磷酸盐通过调节金属的生物利用度和细胞内的防御机制，减轻了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中对铁和锌的毒性作用

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Phosphate mitigates iron and zinc toxicity in Saccharomyces cerevisiae by modulating metal bioavailability and intracellular defense mechanisms

　　苏宾达·塔蒂普·卢安卡姆乔恩（Supinda Tatip Luangkamchorn）、阿蒂德塔亚·基乔查苏库尔（Atidtaya Kitchotsakul）、塔姆·乌多姆卡纳拉特（Tham Udomkanarat）、塔纳拉特·萨恩里特（Thanarat Saenrit）、兴介·霍诺（Kyosuke Hono）、基蒂昆·克尔德松邦（Kittikhun Kerdsomboon）、乔旺·奥苏卡雷（Choowong Auesukaree）
分析科学与国家兴奋剂检测研究所，玛希隆大学，曼谷10400，泰国

**摘要**
磷酸盐是一种必需的营养素，在细胞代谢中起着关键作用；然而，其在金属解毒中的作用尚未完全明了。本文研究了细胞外和细胞内磷酸盐在真核生物模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中对铁和锌过载的保护作用。添加磷酸盐显著提高了酵母在铁和锌压力下的生长，且这种保护作用并非源于细胞内金属积累的显著减少。相反，富含磷酸盐的条件显著抑制了金属诱导的活性氧（ROS）的生成，从而降低了抗氧化酶（特别是锰超氧化物歧化酶）的活性。这些发现表明磷酸盐的作用在于缓解细胞内的氧化应激，而不仅仅是限制金属的吸收。基因表达分析进一步表明，在金属过载条件下，磷酸盐的可用性减弱了参与金属螯合的基因（尤其是CCC1、ZRC1和YCF1）的转录诱导。使用磷酸盐转运缺陷突变体（如Δpho84Δpho87Δpho90）的研究表明，细胞内磷酸盐对于耐受铁和锌压力也至关重要。傅里叶变换红外光谱学提供了证据，表明细胞外和细胞内的磷酸盐可能以焦磷酸或多磷酸的形式与铁和锌结合，形成金属-磷酸盐复合物。总体而言，我们的发现揭示了磷酸盐通过协调细胞外和细胞内机制来减轻铁和锌的毒性，通过调节金属的生物可利用性和氧化应激，强调了其在维持细胞金属稳态中的作用。

**1. 引言**
环境中的重金属污染已成为一个严重的全球性问题，这主要是由于许多国家的经济和工业快速增长所致。虽然重金属被广泛用于各种工业应用，但不当的废物管理仍然是它们在土壤和水资源中积累的主要原因（Tchounwou等，2012）。接触重金属可能导致严重的健康问题，如神经系统疾病、呼吸系统问题和多种类型的癌症。此外，重金属还会通过影响有机污染物的生物降解性而破坏生态系统，导致长期的环境污染（Fulke等，2024）。然而，某些重金属（如铁和锌）是必需的营养素，它们在许多蛋白质中作为结构和催化辅因子。例如，铁作为血红素中的氧化还原辅因子，并是细胞色素c和乌头酸酶等蛋白质中含铁硫簇的关键组成部分。此外，铁还在多种生物过程中发挥关键作用，包括呼吸作用、DNA复制、翻译和脂质生物合成（Galy等，2024）。类似地，锌也在几种酶（如酒精脱氢酶、碳酸酐酶和羧肽酶）中作为催化辅因子。此外，锌还在含有锌依赖性DNA结合基序的转录因子（如锌指和锌簇）中作为结构辅因子（Chen等，2024）。尽管它们具有必需性，但过量的铁和锌仍可能具有细胞毒性。特别是亚铁离子（Fe2+）可以通过与H2O2反应催化芬顿反应（Fenton reaction），生成羟基自由基，从而对核酸、蛋白质和脂质等生物分子造成氧化损伤（Kontoghiorghes，2023）。尽管锌本身不具有氧化还原活性，不会直接参与芬顿反应，但过量的锌可以通过破坏细胞氧化还原平衡和金属稳态间接促进活性氧（ROS）的生成（Schoofs等，2024）。此外，过多的金属离子可能会不恰当地与细胞内配体结合，或与其他金属离子竞争酶和转运蛋白的活性位点（Jomova和Valko，2011）。为了减轻金属毒性，细胞进化出了多种防御机制，包括减少金属吸收、激活金属排出、将金属隔离在液泡等细胞内区室中，以及使用金属结合分子（如谷胱甘肽、甲硫氨酸和植物螯蛋白）进行螯合（Wysocki和Tamás，2010）。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为一种真核模式生物被广泛用于研究细胞对金属毒性的防御机制。在S. cerevisiae中，有多种机制参与减轻过量的锌毒性，包括通过内吞作用减少锌的吸收和使血浆膜高亲和力锌转运蛋白Zrt1p失活（Gitan等，1998），以及通过液泡锌转运蛋白Zrc1p和Cot1p将锌隔离在液泡中（MacDiarmid等，2002；Simm等，2007）。同样，应对铁过载时，酵母细胞通过液泡铁转运蛋白Ccc1p促进铁的液泡隔离（Li和Ward，2018）。先前的研究表明，液泡中的铁、铜、锌和锰以低分子量多磷酸复合物的形式存在（Nguyen等，2019），而缺乏液泡多磷酸积累的酵母突变体对锌表现出过度敏感（Pagani等，2007；Zhao等，2020）。因此，细胞内磷酸盐可能在通过形成金属-磷酸盐复合物来减少金属的生物可利用性方面发挥重要作用，从而防止铁和锌的毒性。然而，细胞内磷酸盐在细胞防御铁和锌过载中的确切作用仍不清楚。

磷酸盐是一种在从细菌到哺乳动物的各种生物体中都存在的基本无机分子。在细胞内，它以多种形式存在，包括正磷酸盐、焦磷酸盐和多磷酸盐（Peacock，2021）。这些磷酸盐分子在多种生物过程中发挥着关键作用，如能量代谢（例如ATP）、信号转导（例如cAMP）和酶调控（例如磷酸化），同时也作为核酸和磷脂的结构成分（Wagner，2024）。除了其基本的代谢功能外，磷酸盐还可以与二价和多价金属阳离子强烈相互作用，通常形成不溶性的金属-磷酸盐复合物，从而降低金属在环境系统中的移动性和生物可利用性。例如，之前已有报道指出磷酸盐可以在土壤中沉淀镉（Francisco等，2011）和在Ochrobactrum tritici中沉淀铬（Hong等，2014）。此外，还显示出铁可以在氧化条件下形成不溶性的磷酸盐复合物，如铁磷酸盐（FePO4），尤其是在Fe2+被氧化为Fe3+的情况下（Seguin等，2011）。这些观察结果突显了磷酸盐在化学调节金属毒性方面的能力。在细胞水平上，已有报道指出多磷酸盐在几种微生物（如大肠杆菌、Cryptococcus humicola和Sulfolobus metallicus）中的金属抗性中的作用（Andreeva等，2014；Keasling和Hupf，1996；Remonsellez等，2006）。此外，通过基因工程增强多磷酸盐生物合成途径可以提高金属抗性（Keasling等，1998；Nagata等，2008）。除了多磷酸盐外，其他形式的磷酸盐也可能通过其负电荷与金属离子的正电荷相互作用来保护细胞免受金属毒性。然而，细胞外和细胞内磷酸盐的可用性在调节S. cerevisiae中铁和锌毒性方面的作用仍不清楚。

在这项研究中，我们探讨了细胞外和细胞内磷酸盐的可用性如何影响真核生物模式生物S. cerevisiae对铁和锌过载的细胞反应。具体来说，我们检查了细胞外和细胞内磷酸盐的可用性是否影响金属积累、氧化应激水平、抗氧化防御机制以及金属响应基因的表达。

**2. 材料与方法**
2.1. 酵母菌株和生长条件
本研究中使用的S. cerevisiae菌株列于表1中。所使用的培养基包括YPDA培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和0.04%腺嘌呤）、合成定义（SD）培养基（0.67%酵母氮源（YNB）不含氨基酸、2%葡萄糖和适当的营养物质），以及合成磷酸盐（SP）培养基（使用不含氨基酸和磷酸盐的YNB制备的SD培养基（ForMedium，CYN0804）（Auesukaree等，2003；Kerdsomboon等，2022）。磷酸盐以KH2PO4的形式以指定浓度（0、1、10和100 mM）添加到SP培养基中。为了维持钾水平，添加了适量的KCl代替KH2PO4。培养基的pH值调整为5.5，对于固体培养基，则添加了2%琼脂。培养温度为30°C。

**2.2. 使用点测定法进行细胞生长评估**
点敏感性测定法按照之前的方法进行（Kerdsomboon等，2022），以评估在指定条件下的酵母生长。为了检查细胞外磷酸盐对铁或锌过载的保护作用，将野生型（NBW7）细胞在YPDA培养基中预培养至对数中期。然后收获细胞，调整光密度OD600为1.0（约1×10^7个细胞/mL），并进行10倍系列稀释。将每种稀释液（3 μL）点在添加了KH2PO4（0、1、10或100 mM）的SP琼脂板上，并在FeSO4（0、10、15或20 mM）或ZnCl2（0、20、25或30 mM）存在下进行培养。为了评估细胞内磷酸盐对铁或锌过载的耐受性，将野生型、Δpho84、Δpho87Δpho90和Δpho84Δpho87Δpho90细胞在SD培养基中预培养至对数中期。收获细胞，调整OD600为1.0，并按上述方法进行系列稀释。同样，将每种稀释液（3 μL）点在含有0或10 mM KH2PO4的SP琼脂板上，并在有或没有1 mM FeSO4或10 mM ZnCl2的情况下进行培养。平板在30°C下培养2天后进行生长评估。

**2.3. 沉淀物和细胞提取物中的磷酸盐定量**
磷酸盐的提取和定量按照之前的方法进行，但作了一些修改（Kerdsomboon等，2022；Rosenfeld等，2010）。为了测定金属-磷酸盐沉淀物中的磷酸盐含量，将添加了0、1、10或100 mM KH2PO4的SP培养基与10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2混合，在30°C下培养16小时。所得沉淀物通过3000×g离心5分钟并冷冻干燥脱水。冻干的沉淀物在使用前在5 mL 1 N H2SO4中煮沸10分钟。对于细胞内磷酸盐的测定，将野生型和Δpho84Δpho87Δpho90细胞在含有0或10 mM KH2PO4的SP肉汤中培养16小时，在有或没有1 mM FeSO4或10 mM ZnCl2的情况下收获，并重新悬浮在500 μL Triton X-100中。细胞在4°C下用玻璃珠匀浆器裂解15分钟。上清液通过13000×g离心10分钟后用于磷酸盐定量。对于测定，将每种样品（细胞外沉淀物或细胞提取物）100 μL与86 μL 28 mM铵七钼酸和2.1 M H2SO4及64 μL 0.76 mM孔雀石绿在0.35%聚乙醇中混合。在595 nm处测量每个样品的吸光度（A595），并根据标准校准曲线（0–100 μM）计算磷酸盐浓度。

**2.4. 沉淀物和细胞提取物中金属含量的测定**
沉淀物和细胞提取物中的总铁和锌含量按照之前的方法通过火焰原子吸收光谱法测定（Kerdsomboon等，2016）。简要来说，按照第2.3节描述的方法制备的金属-磷酸盐沉淀物和酵母细胞提取物重新悬浮在10%硝酸中，在160°C下消化2小时。消化后的样品通过Whatman No. 41滤纸过滤，然后使用火焰原子吸收光谱仪（Varian SpectrAA 55B）测定铁和锌的浓度。

**2.5. 细胞外和细胞内金属-磷酸盐复合物的表征**
按照第2.3节描述的方法制备的细胞外沉淀物和酵母细胞提取物通过冷冻干燥脱水。使用红外光谱法分析了两种样品类型中铁-磷酸盐和锌-磷酸盐复合物的形成（Kerdsomboon等，2021）。使用Shimadzu Prestige-21光谱仪在400–4000 cm^-1范围内记录傅里叶变换红外光谱（FTIR）数据，使用KBr颗粒，分辨率为4 cm^-1。

**2.6. 细胞内ROS的测定**
细胞内ROS水平使用荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二醋酸盐（DCFH-DA；Sigma）进行定量，方法按照之前的描述（Rattanawong等，2015）。简要来说，将野生型（NBW7）细胞在YPDA培养基中预培养至对数中期，然后接种到含有0或10 mM KH2PO4的SP肉汤中，在有或没有10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2的情况下，在30°C下摇动16小时。然后用10 mM DCFH-DA处理细胞，并再培养1小时后再收获。细胞（约1×10^7个细胞/mL）通过3000×g离心5分钟收集，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。细胞沉淀物重新悬浮在PBS中，并用玻璃珠剧烈摇晃以裂解细胞。在4°C下以12,000×g离心10分钟后，使用上清液进行荧光测量。DCF荧光使用微孔板读数器（Tecan Spark 10M）记录，激发波长为490 nm，发射波长为524 nm。荧光强度根据每个样本中的总蛋白浓度进行标准化，并表示为相对DCF荧光单位。

2.7. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
SOD活性的测定方法如前所述（Burphan等人，2018年）。简要来说，将野生型（NBW7）细胞在YPDA培养基中预培养至对数中期，然后接种到含有0或10 mM KH2PO4的SP肉汤中，同时加入或不加入10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2，30°C下摇动培养16小时。然后以3000×g离心5分钟收集细胞（约1×10^7个细胞/mL），用PBS洗涤，并重新悬浮在含有10 mM NaHPO4（pH 7.8）、5 mM EDTA、5 mM EGTA、0.1% Triton X-100、50 mM NaCl、300 mM 山梨醇、0.5 mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中。在4°C下用玻璃珠剧烈摇晃15分钟进行细胞破除。所得细胞裂解液进行天然聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用硝基蓝四唑（NBT）染色以可视化SOD活性条带。使用ImageJ软件（NIH，美国）量化条带强度。

2.8. 过氧化氢酶活性测定
过氧化氢酶活性的测定方法如前所述（Burphan等人，2018年）。简要来说，将野生型（NBW7）细胞在YPDA培养基中预培养至对数中期，然后接种到含有0或10 mM KH2PO4的SP肉汤中，同时加入或不加入10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2，30°C下摇动培养16小时。然后以3000×g离心5分钟收集细胞（约1×10^7个细胞/mL），用PBS洗涤，并重新悬浮在含有100 mM磷酸钾（KPi）缓冲液（pH 7.0）中，该缓冲液还添加了0.1 mM PMSF。在4°C下用珠子破坏细胞15分钟。将细胞提取物用于酶活性测定。对于活性测定，将每个裂解液中的10–50 μg总蛋白加入1 mL新鲜制备的20 mM H2O2中（在50 mM KPi缓冲液中）。每30秒记录一次240 nm处的吸光度下降，该吸光度下降对应于H2O2的分解（ε240 = 43.6 M^-1 cm^-1），持续2分钟。一个单位的过氧化氢酶活性定义为在测定条件下每分钟降解1 μmol H2O2所需的酶量。

2.9. RNA分离和定量实时逆转录PCR（qRT-PCR）
总RNA提取和qRT-PCR的方法如前所述（Techo等人，2020年）。简要来说，将野生型（NBW7）细胞在YPDA培养基中预培养至对数中期，然后接种到含有0或10 mM KH2PO4的SP肉汤中，同时加入或不加入10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2，30°C下摇动培养16小时。根据制造商的说明使用FavorPrep Tissue Total RNA Purification Mini Kit（Favorgen）分离总RNA。1微克纯化的RNA使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）逆转录为cDNA。在ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行定量PCR，使用KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒（Kapa Biosystems）和特定基因引物（200 nM；表2）。热循环条件包括初始变性95°C 3分钟，然后是40个循环，每个循环95°C 3秒和60°C 32秒。相对转录本水平使用2^-ΔΔCT方法计算，以ACT1作为内参基因。

表2. 本研究中使用的引物
目标基因 引物名称 序列
ACT1 ACT1-458F 5’-TGGATTCCGGTGATGGTGTT-3’
ACT1–529R 5’-TCAAAATGGCGTGAGGTAGAGA-3’
CCC1-qRT-F 5’-CCATTGTAGCACTAAAGAACGCAG-3’
CCC1-qRT-R 5’-CAACTCTGAGGTTCCACCACTAC-3’
FTR1 FTR1-qRT-F 5’-TTCGTTGTGTTCAGAGAGTGC-3’
FTR1-qRT-R 5’-CACCGACCCAAACCTGAATCCT-3’
VTC4 VTC4-qRT-F 5’-CGGGAAAGACGATATGTGTGCC-3’
VTC4-qRT-R 5’-GACACCGCCCAACAATATCGAG-3’
YCF1 YCF1-qRT-F 5’-CTCCTGAAGGGTTTGGACCTATATC-3’
YCF1-qRT-R 5’-GATCACACGGTCGATGAAGCA-3’
ZRC1 ZRC1-qRT-F 5’-TCTTCCGCTCTGCCCTTATCAC-3’
ZRC1-qRT-R 5’-AAGTCATGGACCGCTATCACGC-3’
ZRT1 ZRT1-qRT-F 5’-TAATGGACCCTGCTTATGGTGCGA-3’

2.10. 统计分析
所有实验至少独立进行三次生物学重复。实验数据以平均值±标准差（SD）表示。使用Student's t检验分析均值之间的差异。方差分析使用单因素和/或双因素ANOVA以及最小显著差异（LSD）方法进行，使用SPSS统计软件包（版本18.0，SPSS Inc.）。统计显著性设定为P < 0.05。

3. 结果
3.1. 细胞外磷酸盐以剂量依赖的方式降低铁和锌过载的毒性
为了确定细胞外磷酸盐的可用性是否影响铁和锌过载的毒性，我们检测了野生型S. cerevisiae菌株（NBW7）在含有0、1、10或100 mM KH2PO4的SP琼脂平板上的生长情况，这些平板中不加入或加入10–20 mM FeSO4（作为Fe2+的来源）或20–30 mM ZnCl2（作为Zn2+的来源）。在磷酸盐缺乏条件下（0 mM KH2PO4），高浓度的FeSO4和ZnCl2显著抑制了酵母生长（图1A和B）。随着磷酸盐浓度的增加，在两种金属胁迫条件下生长逐渐恢复（图1A和B）。这些结果表明，磷酸盐的可用性减轻了S. cerevisiae中铁和锌的毒性。

3.2. 细胞外磷酸盐通过金属-磷酸盐沉淀降低铁和锌的生物可利用性
为了确定细胞外磷酸盐是否促进培养基中的金属-磷酸盐沉淀，我们首先使用孔雀石绿测定法确认了细胞外磷酸盐浓度。结果显示培养基中的磷酸盐水平与添加的量一致（图2A）。然后我们在含有10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2的培养基中监测了随着磷酸盐浓度增加而形成的沉淀物，并发现可见沉淀物逐渐增加（图2B）。

3.3. FTIR光谱确认沉淀物中形成了铁-磷酸盐和锌-磷酸盐复合物
为了确认培养基中形成了金属-磷酸盐复合物，我们对含有10 mM KH2PO4的培养基进行了FTIR分析，这些培养基中不加入或加入10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2。纯磷酸盐的FTIR光谱在618 cm^-1处显示一个峰，对应于PO4基团的不对称弯曲（O–P–O）振动，表明存在游离磷酸盐（图3A）。相比之下，含有FeSO4或ZnCl2的培养基显示出额外的峰，分别位于1033、1077、1111和1401 cm^-1（图3A），这些峰归因于PO4基团的P=O伸缩振动（Francisco等人，2011年）。这些光谱变化表明培养基中形成了铁-磷酸盐和锌-磷酸盐复合物。

3.4. 在磷酸盐存在下铁和锌在细胞内的积累
由于观察到在磷酸盐存在下铁和锌发生了细胞外沉淀，我们接下来检测了细胞外磷酸盐是否降低了这些金属的细胞内吸收生物可利用性，从而影响其细胞内积累。为了验证这一假设，我们测量了在含有0–100 mM KH2PO4的培养基中生长的酵母细胞内的总铁和锌水平，这些培养基中同时加入10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2。有趣的是，尽管铁过载对酵母生长的抑制作用在磷酸盐浓度为1 mM或更高时有所缓解（图1A），但只有100 mM磷酸盐显著降低了细胞内铁的水平，而1 mM和10 mM磷酸盐的影响很小（图4A）。此外，与我们的预期相反，尽管观察到磷酸盐处理后酵母生长有所改善（图1B），细胞内锌的水平却随着磷酸盐浓度的增加而增加（图4B）。这些发现表明，磷酸盐介导的保护作用可能不仅通过降低细胞外金属的生物可利用性来实现，还可能通过其他途径，包括调节细胞防御系统、改变细胞内区室化和形成细胞内金属-磷酸盐复合物。

3.5. 磷酸盐补充减少铁和锌引起的细胞内ROS积累
由于已知铁和锌过载的毒性与细胞内生物可利用金属的积累增加有关，并且这种积累会促进ROS的产生和氧化应激，我们接下来研究了细胞外磷酸盐是否通过降低这些金属的细胞内生物可利用性来抑制细胞内ROS的积累。在含有0或10 mM KH2PO4的SP培养基中生长的酵母细胞中测量了细胞内ROS水平，这些培养基中同时加入或不加入10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2。正如预期的那样，在两种磷酸盐条件下（0或10 mM KH2PO4），铁或锌过载显著增加了细胞内ROS水平（图5A）。重要的是，尽管铁和锌过载的毒性降低不能完全通过细胞内总金属积累的变化来解释（图4A和B），但在富含磷酸盐的条件下生长的细胞（10 mM KH2PO4）的ROS水平显著低于在缺乏磷酸盐的条件下生长的细胞（0 mM KH2PO4）（图5A）。这些结果表明，磷酸盐补充可以独立于细胞内总金属积累的程度来抑制金属诱导的活性氧（ROS）的产生。此外，铁过载诱导的ROS水平显著高于锌过载，特别是在磷酸盐缺乏的条件下（图5A），这可能是由于铁通过芬顿反应表现出强促氧化活性。总体而言，这些发现表明磷酸盐补充可以缓解金属诱导的氧化应激，可能是通过调节细胞内金属的生物利用度或细胞应激反应来实现的，而不仅仅是通过限制总金属的摄入。

图5. 磷酸盐可用性对铁和锌过载条件下ROS水平及抗氧化酶活性的影响。对数生长期的野生型（NBW7）细胞在含有0或10 mM KH2PO4的SP培养基中培养，分别在无（白色条）或存在10 mM FeSO4（灰色条）或20 mM ZnCl2（黑色条）的情况下，于30°C下培养16小时。(A) 使用DCFH-DA测定法测量细胞内ROS水平。每个样本的DCF荧光强度均以在磷酸盐充足条件下生长的未处理野生型细胞的荧光强度为基准进行归一化，并表示为相对DCF荧光。(B) 通过Native凝胶电泳后进行NBT染色来分析Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性。使用ImageJ软件对SOD活性条进行定量。(C) 通过在240 nm处监测H2O2的分解来光度法测定过氧化氢酶活性。数据代表至少三次独立实验的平均值±标准差。不同上标字母的值表示在P < 0.05时具有统计学显著差异。

3.6. 磷酸盐可用性调节抗氧化酶活性
由于磷酸盐补充显著减少了铁和锌应激下的细胞内ROS积累（图5A），我们接下来研究了这些变化是否与抗氧化防御系统的改变有关。为此，测量了在磷酸盐缺乏（0 mM Pi）或磷酸盐充足（10 mM Pi）条件下生长的酵母细胞中Cu,Zn超氧化物歧化酶（Cu,Zn-SOD）、Mn超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和过氧化氢酶（catalase）的活性，同时考虑了是否存在10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2。在没有金属应激的情况下，磷酸盐缺乏条件下生长的细胞的Mn-SOD和过氧化氢酶活性显著高于磷酸盐充足条件下的细胞（图5B和C），这表明磷酸盐限制本身与基线氧化状态的升高有关。在磷酸盐缺乏条件下，铁过载导致过氧化氢酶活性显著增加，而Cu,Zn-SOD活性仅有轻微增加（图5B和C），这表明抗氧化防御系统对铁诱导的氧化应激有所激活。相比之下，锰超氧化物歧化酶活性在铁应激下没有增加，并且在磷酸盐充足条件下低于磷酸盐缺乏条件下的活性（图5B）。对锌过载的反应中，我们发现锰超氧化物歧化酶活性在两种磷酸盐条件下都降低了，而过氧化氢酶活性仅在磷酸盐缺乏条件下降低（图5B和C），这表明锌应激可能会损害特定的抗氧化酶活性，尤其是在磷酸盐限制的情况下。然而，在磷酸盐充足条件下，锌暴露导致过氧化氢酶活性显著增加（图5C）。尽管个别抗氧化酶的反应取决于金属应激的类型和磷酸盐的可用性，但在磷酸盐缺乏条件下抗氧化活性通常更为明显，这与这些细胞中观察到的ROS水平升高一致。总之，这些发现支持了磷酸盐可用性可以缓解金属诱导的氧化应激的观点，从而减少了对强烈激活抗氧化防御系统的需求，而不是直接增强内在的抗氧化能力。

3.7. 磷酸盐可用性调节铁和锌过载期间的金属稳态和解毒基因表达
为了进一步阐明磷酸盐介导的金属毒性保护的分子基础，我们在磷酸盐缺乏（0 mM Pi）或磷酸盐充足（10 mM Pi）条件下培养16小时后，分析了参与铁和锌转运及液泡隔离的基因的表达，同时考虑了是否存在10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2。检测的基因包括FTR1和ZRT1，它们分别编码高亲和力的质膜铁和锌转运蛋白；CCC1和ZRC1，它们编码负责金属隔离的液泡铁和锌转运蛋白；以及YCF1，它编码一种液泡谷胱甘肽S-结合转运蛋白，通过将金属-谷胱甘肽复合物隔离到液泡中来参与重金属的解毒，特别是镉。

正如预期的那样，无论磷酸盐的可用性如何，铁和锌过载都会强烈抑制FTR1和ZRT1的表达（图6A和B），这与在细胞内金属过量条件下限制进一步金属摄入的反馈调节一致。有趣的是，铁过载还会轻微降低ZRT1的表达，而锌过载则适度降低FTR1的表达（图6A和B），这表明铁和锌转运系统之间存在部分交叉调节。另一方面，铁过载在磷酸盐缺乏条件下显著诱导CCC1的表达，而在磷酸盐充足条件下仅略微增加其表达（图6C），这表明在细胞内铁水平升高时，特别是磷酸盐限制时，液泡的铁隔离能力增强。然而，锌过载并没有显著诱导ZRC1的表达，但在铁过载条件下反而显著上调了其表达（图6D）。此外，YCF1的表达在磷酸盐缺乏条件下对铁过载有强烈上调反应，而在磷酸盐充足条件下仅略有增加（图6E）。相比之下，锌过载在两种磷酸盐条件下都导致YCF1表达下调（图6E），这表明液泡谷胱甘肽S-结合转运蛋白Ycf1p在铁和锌应激中起着不同的作用。

图6. 磷酸盐可用性调节铁和锌过载期间的金属稳态和解毒基因表达。对数生长期的野生型（NBW7）细胞在含有0或10 mM KH2PO4的SP培养基中培养，分别在无（白色条）或存在10 mM FeSO4（灰色条）或20 mM ZnCl2（黑色条）的情况下，于30°C下培养16小时。培养后，收集细胞并使用定量实时RT-PCR测定(A) FTR1、(B) CCC1、(C) ZRT1、(D) ZRC1、(E) YCF1和(F) VTC1基因的转录水平。这些基因的mRNA水平以同一样本中的ACT1基因为基准进行归一化，并表示为相对于对照条件（10 mM Pi，无金属）的相对表达。数据以至少三次独立实验的平均值±标准差表示。不同上标字母的值表示在P < 0.05时具有统计学显著差异。

这些结果总体上表明，酵母细胞通过抑制高亲和力的金属摄取系统和激活液泡隔离途径来应对铁和锌过载，且在磷酸盐缺乏条件下通常观察到更强的转录反应。这些发现进一步支持了磷酸盐可用性调节细胞内金属应激的观点，可能是通过影响金属的生物利用度而不是总金属积累。

3.8. 细胞内磷酸盐对铁和锌过载的保护作用
基于上述结果，我们假设细胞内磷酸盐除了细胞外磷酸盐外，也可能有助于减轻金属毒性。为了研究细胞内磷酸盐的作用，我们检查了磷酸盐转运蛋白缺陷的酵母突变体，这些突变体之前的研究显示其细胞内磷酸盐水平低于野生型菌株（Auesukaree等人，2003年；Kerdsomboon等人，2022年）。这些突变体包括Δpho84突变体（缺乏高亲和力转运蛋白）、Δpho87Δpho90突变体（缺乏低亲和力转运蛋白）和Δpho84Δpho87Δpho90突变体（缺乏两种磷酸盐转运系统）。当在含有0或10 mM KH2PO4的SP琼脂上培养时，无论是否添加1 mM FeSO4或10 mM ZnCl2，Δpho84和Δpho84Δpho87Δpho90突变体在磷酸盐缺乏条件下对铁和锌过载表现出明显的敏感性，而磷酸盐补充显著恢复了它们的生长（图7A）。这些发现支持了细胞内磷酸盐也参与保护酵母细胞免受铁和锌毒性的观点。

图7. 细胞内磷酸盐对铁和锌过载的保护作用。(A) 野生型（NBW7）、Δpho84、Δpho87Δpho90和Δpho84Δpho87Δpho90细胞在YPDA培养基中生长至对数期，从初始OD600为1.0开始连续稀释10倍。取等量样品（3 μL）点涂在含有0或10 mM KH2PO4的SP琼脂平板上（分别表示为-Pi和+Pi），并在无或存在1 mM FeSO4或10 mM ZnCl2的情况下培养2天。(B) 对数生长期的野生型（NBW7）和Δpho84Δpho87Δpho90（表示为Δ84Δ87Δ90）细胞在含有0或10 mM KH2PO4的SP培养基中培养（分别表示为-Pi和+Pi），分别在无（白色条）或存在1 mM FeSO4（灰色条）或10 mM ZnCl2（黑色条）的情况下，于30°C下培养16小时。使用孔雀石绿测定法量化细胞内磷酸盐水平。(C) 通过火焰原子吸收光谱法测量细胞内铁和锌的含量。数据代表三次独立重复实验的平均值±标准差。不同上标字母的值表示在P < 0.05时具有统计学显著差异。

为了确定这种生长恢复是否与细胞内磷酸盐水平有关，我们接下来测量了野生型菌株和Δpho84Δpho87Δpho90突变体在含有0或10 mM KH2PO4的SP培养基中培养时的磷酸盐含量，无论是否添加1 mM FeSO4或10 mM ZnCl2。由于Δpho84Δpho87Δpho90突变体无法在10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2条件下生长，因此本实验中使用的FeSO4和ZnCl2浓度低于图4中的实验。磷酸盐补充显著增加了野生型菌株的细胞内磷酸盐水平（大约增加100-120倍），而在 triple 突变体中，即使补充磷酸盐后，细胞内磷酸盐水平仍然极低（图7B）。尽管如此，在磷酸盐充足条件下生长的 triple 突变体的细胞内磷酸盐水平略有但可测量的增加，尽管仍显著低于野生型菌株（图7B）。为了进一步澄清这一点，在磷酸盐缺乏（0 mM Pi）和磷酸盐充足（10 mM Pi）条件下培养后，测量了两种菌株的细胞内铁和锌含量，并考虑了是否存在1 mM FeSO4或10 mM ZnCl2（图7C）。我们发现，两种菌株在磷酸盐充足条件下都积累了更高的细胞内铁和锌水平，这表明磷酸盐转运蛋白突变体在磷酸盐补充下的生长改善并不是由于总金属积累减少所致。这些发现表明，即使在Δpho84Δpho87Δpho90突变体中细胞内磷酸盐水平仅有轻微增加，也可能足以解毒铁和锌过载，可能是通过细胞内金属-磷酸盐复合物的形成。或者，磷酸盐介导的保护可能涉及超出直接金属络合的额外机制。由于已经证明多磷酸盐有助于提高金属抗性，可能通过其螯合能力，我们接下来测定了在磷酸盐缺乏（0 mM Pi）或磷酸盐充足（10 mM Pi）条件下培养16小时后VTC4的表达，同时考虑了是否存在10 mM FeSO4或20 mM ZnCl2。无论是否补充金属，VTC4在磷酸盐缺乏条件下表达均升高，而在磷酸盐充足条件下其表达显著降低（图6F）。这些结果表明，在磷酸盐限制条件下，VTC4表达的增加可能与多磷酸盐生物合成的增强有关，这可能有助于提高酵母细胞的金属螯合能力。

3.9. 铁和锌与磷酸盐在细胞内的复合
尽管细胞内磷酸盐在金属解毒中的确切作用尚不清楚，我们接下来研究了铁和锌是否可以在酵母细胞内与磷酸盐形成复合物。为此，我们对用10 mM KH2PO4处理过的酵母野生型细胞提取物进行了FTIR分析，同时考虑了是否存在1 mM FeSO4或10 mM ZnCl2。在未处理的细胞中，FTIR光谱中观察到两个主要峰：一个位于大约616 cm?1，对应于PO4基团的不对称O–P–O弯曲振动，代表游离磷酸盐；另一个位于大约1106 cm?1，对应于游离磷酸盐、多磷酸盐或焦磷酸盐的P–O不对称伸缩模式（Francisco等人，2011年）。在FeSO4或ZnCl2处理后，616 cm?1峰不再可检测到，而1106 cm?1峰移动到大约987–1073 cm?1（图3B），这是焦磷酸盐和多磷酸盐的特征区域（Francisco等人，2011年）。这些光谱变化表明，在磷酸盐充足条件下，细胞内的磷酸盐（可能以焦磷酸盐或多磷酸盐的形式）可能与铁和锌相互作用形成金属-磷酸盐复合物。这样的相互作用可能有助于减轻酵母细胞中的铁和锌毒性。

4. 讨论
铁和锌是必需的微量营养素，作为酶的辅因子和蛋白质的结构成分（Chen等人，2024年；Galy等人，2024年）。然而，当这些金属以过高的浓度存在时，它们会破坏细胞内的稳态并引起毒性，主要是由于氧化还原失衡和氧化应激。为了对抗这种毒性，包括酿酒酵母（S. cerevisiae）在内的真核生物演化出了多种防御机制，如金属隔离、转运蛋白调控以及由谷胱甘肽和植酸螯合素等分子介导的螯合作用（Wysocki和Tamás，2010年）。尽管这些机制已经得到了广泛研究，但磷酸盐作为一种普遍存在且代谢上至关重要的分子，在减轻金属毒性方面的作用仍不够明确，尤其是在其对金属生物利用度和细胞内氧化应激的影响方面。因此，阐明磷酸盐的可用性如何影响金属毒性对于理解生物系统和环境系统中的金属-营养素相互作用非常重要。

在这项研究中，我们系统地探讨了细胞外和细胞内磷酸盐在缓解酿酒酵母中铁和锌毒性方面的保护作用。磷酸盐的补充显著提高了酵母在铁和锌胁迫条件下的生长，且这种生长恢复与培养基中铁和锌的沉积增加相关（图1），这表明细胞外磷酸盐可以通过形成金属-磷酸盐复合物来降低这些金属的生物利用度。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析支持了磷酸盐相关金属复合物的存在，这通过特征性的P=O伸缩峰得到了证实（图3）。这些观察结果与先前的报告一致，这些报告展示了磷酸盐在环境系统中对金属的固定作用，包括O. tritici 5vbl1对Cr(VI)的响应形成的磷酸盐纳米颗粒以及磷酸盐诱导的土壤中Cd的沉积（Francisco等人，2011年；Hong等人，2014年）。然而，对细胞内金属积累的分析揭示了一个更为复杂的情况。如果细胞外沉淀是主要的保护机制，那么预期细胞内金属水平会显著降低。实际上，只有非常高的磷酸盐浓度（100 mM）才能显著降低细胞内铁的水平（图4A），而细胞内锌的水平则随磷酸盐补充而呈剂量依赖性增加（图4B）。这些发现表明，仅靠细胞外金属-磷酸盐沉淀不足以解释所观察到的保护效果。磷酸盐似乎主要是通过改变金属的生物利用度或细胞内的处理方式来发挥作用，尤其是在锌的情况下。总的来说，这些结果表明，虽然细胞外沉淀有助于降低金属的生物利用度，但细胞内的额外机制在磷酸盐介导的金属耐受性中起着关键作用。

除了其对细胞外金属沉淀的影响外，我们的结果还显示，磷酸盐的可用性极大地影响了铁和锌过载情况下的氧化应激反应。值得注意的是，即使在细胞内金属总量没有显著减少的情况下，富含磷酸盐的条件也显著抑制了金属诱导的活性氧（ROS）的产生（图4和5A）。铁已知会引发芬顿反应及其类似反应，产生羟基自由基，从而导致生物分子的氧化损伤和氧化应激的诱导（Kontoghiorghes，2023年；Zhao，2023年）。尽管锌本身不具有氧化还原活性，但它可以通过与含硫蛋白中的巯基结合间接促进氧化应激，从而扰乱巯基的氧化还原稳态并干扰抗氧化防御和氧化还原信号通路（Hubner和Haase，2021年；Schoofs等人，2024年）。总金属积累量与ROS产生量之间的差异强烈表明，磷酸盐改变了这些金属在细胞内的生物利用度或氧化还原活性，可能是通过形成金属-磷酸盐复合物来实现的。与较低的ROS水平一致，富含磷酸盐条件下的酵母细胞表现出抗氧化防御系统的激活减少，包括金属胁迫下Mn-SOD和过氧化氢酶活性的下降（图5B和C）。这些酶通常会在氧化应激增加时上调，作为补偿性防御机制的一部分。它们在富含磷酸盐条件下的激活减少进一步支持了细胞内氧化应激得到有效缓解的观点。重要的是，抗氧化酶活性的降低可能反映了较低的氧化应激水平，而不是防御能力的减弱，因为在较少的压力条件下维持高水平的抗氧化活性可能需要大量的代谢能量（Temple等人，2005年；Thorpe等人，2004年）。

除了降低抗氧化酶活性外，磷酸盐的可用性还影响了金属响应基因的表达。我们观察到，在磷酸盐缺乏条件下，介导金属进入液泡的CCC1和YCF1基因的表达高于磷酸盐充足条件（图6B和E），这表明在磷酸盐缺乏期间对液泡金属隔离的需求增加，这可能与该条件下细胞内金属生物利用度的增加有关。与我们的发现一致，先前的研究表明，CCC1基因在铁过量时上调，以促进液泡中铁的隔离并维持细胞质中铁的稳态（Philpott等人，2012年），而YCF1基因在金属胁迫下被诱导，特别是镉暴露时，以促进液泡排毒并减少细胞质中铁的毒性（Li等人，1996年）。这些发现进一步支持了金属毒性不仅取决于总金属积累量，更重要的是取决于氧化还原活性自由金属池的可用性的观点。总的来说，我们的结果表明，磷酸盐在维持金属过载下的细胞内氧化还原稳态中起着重要作用。除了作为细胞外螯合剂外，磷酸盐还参与了协调的细胞内机制，限制ROS的产生，减少抗氧化酶的激活需求，并调节金属响应基因的表达。这种对氧化应激和转录反应的整合调节为观察到的生长保护提供了机制上的解释，而无需显著降低细胞内金属的总体积累量。

当在野生型菌株和缺乏磷酸盐转运系统的Δpho84Δpho87Δpho90突变体中检查中等金属胁迫条件（1 mM FeSO4和10 mM ZnCl2）下的细胞内铁和锌水平时，观察到了不同的模式。与之前描述的高金属条件（图4A和B）相反，这两种菌株在磷酸盐充足条件下积累了更多的细胞内金属（图7C）。尽管这一观察结果似乎与预期不符——即磷酸盐介导的保护应该伴随着细胞内金属积累的减少——但它进一步支持了磷酸盐主要不是通过限制总金属吸收来保护酵母细胞的观点。相反，增加的磷酸盐可用性可能增加了细胞内的磷酸盐池，从而促进了金属的螯合和稳定。结果，酵母细胞可以耐受更高的细胞内金属总量，而毒性并没有相应增加。在磷酸盐缺乏条件下，野生型菌株和转运蛋白突变体中观察到的较低细胞内铁和锌水平（图7C）可能反映了与磷酸盐限制相关的细胞生理变化，而不是排毒能力的改善。在磷酸盐饥饿期间，酵母细胞可能会触发全局应激反应，可能导致生长减缓以及耗能过程的下调，包括主动金属吸收（Boer等人，2003年；Saldanha等人，2004年）。由于磷酸盐对ATP合成、膜完整性和核酸代谢至关重要，其限制会损害细胞的能量状态，并可能影响能量依赖的运输系统（Wagner，2024年）。因此，在磷酸盐缺乏条件下铁和锌的积累减少可能反映了与磷酸盐限制相关的细胞生理变化，而不是排毒能力的改善。尽管如此，仍需进一步确定金属转运活性的直接测量结果。值得注意的是，尽管这些细胞积累的金属总量较少，但它们对铁和锌的胁迫仍然高度敏感，这表明细胞内金属总量并不是金属毒性的主要决定因素。

有趣的是，在不同的磷酸盐浓度下，野生型菌株和Δpho84Δpho87Δpho90突变体之间的细胞内铁水平相似（图7C），这表明在所研究的条件下铁的积累在很大程度上独立于磷酸盐转运蛋白的功能。相比之下，Δpho84Δpho87Δpho90突变体始终显示出比野生型菌株更低的锌积累（图7C）。磷酸盐转运蛋白突变体中锌水平的降低可能反映了与磷酸盐稳态改变相关的间接生理效应，尽管这种差异背后的确切机制尚未得到研究。对磷酸盐转运蛋白缺陷突变体（特别是Δpho84和Δpho84Δpho87Δpho90）的生长分析表明，在磷酸盐缺乏条件下，这些突变体对铁和锌的胁迫表现出显著的高度敏感性（图7A）。这种高度敏感的表型支持了细胞内磷酸盐在保护酵母细胞免受金属毒性方面的关键作用。值得注意的是，即使检测到的细胞内磷酸盐水平非常低，磷酸盐的补充也显著改善了这些突变体的生长（图7A）。这些发现表明，有限的细胞内磷酸盐可用性可能足以减轻金属毒性。尽管如此，也不能排除其他独立于磷酸盐的机制也参与了金属解毒的可能性。傅里叶变换红外光谱分析提供了富含磷酸盐条件下细胞内铁-磷酸盐和锌-磷酸盐相互作用的光谱证据（图3B）。尽管这些复合物的确切化学性质无法最终确定，但数据支持了细胞内金属相关磷酸盐复合物的形成。与我们之前的观点一致，缺乏线粒体铁伴侣的Δyfh1突变体已被证明会在线粒体内积累铁磷酸盐（FePO4）纳米颗粒（Seguin等人，2011年），证明了细胞内铁-磷酸盐复合物的形成在生物学上是合理的。结合观察到的ROS产生的抑制、抗氧化酶活性的降低以及金属响应基因表达的减弱，这些发现表明细胞内磷酸盐调节了金属的生物利用度和氧化还原活性，而不仅仅是作为营养来源。

总的来说，我们的发现支持了一种协调的、主要发生在细胞内的保护机制。虽然细胞外磷酸盐可以在某些条件下通过沉淀作用降低金属的生物利用度，但细胞内磷酸盐通过促进金属螯合、限制ROS的产生和减弱应激响应基因的激活起着核心作用。因此，保护效果更多地由不稳定、具有氧化还原活性的金属池的调控和细胞内氧化还原稳态的维持来决定，而不是由细胞内金属总量的减少来决定。相比之下，我们之前的研究显示，在磷酸盐缺乏条件下，低磷酸盐更有效地保护酵母细胞免受镉的毒性，这是通过增强细胞内抗氧化防御系统而非通过金属螯合或减少金属吸收来实现的（Kerdsomboon等人，2022年）。这些不同的保护机制突显了磷酸盐介导的反应的金属特异性。在磷酸盐限制下，镉的耐受性主要由氧化应激防御的激活驱动，而在磷酸盐充足条件下，铁和锌的耐受性主要依赖于细胞内磷酸盐的缓冲能力。这些区别强调了在评估营养-金属相互作用时考虑个别金属的化学特性和生物功能的重要性。鉴于磷酸盐在受污染的土壤、沉积物和水生环境中的可用性波动很大，理解磷酸盐如何调节细胞内金属的生物利用度和氧化应激对于环境金属风险评估和基于营养的缓解策略的开发具有重要意义。

5. 结论

本研究证明，磷酸盐通过协调的细胞外和细胞内机制保护酿酒酵母免受铁和锌的过量影响。尽管磷酸盐的补充促进了细胞外金属-磷酸盐的沉淀并改善了铁和锌胁迫条件下的生长，但保护效果并不总是与细胞内金属总量的显著减少相关。相反，磷酸盐的可用性抑制了金属诱导的ROS产生，减少了抗氧化酶的激活，并减弱了金属稳态基因的转录诱导，表明有效地缓解了细胞内的氧化应激。磷酸盐转运蛋白缺陷突变体对铁和锌表现出明显的高度敏感性，这强调了细胞内磷酸盐在金属耐受性中的关键作用。傅里叶变换红外光谱分析进一步支持了细胞内金属-磷酸盐复合物的形成。总的来说，这些发现表明，磷酸盐介导的保护主要通过调节不稳定的、具有氧化还原活性的金属池和维持细胞内氧化还原稳态来决定，而不是通过减少细胞内金属总量。这些见解加深了我们对营养-金属相互作用的理解，并为评估环境系统中基于磷酸盐的金属毒性缓解策略提供了概念框架。

cRedI作者贡献声明：

Thanarat Saenrit：研究、形式分析、数据管理、方法学、验证、可视化、撰写-审阅与编辑。
Kittikhun Kerdsomboon：撰写-审阅与编辑、研究、形式分析、数据管理、方法学、验证。
Kyosuke Hono：研究、形式分析、数据管理、方法学、验证、可视化、撰写-审阅与编辑。
Choowong Auesukaree：撰写-审阅与编辑、撰写-初稿、可视化、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、数据管理、概念化、验证。
Tham Udomkanarat：研究、形式分析、数据管理、方法学、验证、可视化。
Atidtaya Kitchotsakul：研究、形式分析、数据管理、方法学、验证、可视化。
Supinda Tatip Luangkamchorn：撰写-审阅与编辑、撰写-初稿、可视化、研究、形式分析、数据管理、方法学、验证。