的统一性。发酵4.5小时后，当酸奶样品酸度达到70°C时，将其冷却并在4°C下后熟16小时，随后在4°C下储存。在储存期间第0天、第7天、第14天和第28天分别取样，测定相关发酵指标。

**2.2. 理化指标和质地性质的测定**
2.2.1. 酸奶pH值和可滴定酸度的测定
在不同储存期间（20 ± 3°C）测量酸奶样品的pH值。酸度测定依据国家标准GB 5009.239-2016[7]进行。取5克酸奶样品（提前从4°C冰箱中取出并混合），加入20毫升水，用氢氧化钠标准溶液滴定至pH 8.3。滴定过程中持续搅拌并通入氮气以防止样品吸收空气中的二氧化碳。记录使用的氢氧化钠溶液体积，并根据以下公式计算酸度：
\[ \text{酸度} = \frac{x \times V_2}{V_1 \times m \times 0.1} \]
其中：x为酸奶酸度（单位：°T）；c为氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度（单位：mol/L）；V_2为滴定所用氢氧化钠溶液体积（单位：mL）；V_1为空白实验所用氢氧化钠溶液体积（单位：mL）；m为酸奶质量（单位：g）；0.1为氢氧化钠的理论摩尔浓度（单位：mol/L）。
2.2.2. 酸奶活菌计数的测定
每100毫升MRS固体培养基加入一支含5毫克木浦霉素的试管。从每组酸奶中取1毫升样品，加入9毫升0.85%无菌生理盐水稀释至10^-1浓度。进行10倍系列稀释后，采用平板计数法计数细菌数量。在37°C厌氧培养48小时后计算菌落数量。
2.2.3. 酸奶质地分析
对不同储存阶段的酸奶样品进行质地分析（TPA）。称取10克样品放入质地分析仪中，测量参数包括硬度、弹性（弹性）、内聚性、粘附性和咀嚼性。
2.2.4. 水分保持能力的测定
在不同储存阶段的酸奶样品中测定水分保持能力（WHC）。称取空离心管的质量为m1，将10毫升酸奶加入15毫升离心管中，离心8000转/分钟10分钟后弃去上清液，记录质量为m2。
2.2.5. 流变性质的测定
对不同储存阶段的酸奶样品进行流变性质分析。参考文献中的方法进行修改[10]。搅拌并取适量酸奶样品放置在分析仪中心。测量条件为：转速4（No. 4转子），温度25°C，剪切率0.1-100 rad/s。
2.2.6. 酸奶的感官评价
酸奶发酵完成后放入4°C冰箱进行后熟。后熟结束后，组织20名感官评价人员根据表S1中的评价标准对不同储存阶段的酸奶进行感官评价。

**2.3. 风味组学分析方法**
2.3.1. 挥发性风味化合物的测定
采用顶空固相微提取结合气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）方法分析挥发性风味化合物[11]。
**溶液制备**：取770微升正己烷，放入1.5毫升离心管中，依次加入C10-C25商用混合标准物及C26、C27、C28、C29正烷烃标准物，涡旋混合均匀得到C10-C29正烷烃混合标准溶液（50 μg/mL）。将该标准溶液稀释至10 μg/mL，与样品同时进行分析。取1.0克样品放入20毫升顶空试管中，加入2.5微升内标（萘-d8 20 μg/mL）和4毫升饱和氯化钠水溶液，立即密封试管。
**顶空技术/固相微提取（SPME）条件**：使用SPME Arrow Fiber（120 μm，Thermo，divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）。样品在60°C下平衡10分钟，然后在60°C下提取40分钟，最后在注射口中脱附5分钟。
**色谱条件**：酸奶样品以10:1的分流比注入气相色谱-质谱（GC-MS）系统，分离柱為VF-WAXms（25 m × 0.25 mm × 0.2 μm，Agilent CP9204）。入口温度240°C，载气为高纯度氦气，流速1.0 mL/min，隔膜吹扫流速3 mL/min。加热程序为：初始温度40°C，保持1分钟，然后以8°C/min的速度升至120°C，再以20°C/min的速度升至230°C，保持4.5分钟。数据预处理采用数据库注释，峰面积通过内标进行归一化。
**定量分析**：基于萘-d8的内标半定量方法进行定量，相对峰面积计算含量。方法验证结果显示，在0.1–200 μg/mL范围内线性良好（R2>0.99），检测限（LOD）为0.01–0.10 μg/mL（S/N≥3），定量限（LOQ）为0.05–0.30 μg/mL（S/N≥10），日内精密度RSD≤9.5%，日间精密度RSD≤14.2%，回收率82.5%–115.8%。气味活性值（OAV）的计算公式为OAV = Ci / Ti，其中Ci是化合物的相对含量（μg/g），Ti是水/牛奶基质中的气味阈值（μg/g），主要参考了Czerny等人（2008）[13]的研究结果，以及van Gemert（2011）针对乳制品基质的特定阈值的研究。数据处理包括使用内标法进行峰面积归一化，并通过数据库匹配进行化合物鉴定。我们认识到基质效应（蛋白质、脂肪、pH值）可能会影响OAV的准确性；因此，在简单水体系中确定的阈值可能无法完全反映酸奶基质的实际情况。这一局限性在文中也有所讨论。

2.3.2. 酸奶的代谢组学分析
非靶向代谢组学分析按照先前描述的方法[14][15]进行。将储存在-80°C下的酸奶样品在4°C下解冻，涡旋1分钟以确保均匀性，然后每种样品取100 μL转移到1.5 mL离心管中。代谢物的提取及后续分析采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术进行。数据处理的分析过程遵循既定协议[16][17][18][19]。每5-10次进样时插入质量控制（QC）样本以监测仪器稳定性，QC样本中RSD超过30%的代谢物被排除在外。

2.4. 便秘小鼠模型的建立及指标检测
所有实验操作均符合相关法律法规和机构指南，并得到了北京农业大学动物伦理委员会的批准（批准编号：GSCS-2025-006，日期：2025年4月10日）。实验所用小鼠为5周大的BALB/c（SPF等级）雄性小鼠（北京维塔尔河实验动物技术有限公司提供）。动物的饲养和管理严格遵循北京农业大学动物伦理委员会的规定。

2.4.1. 菌株与酸奶的制备
酸奶的制备方法与上述相同。称取20克酸奶，加入生理盐水稀释至其中含有5 × 10^9 CFU/mL的动物乳杆菌（B. animalis）活菌数。J12菌粉溶液中的活菌数为5 × 10^9 CFU/mL。剂量根据FDA的动物与人等效剂量转换公式计算，将成人每日推荐摄入的益生菌量（10^10 – 10^11 CFU/天）转换为适合小鼠体重的有效剂量。

2.4.2. 便秘小鼠模型的建立
本研究选取了80只5周大的BALB/c雄性小鼠。经过1周的适应性喂食后，将其随机分为7组（图1）：空白对照组（n = 8）、模型组（n = 12）、J12酸奶组（J12-Y，n = 12）、YoF-P酸奶组（YoF-P-Y，n = 12）、J12菌粉组（J12-P，n = 12）、YoF-P菌粉组（YoF-P-P，n = 12）和牛奶组（n = 12）。空白对照组（n = 8）用于作为健康基线对照，而干预组（n = 12）的设计考虑了多次采样（血清、粪便、组织）和个体差异。样本量使用G*Power软件计算得出（α = 0.05，功效 = 0.8），每组至少需要8只小鼠；设置12只小鼠是为了应对可能的实验中途死亡或排除情况。整个实验过程（包括灌胃、指标检测和数据分析）由不同研究人员完成，他们对组别分配情况不知情。

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图1. 动物实验流程图
实验过程如下：
- 干预期（2周）：每组每天灌胃相应样品（0.2 mL），空白组和模型组灌胃生理盐水。菌粉浓度为5×10^9 CFU/mL。
- 建模期（1周）：除空白组外，每组每天灌胃洛哌丁胺盐酸盐（20 mg/kg·体重，Sigma-Aldrich，CAS号34552-83-5）以诱发便秘，1小时后灌胃相应样品。洛哌丁胺的剂量和建模持续时间基于先前建立的方案[20]，并通过初步实验验证其能有效抑制肠道运动并诱导便秘相关表型。
- 建模和干预阶段结束后，给予活性炭进行肠道转运相关测试。在第27天测定粪便水分含量，第28天记录首次出现黑便的时间，第29天测定小肠推进能力，并在第29天给予活性炭后30分钟进行解剖。

2.4.3. 小鼠粪便的收集及水分含量的测定
实验第27天早晨灌胃前，收集新鲜粪便并放入称重后的1.5 mL离心管中。记录灌胃前的粪便湿重。粪便经真空冷冻干燥后密封保存并称重，得到干重。水分含量通过以下公式计算：

2.4.4. 首次出现黑便时间的测定
第28天早晨正常灌胃后，将每只小鼠单独放入铺有滤纸的笼子中，并记录开始时间。当小鼠排出首次黑便时，计时结束。两次时间间隔即为首次出现黑便的时间。实验前小鼠禁食16小时，但可自由饮水。

2.4.5. 小肠推进率的测定
第29天早晨灌胃样品1小时后，所有组均灌胃活性炭稀释液（10%活性炭和5%阿拉伯胶在生理盐水中，活性炭和阿拉伯胶均购自Sigma-Aldrich）。准确计时30分钟后处死小鼠。解剖小鼠腹腔，从小肠幽门顶端至盲肠末端测量小肠长度。从小肠幽门到活性炭溶液起始点的长度记为“活性炭溶液推进长度”。小肠推进率的计算公式如下：
小肠推进率（%）= 活性炭溶液推进长度 / 小肠总长度 × 100%
该方法基于经典的活性炭餐测试[21]。

2.4.6. 血清胃肠激素及肠道运动相关神经递质水平的测定
为减少昼夜节律的影响，所有小鼠在上午9:00至11:00之间被处死后进行采样。通过眼球摘除法采集血液样本，在室温下放置30分钟使其凝固，然后在4°C下以3000 rpm离心15分钟。分离血清，分装并置于-80°C保存待进一步分析。使用商业ELISA试剂盒（详细信息见补充表S2）测定胃泌素（Gas）、胃动素（MTL）、生长抑素（SS）、血管活性肠肽（VIP）、P物质（SP）、乙酰胆碱（Ach）、5-羟色胺（5-HT）和降钙素基因相关肽（CGRP）的浓度。

2.4.7. 肠道代谢物的测定
采用非靶向代谢组学方法分析肠道代谢物。称取5毫克小鼠粪便放入2 mL离心管中，按照前述方法[22]进行代谢物提取。包括短链脂肪酸、胆汁酸、氨基酸衍生物和吲哚化合物在内的代谢物通过LC-MS/MS（Thermo Fisher Scientific）进行分析。由于资源限制，每组仅使用部分样本（n = 6个）进行这些检测，具体见图例说明。

2.4.8. 粪便中短链脂肪酸（SCFAs）的测定
将0.1克收集的小鼠粪便在室温下解冻30分钟。使用组织裂解仪以70 Hz/min的速度分散3分钟，加入15 μL内标2-乙基丁酸（2000 μg/mL），再加入磷酸（1 mL 0.5 %，v/v），以70 Hz/min的速度分散5分钟。涡旋混合1分钟后，以12000 rpm离心10分钟。收集上清液，与乙酸乙酯（1 mL）混合，涡旋混合2分钟后，以12000 rpm离心10分钟。用0.22 μm过滤器过滤提取上层溶液。

GC方法用于测定SCFAs含量。检测条件和程序配置如下：使用气相色谱系统（7890A，Agilent Technologies，美国帕洛阿尔托）配备火焰离子化检测器（FID）和熔融石英毛细管柱（DB-WAX，60 m，内径0.25 mm，0.25 μm；Agilent）。载气为氦气，流速为1 mL/min。柱温曲线设置为：先从90°C升温1分钟，以15°C/min的速率升至150°C，保持1分钟；再以5°C/min的速率升至170°C，然后升至240°C并保持5分钟。进样体积为1 μL。利用内标（2-乙基丁酸）校准曲线从峰面积计算乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸的含量。

2.5. 数据处理与分析
所有实验均按照标准协议进行，数据以平均值±标准差（mean ± SD）表示。使用SPSS Statistics 27进行单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）。p< 0.05视为统计学显著。进行单因素方差分析后，使用Tukey’s HSD进行多重比较。对于非参数数据，应用Kruskal-Wallis检验。Spearman相关分析用于评估代谢物与神经内分泌因子之间的关联。P值< 0.05视为统计学显著。使用Origin 2021软件进行数据可视化和图表制作。

3. 结果与讨论
3.1. J12发酵酸奶的技术性能与储存稳定性
如图2所示，在28天的冷藏储存期间，添加动物乳杆菌J12并未影响酸奶的稳定性和质地[19]。J12酸奶和YoF-P对照组均表现出典型的酸化后变化，pH值从第0天的约4.6–4.7降至第28天的约4.2–4.3（图2A），同时可滴定酸度从约70–75 °T升至88–92 °T（图2C）。J12的活菌数保持在功能水平，从第1天的8.0–8.2 log CFU/mL适度下降至第28天的7.0–7.2 log CFU/mL（图2B），表明益生菌具有良好的持久性。质地参数总体稳定：硬度维持在0.38–0.48之间（图2J），黏聚性在0.40–0.55之间（图2D），弹性在0.75–0.90之间（图1E），表观黏度在15–25 Pa·s范围内（图2F），高蛋白配方（3.0%和3.2%）表现出更好的一致性。所有样品在整个储存过程中均表现出明显的剪切变稀行为（图2G-I），证实了流变结构的保持，同时水分保持能力较高（约65–95%），J12酸奶的水分保持能力与对照组相当或略有提高（图2K）。

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图2. 不同蛋白质浓度（2.8、3.0和3.2 g/100 mL）的J12发酵酸奶在冷藏1、14和28天后的理化、质地和流变特性。（A）pH值的变化；（B）J12乳杆菌的活菌数（log CFU/mL）；（C）可滴定酸度（TA，°T）；（D）黏聚性；（E）弹性；（F）表观黏度；（G-I）第1天（G）、第14天（H）和第28天（I）的表观黏度与剪切率关系曲线；（J）硬度；（K）水分保持能力（WHC，%）。
注：数据以平均值±标准差表示。不同小写字母表示组间存在显著差异（p < 0.05）。
统计分析采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）及Tukey’s事后检验。
总体而言，这些结果表明J12在技术上适用于酸奶发酵，在冷藏储存期间保持了优异的理化稳定性、益生菌活性和理想的质地[19]。本研究的流变特性分析主要关注剪切依赖的流动行为（表观黏度与剪切率的关系），这直接反映了酸奶的口腔和吞咽特性。所有样品在整个储存过程中均表现出典型的剪切变稀行为，J12酸奶的流变特性与YoF-P对照组相当，支持J12不会对酸奶的理想流动特性产生不良影响的结论。

3.2. 储存期间酸奶的感官评价
图S1显示了储存过程中各组酸奶感官质量的动态变化。尽管颜色和组织状态评分有所下降且组间无明显差异，表明J12未对酸奶的外观产生负面影响，但在风味和口感方面具有显著优势。与YoF-P组持续下降的趋势不同，J12组的风味评分最初上升后下降，在第14天达到峰值。这个峰值可能归因于在早期储存过程中J12的持续代谢，它产生了关键的风味化合物，如2,3-丁二酮，而后期成熟过程增强了口腔感觉；在后续储存中，一些风味化合物的降解或不良风味的产生导致略有下降[22]。特别是对于高蛋白（3.0%和3.2%）的J12组，第14天的口感评分显著高于其他组（p < 0.05），这可能是由于益生菌黏液产生和后期成熟改善了质地[23]。总之，引入J12显著提高了酸奶的风味细腻度和整体接受度。

3.3. 香气稳定性与挥发性成分的差异表达
通过定量分析（表1）、OAV评估、聚类分析（图3A）、香气化合物关联网络（图3B）和差异代谢物表征（图3C, 3J–O）来评估J12发酵酸奶的挥发性成分和香气稳定性。

表1. J12组和YoF-P组酸奶中关键风味化合物的OAV分析
空白单元格 名称 感官阈值 mg·L-1 OAV 香气属性

1 乙酸 900 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 醋具有辛辣、酸味
2 丁酸 3.19 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 黄油、奶酪、果味
3 2,3-丁二酮 0.00 54 1.57 42.23 42.42 41.45 42.20 黄油、奶油香草味
4 2-辛酮 0.04 1.74 1.75 1.75 1.73 1.75 1.74 奶酪、奶香味
5 2-庚酮 0.20 0.49 0.50 0.49 0.49 0.48 水果味、辛辣味
6 2-壬酮 0.08 1.21 1.21 1.22 1.20 1.21 1.21 草本植物、清新、浓郁的花香
7 2-十一酮 0.03 0.01 0.01 0.01 0.01 0.00 花香、玫瑰香味
8 2,3-戊二酮 0.00 54 43.87 44.28 47.69 46.85 46.14 奶油味、焦糖味、坚果香
9 非烷酮 0.01 51 4.47 14.29 14.40 14.60 14.56 柑橘、玫瑰、果味
10 古龙脑醇 0.00 75 25.19 25.26 25.67 24.68 24.94 甜味、果味
11 2,4-癸二烯醛 0.00 0.56 6.33 6.19 6.05 6.04 甜味、坚果味
12 苯乙醛 0.00 92 1.24 21.44 21.89 21.50 21.36 21.97 甜味

图3. J12共发酵酸奶在储存过程中挥发性风味化合物和非挥发性代谢物的动态变化及其关联模式。
(A) 挥发性风味化合物的差异热图
(B) 将代谢物与气味描述符关联的网络图
(C) 非挥发性代谢物的差异热图
(D-I) 储存过程中代表性挥发性化合物的相对丰度
(J-O) 储存过程中代表性非挥发性代谢物的相对丰度。详细化合物名称见正文。

注：数据以平均值±标准差表示。不同的小写字母表示组间有显著差异（p < 0.05）。

酮类代表了检测到的最丰富的挥发性化合物（17种；表S3），突显了羰基代谢的主要贡献。值得注意的是，J12酸奶通过稳定的2,3-丁二酮有效保持了经典的黄油奶油香气骨架，其丰度在储存过程中保持一致（OAV约为41–42，表1；相对丰度在图3E中稳定）。尽管储存过程中pH值从大约4.6下降到4.2（图2A），这在理论上可能会使2,3-丁二酮不稳定，但J12组的OAV值在整个储存过程中保持稳定。这种明显的稳定性可能归因于几种补偿机制：J12代谢连续生成2,3-丁二酮的前体（例如α-乙酰乳酸）；与牛奶蛋白质基质的结合增强了稳定性；以及复杂酸奶基质的保护[24]。这些观察结果表明，J12可能在酸性储存条件下具有维持黄油香气的独特代谢能力。

相比之下，传统酸奶（YoF-P）更依赖于2,3-戊二酮，在对照组中其相对丰度较高（图2F），表明两种菌株之间的碳流分配不同。这种差异的分子基础可能涉及菌株特异性的酶促途径。J12可能含有调节2,3-丁二酮和2,3-戊二酮之间碳流分配的α-乙酰乳酸合酶和二乙酰还原酶活性。这与不同乳酸菌对丁二烯醇脱氢酶具有不同底物特异性的报道一致，这种酶控制着二乙酰和乙醛的平衡[25]。

香气化合物关联网络（图3B）进一步说明了这一区别：2,3-丁二酮（二乙酰）形成了与黄油/奶油描述符强烈关联的中心节点，确认了其在J12香气身份中的主导作用。虽然2,3-戊二酮也对奶油风味有类似贡献，但在对照组中其相对优势表明了实现相似感官特征的替代代谢策略。

有机酸显示了最显著的处理依赖性差异。乙酸在J12中的相对丰度始终较高（图3D），这与双歧杆菌的异型发酵代谢一致。然而，其OAV低于1（表1），表明其直接感官影响可以忽略不计，从而证实J12的香气稳定性主要来源于酮类代谢而非酸的积累。

芳香复杂性通过苯乙醛（花香/蜂蜜味，图3G）、古龙脑醇（花香/果味，图3H）和2,4-癸二烯醛（甜味/坚果味，图2I）得以维持，这些成分在J12和对照组之间显示出相当的稳定性，支持J12通过特定的羰基途径重塑香气而不破坏整体芳香平衡。

除了挥发性产物外，差异代谢物分析揭示了受J12调节的上游代谢特征。生物活性肽相关代谢物（Pro-Val, β-丙氨酰-L-赖氨酸）（图3J, 3O）、胆汁酸特征（chenodeoxycholic acid, taurocholic acid）（图3K–L）、脂质相关底物（hexadecanedioic acid；图3M）和含硫指纹（图3N）共同展示了一个独特的代谢景观，这可能重塑了前体池以支持观察到的特定挥发性表达。

总之，J12发酵通过稳定的2,3-丁二酮独特地保留了主导的黄油奶油香气骨架（与依赖2,3-戊二酮的对照组不同），引入了有机酸和芳香途径中的特征性代谢特征，并在整个冷藏储存过程中保持了出色的香气稳定性。

3.4. J12发酵酸奶通过改善肠道传输和粪便水合作用缓解便秘
基于第3.1节中证实的J12在高蛋白基质中的优异存活率，我们推测它能携带更多的活性细菌到达肠道。因此，本节评估了J12发酵酸奶（J12-Y）在洛哌丁胺诱导的便秘小鼠模型中的体内疗效。

如图4所示，不同的干预策略在缓解洛哌丁胺诱导的便秘方面的效果明显不同。牛奶与模型组相比仅有轻微改善（首次出现黑色粪便大约125分钟，粪便水分含量大约53%，肠道传输率大约62%），表明其促动作用有限，超出了基本营养提供的范围。传统酸奶（YoF-P-Y）和J12酸奶（J12-Y）显示出中等疗效，显著缩短了排便潜伏期至大约110分钟，并将粪便水分含量恢复到大约55–56%（图4A-B），这可能是通过一般的益生菌代谢物和发酵乳制品生物活性实现的。

图4. J12发酵酸奶对便秘小鼠排便参数和肠道传输的影响。
(A) 第一次出现黑色粪便的时间（分钟）；(B) 粪便水分含量（%）；(C) 肠道传输率（%）。

注：数据以平均值±标准差表示。不同的小写字母表示组间有显著差异（p < 0.05）。

J12-Y在便秘相关指标上表现出显著改善，将首次出现黑色粪便的时间缩短至大约110分钟（对照组为131分钟），将粪便水分含量恢复到大约55%，并提高了肠道传输率至大约67%（图4A–C）。这些发现共同表明，J12发酵酸奶（J12-Y）通过改善粪便水合作用和肠道推进能力有效缓解了洛哌丁胺诱导的便秘。尽管两种酸奶之间的差异并不总是具有统计学意义，但J12-Y在肠道传输率方面的提升更为显著。

3.5. 通过兴奋-抑制信号再平衡恢复肠道运动性
J12-Y恢复了兴奋性信号（大约320 pg/mL 5-HT和400 pmol/L ACh）和与运动性相关的激素（GAS和MTL）（图5A–D）。

图5. 对小鼠胃肠激素和神经递质的调节作用。
(A) 5-羟色胺（5-HT），(B) 乙酰胆碱（Ach），(C) 胃泌素（Gas），(D) 运动素（MTL），(E) P物质（SP），(F) 生长抑素（SS），(G) 血管活性肠肽（VIP），(H) 降钙素基因相关肽（CGRP）。

注：数据以平均值±标准差表示。不同的小写字母表示组间有显著差异（p < 0.05）。

5-HT的水平从模型组的大约280 pg/mL增加到J12-Y的320 pg/mL，代表了约14%的升高。然而，这种变化在局部肠道微环境中可能会被显著放大，因为肠嗜铬细胞将5-HT直接释放到附近的神经末梢，足以影响肠道蠕动。其他关于肠道微生物群-宿主相互作用的研究也显示，循环中5-HT的类似适度变化具有生理意义[26]。此外，本研究中5-HT的增加与肠道传输率的提高（从约45%增加到约67%，图4C）和首次出现黑色粪便时间的缩短（从约131分钟减少到约110分钟，图4B）相吻合。这些协调的功能改善提供了内部验证，证明观察到的神经内分泌变化具有生理意义。此外，多种兴奋性神经递质（5-HT, ACh, SP）的协调上调以及抑制性信号（SS, VIP）的下调共同反映了朝向促进运动性的神经内分泌调节的功能转变，这可能比任何单一标志物的变化具有更大的整体影响。

与模型组相比，J12-Y显著提高了肠道传输率（J12-Y中GAS从大约22 ng/L增加到大约57 ng/L，MTL从大约65 ng/L增加到大约100 ng/L（图5C–D）。作为配方比较，J12粉末组的GAS和MTL值分别在大约58–65 ng/L和大约105 ng/L范围内（图5C–D），表明J12干预措施在内分泌恢复方面大致相当。两种J12配方都恢复了兴奋性信号，其中J12-Y的5-HT和ACh水平与粉末组相当或略微更高（图5A–B）。总体而言，J12-Y表现出以兴奋性上调和抑制性调节为特征的协调促运动性神经内分泌谱型（图5）。

J12-Y还减弱了抑制性信号。生长抑素（SS）从模型组的大约42 ng/L降低到J12-Y的大约35 ng/L，VIP从大约241 ng/L降低到大约178 ng/L（图5F–G）。兴奋性神经肽P物质（SP）在所有干预组中增加了大约65 ng/L（图4E），而CGRP在各组之间的变化很小（大约18–20 pg/mL）（图5H）。这些发现表明，J12-Y与促进运动性的神经内分泌谱型相关，其特征是兴奋性标记物的增加和抑制性信号的减少（图5）。

值得注意的是，虽然J12粉末组的SS水平较低（SS约为29 ng/L），但J12-Y显示出更高的兴奋性5-HT（大约320 vs. 大约280–300 pg/mL）以及降低的VIP（大约178 ng/L和大约35 ng/L）（图5A, F–G）。这种“兴奋性上调与抑制性调节”的协调模式支持了J12-Y在所提出的代谢物-神经-内分泌框架内的机制解释（图5）。

3.6. SCFA富集和肠道信号代谢物的恢复
如图6所示，J12-Y显著重塑了粪便微生物代谢物，特别是恢复了被洛哌丁胺耗尽的关键SCFA。具体来说，J12-Y将醋酸增加到大约100 μmol/g（模型组约为75–80 μmol/g），丙酸增加到大约19 μmol/g（模型组约为9 μmol/g），丁酸增加到大约33 μmol/g（模型组约为13 μmol/g）（图6A–C）。其他SCFA也显示出类似的恢复趋势（图6D–F）。除了SCFA，J12-Y还表现出吲哚衍生物（5-羟基吲哚乙酰甘氨酸，氧吲哚）和胆汁酸代谢物（脱氧胆酸，牛胆酸）的显著变化（图6J--O），形成了一个全面的“信号-代谢物”特征。这些代谢变化与J12-Y中观察到的强烈神经内分泌调节及其在缓解便秘中的疗效相关。

图6. 短链脂肪酸（SCFAs）和小鼠粪便中的关键脂肪酸。
(A-F) 主要SCFAs的浓度（μmol/g）：(A) 乙酸，(B) 丙酸，(C) 丁酸，(D) 戊酸，(E) 异丁酸，(F) 异戊酸。
(G-I) 代表性长链和羟基脂肪酸的相对丰度：(G) 油酸，(H) 棕榈酸，(I) DL-2-羟基硬脂酸。
(J-M) 关键色氨酸/吲哚相关微生物代谢物的相对丰度：(J) 5-羟基吲哚乙酰甘氨酸，(K) 氧吲哚，(L) 吲哚丙酮酸，(M) 5-甲氧基吲哚乙酸。
(N-O) 与胆汁酸相关的信号代谢物的相对丰度：(N) 脱氧胆酸和(O) 牛胆酸。

注：数据以平均值±标准差表示。不同的小写字母表示组间有显著差异（p < 0.05）。

图7. 粪便代谢物、血清神经内分泌因子和便秘相关表型的Spearman相关热图。颜色等级代表相关系数（r），范围从?1.0（紫色，负相关）到+1.0（浅蓝色，正相关）。变量包括粪便代谢物（短链脂肪酸、吲哚衍生物和胆汁酸）、血清神经内分泌因子（5-HT, Gas, MTL, SS, SP, VIP）和生理表型（粪便水分含量，首次出现黑色粪便的时间，肠道传输率）。热图为提出的“代谢物-神经内分泌”框架提供了统计支持，该框架将微生物代谢物重塑与神经内分泌调节和便秘缓解联系起来。

除了SCFA之外，脂质相关代谢物也显示出适度的但可检测到的调节。亚油酸、棕榈酸和DL-2-羟基硬脂酸的相对丰度在各组之间大致相当，表明J12主要影响了微生物的发酵产物，而不是引起过度的脂质紊乱（图6G-I）。重要的是，几种色氨酸/吲哚衍生的微生物代谢物发生了显著变化。例如，5-羟基吲哚乙酰甘氨酸在干预组中升高（图6J），而氧吲哚和吲哚丙酮酸显示出部分正常化趋势（图6K-L），这表明芳香氨基酸代谢可能与5-羟色胺信号传导有关[27]。此外，与胆汁酸相关的代谢物如脱氧胆酸和牛磺胆酸也发生了变化（图6N-O），这支持了微生物胆汁酸转化和肠道信号通路受菌株调控的观点。3.7. 综合机制概述：“代谢物-神经-内分泌”框架：将酸奶代谢与宿主运动能力联系起来为了整合本研究生成的多层次证据，我们提出了一个整合的三层“代谢物-神经-内分泌”框架，通过该框架，动物双歧杆菌J12能够在维持产品风味稳定性的同时缓解体内便秘（图8）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图8. 动物双歧杆菌J12酸奶通过“代谢物-神经-内分泌”调节机制缓解便秘的示意图。第一层（图8）表明，J12在技术上适用于酸奶生产和冷藏储存，能够保持益生菌的活力（>7.0 log CFU/mL）和稳定的流变结构（图2），同时保留了经典的黄油奶油香气骨架，因为关键的高OAV羰基化合物（例如2,3-丁二酮）在储存过程中保持稳定（图3A-B，表1）；同时，菌株特异的代谢特征（例如醋酸盐富集和特征前体池）表明J12能够在不影响感官接受度的情况下微妙地改变代谢过程（图3C-O）。在此基础上，第二层（图8）展示了J12-Y代谢产物在体内的转化效果，这一效果得到了粪便短链脂肪酸（SCFAs）和代谢组学数据的支持（图6）。具体来说，J12-Y显著恢复了被洛哌丁胺抑制的主要SCFAs，包括醋酸盐（J12-Y中约为100 μmol/g，而模型组约为75–80 μmol/g）、丙酸酸盐（J12-Y中约为18–19 μmol/g，而模型组约为9 μmol/g）和丁酸酸盐（J12-Y中约为33 μmol/g，而模型组约为13 μmol/g），其中丁酸酸盐的增加尤为显著（J12-Y中约为33 μmol/g，而模型组约为13 μmol/g）。同时，J12-Y还协调调节了与信号传导相关的代谢物，包括吲哚衍生物和胆汁酸相关代谢物（图6J–O），形成了一个超越单纯SCFAs恢复的连贯的“信号-代谢物”谱型。这些代谢特征伴随着促进运动的神经内分泌变化，表现为兴奋性神经递质和与运动相关的激素（5-HT/ACh/SP和GAS/MTL）的增加，以及抑制性SS/VIP信号的减少（图5），共同支持了所提出的代谢物-神经-内分泌框架在缓解便秘中的作用（图8）。为了进一步验证“代谢物-神经-内分泌”轴，构建了一个Spearman相关性热图，整合了粪便代谢物、血清神经内分泌标志物和生理表型（补充图7）。分析显示了一个强大的生物网络。值得注意的是，粪便中的丁酸与兴奋性神经递质5-HT存在强烈的正相关（r = 0.62），与抑制性肽VIP存在负相关（r = ?0.54）。此外，丁酸与肠道转运率存在高度正相关（r = 0.80），而5-HT本身也与肠道转运率存在正相关（r = 0.74）。同时，乙酸与粪便水分含量存在显著正相关（r = 0.67）。相比之下，与胆汁酸相关的代谢物如脱氧胆酸与肠道转运率和5-HT均存在强烈负相关（r = ?0.82和r = ?0.74），这表明J12介导的胆汁酸代谢调节可能有助于缓解对肠道神经系统的抑制。总体而言，这些强烈的统计相关性提供了关键证据，表明J12驱动的特定SCFAs（特别是丁酸和醋酸盐）的富集与肠道神经内分泌信号的重新平衡有关，从而促进了肠道运动和粪便水分的恢复。第三层（图8）表现为通过生理终点支持的综合性抗便秘功能效果（图4）。与模型组相比，J12-Y将首次排出黑色粪便的时间从大约130分钟缩短到大约110分钟（图4B），提高了粪便水分含量从大约28%提高到大约56%（图4A），并增强了小肠推进/转运率从大约45%提高到大约67%（图4C）。这些第三层的结果与第二层的代谢物重塑（图6）和伴随的神经内分泌变化（图5）一起，共同支持了所提出的模型（图8）。整个第一层→第二层→第三层的级联作用表明，J12发酵的酸奶在保持产品质量和香气特性的同时，通过促进代谢重塑和神经内分泌调节来缓解便秘（图6）。4. 结论与动物双歧杆菌J12共同发酵产生了功能性酸奶，在28天的冷藏储存期间保持了益生菌的活力（>7.0 log CFU/mL），并保持了经典的黄油奶油香气骨架，这得益于稳定的2,3-丁二酮（OAV约为41–42）。在体内实验中，J12酸奶（J12-Y）缓解了洛哌丁胺引起的便秘，表现为首次排出黑色粪便的时间缩短（大约110分钟 vs. 大约131分钟），恢复了粪便水分含量（大约56% vs. 大约28%），并增强了肠道推进/转运能力（大约67% vs. 大约45%）。从机制上讲，J12-Y与协调的代谢物-神经内分泌谱型相关，包括粪便SCFAs的富集（醋酸盐约为100 μmol/g vs. 大约75–80 μmol/g；丙酸酸盐约为18–19 μmol/g vs. 大约9 μmol/g；丁酸酸盐约为33 μmol/g vs. 大约13 μmol/g），以及吲哚衍生物和胆汁酸相关代谢物的调节。这些代谢变化伴随着促进运动的神经内分泌谱型，表现为兴奋性神经递质和激素（5-HT, ACh, SP, GAS, MTL）的增加和抑制性信号（SS, VIP）的减少。Spearman相关性分析进一步揭示了这一网络内的关键功能联系：丁酸与5-HT和肠道转运率存在强烈正相关，而5-HT本身也与肠道转运率正相关；乙酸与粪便水分含量正相关；脱氧胆酸与肠道转运率和5-HT均存在负相关。总体而言，这些发现支持了所提出的代谢物-神经-内分泌框架，即J12-Y通过综合的微生物代谢和神经内分泌调节来缓解便秘。5. 局限性需要承认几个局限性。洛哌丁胺诱导的便秘模型主要是通过药理学方式抑制肠道运动，因此观察到的代谢变化可能是由于肠道运动恢复而非直接的微生物调节引起的。因此，所提出的“代谢物-神经-内分泌”框架基于相关性证据，尚未通过直接因果验证（例如使用GPR41/43拮抗剂、无菌小鼠或时间进程实验）来证实，也没有确定时间顺序。未评估炎症标志物和肠道通透性，因此未探索抗炎效应或屏障修复等替代机制。挥发性风味分析采用了内部标准半定量方法，缺乏全面的外部验证，限制了绝对量化。关于质地分析，TPA测量中使用了10毫米的压缩距离（大约100%的菌株变化）。虽然这一参数允许与我们的先前研究进行一致比较，并且没有掩盖观察到的组间差异或储存趋势，但我们认识到如此高的菌株变化可能会部分破坏凝胶结构。未来的研究应考虑使用较低的菌株变化范围（例如30–50%），以获得更接近样品原始状态的质地参数。在流变特性分析中，本研究主要关注剪切依赖的流动行为（表观粘度与剪切率的关系），这直接反映了口腔和吞咽特性。然而，未进行振荡粘弹性测量（储能模量G′和损耗模量G″）。因此，凝胶网络结构尚未得到完整描述。未来的研究应结合振荡流变学，以便更全面地理解凝胶网络。我们还注意到缺乏关于J12在小鼠肠道中定植的定量数据。未测定粪便或肠道组织中J12的活菌负荷，这限制了我们区分直接定植效应和代谢物介导作用的能力。未来的研究应包括定植测定（例如，菌株特异性qPCR或选择性接种）来解决这一缺口。未引用的参考文献[8]。作者贡献张亚杰（第一作者）：概念化、数据整理、正式分析、调查、方法学、软件、可视化、初稿撰写、审稿编辑。邓宇（第一作者）：数据整理、正式分析、调查、方法学、验证、初稿撰写。宋晓东：资源准备、调查。谢圆红：方法学、验证。高尚宇：方法学、软件、正式分析。张洪兴（通讯作者）：概念化、资金获取、监督、审稿编辑。金俊华（通讯作者）：概念化、项目管理、监督、审稿编辑。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。数据可用性支持本研究发现的数据可根据合理请求从通讯作者处获得。