《eBioMedicine》：The presynaptic protein bassoon is a biofluid biomarker of synaptic pathology in multiple sclerosis
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背景：神经轴突和突触丢失是多发性硬化（multiple sclerosis, MS）的核心特征，但目前尚不清楚突触病理出现在疾病哪个阶段。研究人员假设血浆和脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中的突触蛋白可反映MS的突触损伤。
方法：为鉴
背景：神经轴突和突触丢失是多发性硬化（multiple sclerosis, MS）的核心特征，但目前尚不清楚突触病理出现在疾病哪个阶段。研究人员假设血浆和脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中的突触蛋白可反映MS的突触损伤。
方法：为鉴定神经炎症期间丢失的突触蛋白，研究人员对实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE，MS动物模型）小鼠的突触神经小体进行蛋白质组学分析，通过组织学在EAE小鼠皮层及MS死后组织中验证结果；开发经敲除验证的抗体的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）用于定量EAE小鼠皮层、脊髓、血浆及MS患者队列的CSF（总n=30）、血清（总n=146）中Bassoon（BSN）水平；采用线性混合效应模型比较原发性进行性MS（primary progressive MS, PPMS）队列（n=26）的血清BSN（sBSN）与血清神经丝轻链（serum neurofilament light chain, sNfL）纵向轨迹。
结果：突触神经小体筛选显示EAE小鼠皮层多种突触前蛋白（包括BSN）水平降低，该突触BSN丢失在EAE及MS患者死后皮层组织中得到验证；值得注意的是，EAE和MS期间BSN同时在神经元胞体内累积，提示BSN可作为监测疾病病理的合适生物标志物。ELISA检测显示EAE小鼠皮层BSN逐步丢失，同时两个独立的急性和慢性EAE队列中血浆BSN水平均升高；MS患者中，所有CSF样本均可检测到BSN，81%的血清样本可检测到BSN；复发型MS和PPMS的CSF BSN水平高于对照组，而继发性进行性MS（secondary progressive MS, SPMS）和PPMS的sBSN水平升高。在纵向PPMS队列中，平均随访37个月期间sBSN和sNfL无变化且两者无相关性。
解读：综上，突触前蛋白BSN可在血浆和CSF中定量以评估突触病理，其在疾病最早阶段即可检测到升高并在进行性MS中持续存在，凸显MS中存在持续的神经退行性变；检测突触蛋白可补充现有神经元损伤生物标志物，加深对MS神经退行性变的理解。
本研究由汉堡创新转化基金、德国多发性硬化协会、德国研究联合会资助。
该研究发表于《eBioMedicine》，针对多发性硬化（multiple sclerosis, MS）领域突触病理缺乏可及性生物标志物的现状展开。MS是最常见的中枢神经系统自身免疫性疾病，目前已知神经轴突和突触丢失是其核心特征，且与残疾程度相关性最强，残疾累积在复发型MS（relapsing MS, RMS）的最早阶段即可检测到，主要由与复发活动无关的疾病进展驱动，但突触病理的发生阶段仍不明确。现有已建立的生物标志物中，神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）主要反映急性轴突损伤，胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）反映星形胶质细胞病变，正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET）虽可检测突触密度但成本高、可及性有限，因此亟需补充可反映突触退行性变的易获取生物标志物。此前研究已发现突触前蛋白Bassoon（BSN）在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）和MS脑内累积并促进神经退行性变，但其能否作为MS的体液生物标志物尚未明确，本研究即围绕该假设开展。
研究人员采用了多项关键技术方法：首先利用EAE小鼠模型，通过突触神经小体蛋白质组学筛选神经炎症中丢失的突触蛋白，结合小鼠及MS患者死后组织的免疫组织化学验证蛋白定位变化；开发经Bsn基因敲除小鼠验证的BSN酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），定量EAE小鼠不同组织及体液、MS患者脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）和血清中的BSN水平；纳入横断面观察性队列（含对照组、复发缓解型MS（relapsing-remitting MS, RRMS）、继发性进行性MS（secondary progressive MS, SPMS）、原发性进行性MS（primary progressive MS, PPMS）患者）及独立纵向PPMS队列，采用线性混合效应模型等统计方法分析BSN水平与疾病特征、其他生物标志物的关联。
研究结果分为四个部分：
第一部分为“突触BSN在EAE和MS中减少”。研究人员聚焦皮层区域，通过标记定量质谱分析急性EAE小鼠皮层突触神经小体，发现突触前蛋白BSN、兴奋性突触后支架蛋白棕榈酰膜蛋白2（palmitoylated membrane protein 2, MPP2）、抑制性突触后黏附分子神经连接素2（neuroligin-2, NLGN2）等突触蛋白丰度显著降低，同时干扰素应答相关炎症蛋白信号转导与激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1, STAT1）、免疫相关GTP酶家族M成员1（immunity-related GTPase family M member 1, IRGM1）表达上调；免疫组织化学验证显示EAE小鼠皮层BSN和突触后标记物Homer1阳性斑点显著减少，突触密度降低，且EAE和MS患者死后皮层组织中BSN阳性突触同样显著减少；此外EAE小鼠脊髓运动神经元突触部位BSN减少，而胞体内BSN累积，慢性期部分恢复，证实EAE和MS中同时存在突触BSN丢失和胞体BSN累积的现象。
第二部分为“BSN在急性和慢性EAE小鼠血浆中升高”。研究人员首先验证了所开发ELISA的特异性：野生型小鼠皮层裂解液可检测到强BSN信号，而Bsn?/?小鼠皮层无信号，且重组BSN肽呈浓度依赖性反应，批内和批间变异系数分别为13.8%和22.5%，检测限为0.14相对单位。随后检测发现，EAE小鼠皮层BSN水平从健康对照到急性期再到慢性期逐步降低，未恢复的慢性EAE小鼠脊髓BSN水平显著降低；血浆检测显示急性和慢性EAE小鼠血浆BSN水平显著高于对照组，该结果在两个独立队列中得到重复验证，表明血浆BSN动态变化可反映皮层突触丢失。
第三部分为“BSN在MS患者CSF和血清中升高”。横断面队列分析显示，所有受试者CSF样本均可检测到BSN，RRMS和PPMS患者CSF BSN水平显著高于对照组，调整年龄、性别、扩展残疾状态量表（Expanded Disability Status Scale, EDSS）评分等协变量后该差异仍存在；血清检测中28%的样本低于检测限，设定为0后分析显示，SPMS和PPMS患者血清BSN（sBSN）水平显著高于对照组，RRMS与对照组无显著差异，且sBSN水平与年龄正相关，无性别差异。
第四部分为“sBSN在临床稳定的PPMS队列中无变化”。对26例PPMS患者平均随访37个月的纵向分析显示，各时间点PPMS患者sBSN水平均显著高于匹配对照组，但sBSN随时间无显著变化；同期扩展残疾状态量表（EDSS）评分显著进展，皮质体积保持稳定，血清神经丝轻链（sNfL）也无显著纵向变化，且sBSN与sNfL无相关性，提示两者反映MS中不同的神经退行性变维度。
讨论部分指出，本研究首次证实BSN可作为跨MS疾病阶段的突触病理体液生物标志物，与既往SV2A-PET显示的突触丢失结果一致，且BSN与NfL、GFAP反映的病理机制互补。研究也存在局限性：当前ELISA灵敏度有限，无法计算绝对浓度，低浓度样本检测率不足，后续需转换至高灵敏度平台如核酸偶联免疫夹心测定（Nucleic Acid Linked Immuno-Sandwich Assay, NULISA）或单分子阵列（Single Molecule Array, SiMOA），并开发全长重组BSN校准品以实现绝对定量；未在同一受试者中同步检测CSF和血清BSN，也未将其与突触PET成像直接关联，未来需通过多中心纵向研究验证其预测疾病进展的价值，还可将BSN整合至复合突触生物标志物 panel 中，优化MS神经病理评估体系。
最终研究结论为：突触前蛋白BSN可在血浆和CSF中定量以评估突触病理，其在MS最早疾病阶段即可检测到升高并在进行性MS中持续存在，凸显MS中存在持续的神经退行性变；检测突触蛋白可补充现有神经元损伤生物标志物，加深对MS神经退行性变的理解。
