多组学研究发现，肝脏-微生物群-肠道轴在四溴双酚S（TBBPS）诱导的肝纤维化过程中起着关键作用

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Multi-omics investigations reveal the critical role of the liver-microbiota-gut axis in tetrabromobisphenol S-induced liver fibrosis

　　张睿|顾玉馨|程梦迪|易安|张银凤
青岛大学附属医院心血管病学系，中国青岛266000

**摘要**
四溴双酚S（TBBPS）是一种广泛使用的溴化阻燃剂（BFR），在环境和生物样本中越来越多地被检测到，这引发了人们的高度关注。尽管已有几项体外研究探讨了TBBPS的肝毒性，但其体内效应以及长期暴露的机制，特别是通过与肝脏-微生物群-肠道轴的相互作用，仍然很大程度上未被探索。在本研究中，我们通过口服灌胃的方式给C57BL/6J雄性小鼠施用TBBPS，并采用了一种综合多组学方法，包括转录组学、血清非靶向代谢组学和16S rDNA基因测序。结果显示，1 mg/kg和5 mg/kg/天的TBBPS暴露可导致小鼠出现显著的肝纤维化。进一步的TBBPS处理显著改变了肠道微生物群组成，表现为胆汁酸（BA）代谢细菌的变化以及病原菌如Desulfovibrio的富集。这种菌群失调与胆汁酸稳态的破坏密切相关，表现为血清中的石胆酸水平下降，这可能会驱动肝脏中编码关键胆汁酸合成酶Cyp7a1的表达上调。因此，这种代谢稳态的紊乱通过激活TGF-β促进了肝纤维化。综上所述，这些发现表明，长期TBBPS暴露通过破坏胆汁酸调节的肝脏-微生物群-肠道轴来促进肝纤维化，从而为TBBPS的风险评估提供了依据，并加深了我们对BFR肝毒性的理解。

**1. 引言**
四溴双酚A（TBBPA）是商业产品中最常用的溴化阻燃剂（W?uka等人，2020年；Tao等人，2017年），由于环境和健康问题，它在全球范围内受到限制（Tao等人，2017年；Suyama等人，2023年）。这促使人们转向结构类似的物质，如四溴双酚S（TBBPS），后者具有相似的化学性质，但由于其更好的热稳定性和较低的毒性而被认为更安全（Jarosiewicz等人，2019年；Hu等人，2023年；Qu等人，2016年）。然而，新的证据对这一安全性假设提出了挑战（Xu等人，2024年）。由于TBBPS具有强亲脂性和生物累积性，它容易渗入环境各部分，在生产BFR的工厂的废水中（干重12.1 μg/L）、土壤中（246.5 ng/g）和海洋生物中（脂质重量927.8 ng/g）检测到了高浓度（Su等人，2023年；Liu等人，2018年；Nyholm等人，2013年）。值得注意的是，TBBPS在人类生物样本中的分布广泛，在母体血清样本中的检出率高达90%（平均值：0.593 ng/mL），峰值浓度超过10.8 ng/mL（Li等人，2020年）。长期的环境暴露会导致生物系统中TBBPS的生物累积，进而引发多方面的毒性效应（Xu等人，2024年）。最新研究表明，TBBPS可能破坏内皮细胞功能、促进胃上皮衰老（Zhang等人，2024年；Hu等人，2024年）、引起神经毒性（Liang等人，2019年；Kong等人，2025年；Yin等人，2018年；Lu等人，2018年），并干扰斑马鱼胚胎的昼夜节律网络（Ding等人，2022年）。肝脏作为一个多功能器官（Trefts等人，2017年），特别容易受到药物或毒素引起的肝毒性影响（Armstrong和Guo，2019年；Cuykx等人，2018年；Zheng等人，2021年）。因此，研究TBBPS的肝毒性及其潜在机制至关重要。
有害物质反复和持续地导致肝脏损伤可能会引发一系列病理事件，如肝纤维化（Roehlen等人，2020年；Wynn，2004年）。肝纤维化的特征是肝星形细胞（HSC）的持续激活和细胞外基质（ECM）的异常积累（Roehlen等人，2020年；Tsuchida和Friedman，2017年）。未经治疗的纤维化会发展为肝硬化，每年导致全球约130万人死亡（排名第11位死因）（D’Amico等人，2018年；Lee等人，2020年；Asrani等人，2019年）。到目前为止，TBBPS的肝毒性评估主要基于体外研究，体内证据仅限于少数在斑马鱼中的研究。现有的体外研究表明，TBBPS可引起肝细胞应激（Cuykx等人，2018年；Zheng等人，2021年），表现为坏死性凋亡、炎症激活、增殖相关基因抑制和活性氧（ROS）的积累（Yin等人，2018年；Lu等人，2018年；Yin等人，2024年）。值得注意的是，这些损伤事件与慢性肝病的早期阶段非常相似，如肝纤维化（Taru等人，2024年）。然而，尽管有这些体外证据表明肝细胞受到压力，但长期TBBPS暴露是否会在体内引起哺乳动物的慢性肝损伤和纤维化尚待确定。
最近的研究表明，肠道微生物群衍生的代谢物是连接环境污染物与远端器官毒性的关键介质（Agus等人，2021年；Wang等人，2023年）。例如，Li等人证明慢性砷暴露会破坏肝脏-微生物群-肠道轴，导致鸡肉纤维化（Li等人，2025年）。Ren等人还证明TBBPA通过肠道微生物群-胆汁酸（BA）-大脑轴在斑马鱼中引起神经毒性，这一效应伴随着肠道微生物组成的显著变化和胆汁酸代谢的紊乱（Ren等人，2025年）。鉴于TBBPS是TBBPA的结构类似物，并具有相似的物理化学性质（Jarosiewicz等人，2019年），TBBPS也可能通过依赖肠道微生物群的途径发挥其毒性。肝脏-微生物群-肠道轴是一个双向通道，将肠道来源的物质输送到肝脏，并将胆汁和抗体返回肠道（Pabst等人，2023年）。作为人体最大的黏膜界面，胃肠道（GI）不断处理饮食和微生物信号，肠道微生物群是这一轴的关键调节器（Paone和Cani，2020年；Hays等人，2024年；Fan和Pedersen，2021年）。然而，TBBPS暴露是否通过肝脏-微生物群-肠道轴引起肝毒性仍是一个关键问题，其答案将阐明其机制并指导治疗策略的选择。
因此，在本研究中，我们采用了综合多组学方法，包括转录组学、血清非靶向代谢组学和16S rDNA基因测序，以阐明TBBPS暴露引起的肝脏损伤中肝脏-微生物群-肠道轴的作用。据我们所知，这是首次在哺乳动物模型中系统应用这些多组学技术来全面研究TBBPS引起的肝毒性的不良效应及其潜在机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学品和试剂
TBBPS（纯度96%）从CATO Research Chemicals Inc.（中国广州）获得；TBBPS溶解在二甲基亚砜（DMSO，Solarbio，北京，中国）中，配制成指定的浓度（1 mg/kg和5 mg/kg）的工作溶液，然后分装并储存在-20°C。Tritol从上海Life-iLab Biotech Co., Ltd（上海，中国）购买；SYBR qPCR Master Mix从Vazyme Biotech（南京，中国）购买；PCR引物由Sangon Biotech（北京，中国）合成；HiScript IIl RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）也从Vazyme Biotech（南京，中国）购买。
2.2. 动物和实验处理
从Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.（北京，中国）获得了36只5周大的C57BL/6J雄性小鼠，随机分为三组。在适应12小时光照/12小时黑暗周期一周后，所有动物在整个实验期间都能持续获得食物和水。实验期间的环境条件受到控制，温度为22±2°C，相对湿度为50±5%。TBBPS最初溶解在DMSO中，从6周龄开始每天通过灌胃给药，对照组（CON）则每天给予等量的DMSO溶媒。同时，根据体重（BW）每周调整TBBPS的灌胃剂量，以维持1 mg/kg和5 mg/kg/天的参考暴露水平（Bolognesi等人，2017年）。为了确定我们的剂量选择依据，我们参考了之前关于TBBPS及其类似物的体内研究。Kong等人报告称，TBBPS在0.5 mg/kg、2 mg/kg和10 mg/kg/天的口服剂量下可导致小鼠睾丸老化（Kong等人，2025年），而Hu等人评估了四种双酚类似物——BPA、BPS、TBBPA和TBBPS——在C57BL/6小鼠中口服给药（剂量分别为0.002 mg/kg、0.02 mg/kg、2 mg/kg和20 mg/kg，连续五周）所引起的甲状腺内分泌紊乱（Hu等人，2023年）。我们选择的剂量（1 mg/kg和5 mg/kg/天）处于这一范围内，使我们能够在已记录的肝毒性剂量范围内研究TBBPS引起的肝毒性。在每只小鼠被处死之前，我们使用秤测量其体重（BW）和肝重量（LW）。在麻醉状态下，收集眶静脉血液，于4°C下以3000×g离心15分钟以分离血清，并储存在-80°C。随后使用生化自动分析仪（AU5800，Beckman Coulter，美国）测定血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。接着收集部分肝组织、血清和肠道内容物进行进一步分析。无菌切除中肝叶和远端小肠（距盲肠5 cm处），并用冰冷的PBS轻轻冲洗肠道内容物。立即用液氮快速冷冻所有样本，然后送往LC-Bio Technology（杭州）进行16S rDNA基因测序（肠道微生物群）和液相色谱质谱（LC-MS）/质谱（MS）代谢组学（血清、肝脏和小肠）。每组（n=12）的所有动物都接受了血清生化和组织学评估。从中随机选取每组5只小鼠用于转录组学、qPCR、16S rDNA测序和血清非靶向代谢组学分析，其余7只小鼠用于免疫组化（IHC）染色。所有动物实验均严格遵循青岛大学制定的指南，并得到动物实验委员会（编号QDU-AEC-2022366）的批准。
2.3. RNA提取和RT-qPCR
使用Tritol试剂根据制造商的方案从TBBPS处理组和对照组小鼠的肝组织中提取总RNA（每组n=5）。通过1%琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色，并通过分光光度分析（NanoDrop ND1000，Wilmington，DE，美国）评估RNA的完整性和纯度，可接受的样本具有1.8至2.0的A260/280比率（Zhang等人，2018年）。合格的RNA样本随后提交给LC-Bio Technology（杭州）进行文库制备和测序。
逆转录使用HiScript IIl RT SuperMix试剂盒进行，以1 μg的总RNA为模板，按照制造商的方案进行。从大约1 μg的总RNA中构建了一个插入大小为300±50 bp的cDNA文库。随后使用SYBR Green检测试剂盒在ABI Prism 7500系统上进行定量实时PCR（qRT-PCR）（Applied Biosystems）。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因进行标准化，所有引物序列列在表S1中。每个实验重复三次以上以确保重复性。基因表达水平根据内源性参考基因进行归一化，并使用比较2-ΔΔCt方法计算（Livak和Schmittgen，2001）。
2.4. 组织病理学分析
进行组织病理学检查以评估组织损伤并确定病变的严重程度。收集肝标本，用4%甲醛固定，经过脱水处理后嵌入石蜡中。将石蜡包埋的组织切片、脱蜡，然后进行苏木精和伊红（H&E）染色、Sirius red染色和Masson三色染色。对于肠道组织，使用甲苯胺蓝（Toluidine Blue）染色：将5 μm厚的肠道切片在室温下用0.1%甲苯胺蓝溶液（pH 2.5–3.0，用醋酸调节）染色5–10分钟，然后脱水、用二甲苯清洗，并用中性树脂封片。使用Olympus BX-FM显微镜（Olympus BX-FM，东京，日本）随机获取显微图像以评估组织形态。
2.5. 16S rDNA基因测序
将新鲜肠道内容物收集到预冷的1.5 mL微量离心管中，并立即储存在-80°C直至分析。使用FastPure Stool DNA Isolation Kit（MJYH，上海，中国）从粪便样本中提取基因组DNA。使用NanoDrop 2000分光光度计评估DNA浓度和纯度。通过PCR扩增细菌16S rDNA基因V3-V5可变区域。所得扩增子在2%琼脂糖凝胶上分离，切除并用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，美国）纯化。使用Quantus Fluorometer（Promega，美国）对纯化产物进行定量，并在Illumina NextSeq 2000平台（PE300）上进行测序（Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd，上海，中国）。经过生物信息学处理（包括质量过滤、去噪和合并配对末端读段）后，生成扩增子序列变异。使用α多样性指数通过主坐标分析（PCoA）基于Bray–Curtis差异度量来表征微生物群落多样性。为了识别在三个实验组中显著富集的菌群，进行了线性判别分析效应大小（LEfSe）测试（LDA分数 > 3，p < 0.05）。对于组间的成对比较，使用单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni的事后检验来确定有显著差异的细菌菌群（p < 0.05）。

2.6 血清非靶向代谢组学分析
将血清样本（每只小鼠200 μL，每组5个样本）与400 μL甲醇混合以沉淀蛋白质。离心后，将上清液在真空条件下蒸发至干，并用含有2-氯苯丙氨酸的80%甲醇复溶。过滤后的上清液使用LC-MS/MS进行分析。色谱分离在Thermo Ultimate 3000系统上进行，使用ACQUITY UPLC? HSS T3（Thermo，美国）柱子，并采用水和乙腈（均含有0.1%甲酸）的梯度洗脱。质谱分析在Q-Exactive Orbitrap质谱仪上进行，同时进行正离子和负离子模式。原始数据使用XMCS软件进行处理，包括峰值提取（信噪比≥3）、保留时间对齐（容忍度=0.1分钟）和峰值面积积分（Ren等人，2021年）。应用中位数归一化来校正系统误差。代谢物的鉴定基于精确质量（≤5 ppm）、保留时间和与HMDB及内部库的MS/MS匹配结果。每10个注射样本注入一个质量控制（QC）样本；在不到50%的QC样本中检测到的特征被排除。差异积累的代谢物通过PLS-DA（VIP ≥ 1.0）结合|log?FC| ≥ 1.0和p < 0.05进行鉴定。

2.7 免疫组化染色
首先使用冰冷的0.9%生理盐水进行心脏灌流，然后使用4%多聚甲醛（PFA）。迅速取出肝脏并在4°C下用4% PFA固定过夜。在30%蔗糖溶液中冻保护组织直到组织下沉后，使用冷冻切片机（CM1950，Leica，Wetzlar，德国）切割30 μm厚的肝脏切片。进行免疫组化时，将自由漂浮的切片在PBS中洗涤，并用0.3% Triton X-100渗透20分钟。抗原提取在EDTA缓冲液中（pH 8.0）进行。内源性过氧化物酶活性用3%过氧化氢灭活。切片与一级抗体（anti-TGF-β1，1:500；Servicebio）在4°C下孵育过夜，随后与二级抗酶联兔HRP抗体（1:300；Servicebio）孵育。使用DAB显色剂 kit进行抗原检测。最后，将切片脱水、透明处理并装片用于显微镜观察。数字图像使用Pannoramic MIDI（3DHISTECH，匈牙利）获取，并使用Image-Pro Premier（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，美国）进行分析。

2.8 肠道微生物群与代谢物之间的相关性分析
为了识别与代谢物丰度密切相关的肠道微生物，我们进行了LEFSe0808阶段的微生物群和代谢组学数据相关性分析。显著不同的微生物菌群和关键代谢物接受了Spearman等级相关性测试。随后应用层次聚类来可视化细菌菌群和代谢物之间的共现模式。所有分析均使用OmicStudio在线平台进行（详细信息见www.omicstudio.cn）。

2.9 数据分析
Venn图、热图、火山图和路径分析均使用OmicStudio在线平台生成（详细信息见www.omicstudio.cn）。数据以平均值±标准误（SEM）的形式呈现。统计分析采用Student's t检验（两组之间），而多组比较则使用单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni的事后检验。所有统计分析使用GraphPad Prism 5软件（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，美国）进行。统计显著性阈值设定为p < 0.05，显著性级别分别表示为p < 0.05（*）、p < 0.01（**）、p < 0.001（***）或p < 0.0001（****）。

3. 结果
3.1 TBBPS暴露诱导小鼠肝脏纤维化
为了系统评估TBBPS引起的肝毒性，小鼠通过口服灌胃每日暴露于1毫克和5毫克/千克的TBBPS，持续一个月。通过综合形态测量、血清生化和组织病理学分析来表征肝毒性。TBBPS暴露导致LW/BW比值显著下降，从对照组的0.054降至1毫克/千克和5毫克/千克剂量时的0.049和0.046（图1A）。然而，各组间的血清ALT和AST活性或ALT/AST比值没有显著差异（图1B-D）。与此一致的是，TBBPS处理的小鼠肝脏组织在H&E染色切片检查中没有明显的病理变化（图1G）。为了进一步评估肝毒性，使用Masson三色染色和Sirius Red染色量化胶原沉积。

图1. TBBPS处理诱导小鼠肝脏纤维化。对照组和TBBPS处理组（1毫克/千克和5毫克/千克，n=12）的LW/BW比值（A）、ALT（B）、AST（C）以及ALT/AST比值（D）。TBBPS处理与否的小鼠肝脏的代表性H&E染色、Masson三色染色和Sirius Red染色图像（G）（H&E染色：刻度尺=100 μm，放大倍数100倍；Masson三色染色：刻度尺=50 μm和100 μm，放大倍数200倍和100倍；Sirius Red染色：刻度尺=50 μm和100 μm，放大倍数200倍和100倍；n=12）。Masson三色染色和Sirius Red染色的形态测量分析（E和F，n=12）。所有数据以平均值±SEM表示。统计显著性通过单因素方差分析和Bonferroni的事后检验确定（多组比较）。显著性级别分别表示为*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001和****p < 0.0001。结果表明，TBBPS处理组表现出加剧的肝脏纤维化，这通过两种不同的组织学染色中胶原积累的增加得到证实。在两种剂量的TBBPS处理后，观察到明显的胶原沉积，通过Masson三色染色显示为中央静脉周围的蓝色染色纤维（对照组：12.21 ± 3.18%；1毫克/千克/天：23.82 ± 2.94%；5毫克/千克/天：23.15 ± 5.27%）（p < 0.0001，单因素方差分析，n=12；图1E和G）。一致地，TBBPS处理的肝脏在Sirius Red染色下的纤维化区域显著扩大，从对照组的5.01 ± 1.81%增加到1毫克/千克和5毫克/千克剂量时的13.07 ± 1.76%和13.88 ± 4.78%（p < 0.0001，单因素方差分析，n=12；图1F和G）。综上所述，这些结果证实TBBPS暴露在小鼠中诱导肝脏纤维化，其特征是胶原过度积累。

3.2 TBBPS暴露触发小鼠肝脏转录组变化
为了探索与TBBPS引起的肝毒性相关的关键基因，对小鼠肝脏组织的基因表达进行了转录组分析。基于|log?FC| ≥ 1.0和p < 0.05的标准，选择了差异表达基因（DEGs）。如Venn图所示，252个DEGs在两种剂量下均被共同诱导（图2A）。TBBPS处理导致小鼠肝脏转录组发生显著变化，表现为DEGs的剂量依赖性增加：1毫克/千克剂量下有525个基因上调（236个上升，289个下降），5毫克/千克剂量下有894个基因上调（390个上升，504个下降）（|log?FC| ≥ 1.0，p < 0.05；图2B-D）。生成热图以描绘各组样本之间的相似性和异质性模式（图2E和F）。这表明5毫克/千克/天的TBBPS处理组引发了更复杂和特定的转录调控反应，表明其肝毒性机制可能与低剂量处理不同。

图2. TBBPS暴露触发小鼠肝脏转录组变化。对照组与TBBPS处理组（1毫克/千克和5毫克/千克）的DEGs的Venn图（A）、条形图（B）、火山图（C和D）和热图（E和F）（n=5）。TBBPS处理组（1毫克/千克和5毫克/千克）调节的所有DEGs的功能富集（n=5）。1毫克/千克和5毫克/千克TBBPS处理富集的DEGs的KEGG路径（G和K）以及5毫克/千克TBBPS处理富集的DEGs的GO富集（H和L）。此外，我们使用Metascape数据库（https://metascape.org/）对候选DEGs进行了KEGG和GO功能富集分析。在KEGG路径分析中，1毫克/千克和5毫克/千克剂量组在包括昼夜节律（mmu04710）、初级BA生物合成（mmu00120）、视黄醇代谢（mmu00830）、细胞周期（mmu04110）、PPAR信号通路（mmu03320）和癌症中的转录失调（mmu05202）等路径中表现出显著富集（图2G、H、K和L）。值得注意的是，这些路径中的几个表现出剂量依赖性的富集模式。昼夜节律（mmu04710）、内质网中的蛋白质加工（mmu04141）和视黄醇代谢（mmu00830）的富集随着TBBPS剂量的增加而逐渐增强。具体来说，1毫克/千克剂量组在内质网中的蛋白质加工（mmu04141）、IL-17信号通路（mmu04657）和细胞衰老（mmu04218）等路径中表现出独特富集，而5毫克/千克剂量组在胆汁分泌（mmu04976）、马达蛋白（mmu04814）和吞噬体（mmu04145）等路径中表现出独特富集（图2G和H）。GO富集分析显示，与两种剂量组相关的基因在细胞外空间（GO:0005615）、细胞外区域（GO:0005576）、DNA模板转录调控（GO:0006355）、信号转导（GO:0007165）、蛋白质结合（GO:0005515）和分子功能（GO:0003674）等方面显著富集（图2I和J以及图S1 A-C）。值得注意的是，1毫克/千克剂量组在含有胶原的细胞外基质（GO:0062023）中表现出独特富集（图S1 A-C）。总体而言，这些发现表明TBBPS暴露可能与代谢稳态的破坏和细胞外基质的变化密切相关。

3.3 TBBPS暴露触发小鼠肠道转录组变化
为了进一步揭示TBBPS对肠道的影响，进行了H&E和Toluidine Blue染色；然而，处理组和对照组之间没有观察到显著的组织病理学差异（数据未显示）。因此，为了获得更深入的分子洞察，我们对小鼠肠道组织进行了全面的转录组分析。转录组谱分析结果显示，与对照组相比，两个TBBPS处理组的基因表达发生了显著变化（图3A），在1毫克/千克剂量下观察到811个DEGs上调（283个上升，528个下降），在5毫克/千克剂量下观察到570个DEGs上调（325个上升，245个下降）（|log?FC| ≥ 1.0，p < 0.05；图3B和C）。为了系统地揭示这些候选基因主要参与的生物学过程，我们进行了KEGG和GO路径富集分析。KEGG的结果显示，两种剂量都广泛影响了多种生物学通路，包括神经活性配体-受体相互作用（mmu04080）、胰腺分泌（mmu04972）和花生四烯酸代谢（mmu00591），其中在高剂量下表现出更明显的富集（图3D和E）。同样，GO富集分析显示，两个处理组都与关键生物学过程显著相关，如脂质代谢过程（GO:0006629）、RNA聚合酶II的正向转录调控（GO:0045944）和对细菌的反应（GO:0009617）（图3F和G）。这些路径级和过程级数据的汇聚强化了TBBPS暴露与代谢稳态破坏紧密相关的观点。

3.4 TBBPS暴露对小鼠肠道微生物群的影响
为了进一步明确TBBPS在调节肠道稳态中的作用，我们对对照组和TBBPS处理小鼠的粪便样本进行了16S rDNA测序。正如预期的那样，特别是5毫克/千克的TBBPS暴露显著降低了肠道微生物的α多样性，表现为Simpson指数、Pielou均匀性和Shannon指数的下降（图4A-C，p < 0.05）。同时，TBBPS给药引起了组成的改变和剂量依赖性的结构破坏，这通过PCoA分析得到证实（图4D）。随后使用LEfSe来识别导致这种分离的具体菌群（LDA分数 > 3）。

图4. TBBPS给药扰乱了小鼠肠道微生物群组成。样本的Alpha多样性指数箱线图：Simpson指数（A）、Pielou均匀性（B）和Shannon多样性（C）（n=5）。不同肠道细菌在属（E）水平的相对丰度（n=5）。对照组和TBBPS处理组（1毫克/千克和5毫克/千克）的PCoA（D）得分图（n=5）。从LEfSe分析生成的丰度得分图，表示在对照组和TBBPS处理组（1毫克/千克和5毫克/千克）的粪便样本中差异富集的多个菌群，在LDA阈值为3.0时（p：门，c：纲，o：目，f：科，g：属）。所有数据以平均值±SEM表示。统计显著性通过单因素方差分析和Bonferroni的事后检验确定（多组比较）。显著性级别分别表示为*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001和****p < 0.0001。暴露于1毫克/千克/天和5毫克/千克/天的TBBPS共同增加了多种微生物群的丰度，包括Desulfovibrio（一种潜在的病原菌）、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Candidatus_Saccharimonas等（图4E和G）。相反，Ligilactobacillus的相对丰度在TBBPS处理后降低（1毫克/千克/天和5毫克/千克/天）（图4E和G）。值得注意的是，一些细菌群落表现出 dose-dependent 的不同反应，包括f_Ruminococcaceae、o_Oscillospirales和f_Rikenellaceae，它们的丰度受到两种剂量的不同影响（图4F）。这种双向的菌群失调反映了从平衡状态到失衡状态的转变，表明微生物扰动可能是TBBPS毒性的一个因素。

3.5. TBBPS处理改变了小鼠的血清代谢组

为了进一步探讨小鼠肠道与肝脏之间的相互作用，我们进行了血清代谢组学分析（Dong等人，2026年）。每个组（对照组、1毫克/千克/天和5毫克/千克/天的TBBPS处理组）的五个血清样本都通过LC-MS进行了分析。在本研究中，p值 ≤ 0.05且Variable Importance in Projection（VIP）≥ 1的代谢物被认为是差异性丰富的。多变量分析证实了各组之间的代谢差异显著。主成分分析（PCA）用于可视化血清样本的总体代谢谱型，结果显示TBBPS处理组与对照组有明显的分离（PCA得分图可见，图5A-C）。TBBPS诱导了血清代谢物的剂量依赖性变化，在1毫克/千克/天和5毫克/千克/天处理组分别有92种（上升19种，下降73种）和143种（上升53种，下降90种）代谢物发生变化（图5F）。热图共同显示，TBBPS暴露显著破坏了血清代谢稳态，影响了包括氨基酸、脂质、有机酸和外来污染物在内的多种代谢物类别（图5D和E）。值得注意的是，我们确定胆汁酸（LCA）是一种关键的差异性代谢物，其水平显著降低（图5G）。

3.6. TBBPS暴露激活了TGF-β信号通路并在小鼠肝脏中诱导了与纤维化相关的基因表达

为了阐明TBBPS诱导的肝纤维化背后的分子途径，我们检查了关键信号分子的激活以及小鼠肝脏中与纤维化相关基因的表达。鉴于观察到的胆汁酸（BAs）的变化，我们首先检查了BA的代谢。如图6C所示，与对照组相比，TBBPS处理显著增加了细胞色素P450，家族7，亚家族A，多肽1（Cyp7a1）的mRNA水平（p < 0.05；图6C）。

3.7. 小鼠肝脏中肝-微生物组-肠道轴的相关性分析

为了阐明肠道微生物变化与肝毒性之间的功能联系，我们进行了Pearson相关性分析，整合了微生物群、血清代谢物和组织病理学指标。分析显示，乳酸菌科（Lactobacillaceae）、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcaceae和Desulfovibrio的丰度变化与BA代谢的紊乱和肝纤维化的进展高度相关（图6D）。在图6E中，肝脏生理指标、肝功能指标LCA以及与本研究相关的关键纤维化基因和蛋白质显示出强烈的相关性（图6E）。

总之，这些发现表明，长期TBBPS暴露通过破坏肝-微生物组-肠道轴的稳态来诱导肝毒性。值得注意的是，肠道微生物的变化会破坏BA代谢，导致特定BA亚型的显著改变，包括LCA的显著减少。LCA的减少又与肝功能受损、肝酶指标升高以及关键纤维化相关基因和蛋白质的表达上调密切相关。在这个过程中，肠道菌群失调导致了异常的BA谱型，进而推动了小鼠肝纤维化的发生（图6F）。

尽管TBBPS是TBBPA的结构类似物和直接替代品（W?uka等人，2020年；Qu等人，2016年），但越来越多的证据揭示了其显著的不良生物学效应，这对它作为TBBPA替代品的假设提出了挑战，并强调了进行机制研究的迫切需求（Xu等人，2024年）。我们的发现揭示了TBBPS诱导肝毒性的一个先前未被认识到的机制，引发了对其作为TBBPA替代品的适用性的严重担忧。肝脏作为代谢和解毒的中心枢纽（Trefts等人，2017年），对TBBPS等毒物高度敏感。然而，目前的毒理学评估主要局限于体外模型（Yin等人，2024年），TBBPS在哺乳动物中诱导的肝毒性的具体效应和潜在机制仍大部分未得到探索。为了填补这一知识空白，我们建立了慢性TBBPS暴露的小鼠模型，并采用综合多组学方法系统研究了肝-微生物组-肠道轴的参与。我们的结果揭示，慢性TBBPS暴露破坏了肝-微生物组-肠道轴，从而引发了肠道菌群失调和BA代谢障碍，激活了TGF-β通路，最终导致了肝纤维化。总的来说，这些发现表明TBBPS通过上调TGF-β1在某种程度上调节了TGF-β通路，从而促进了肝纤维化的发生。

本研究选择的TBBPS剂量（1毫克/千克/天和5毫克/千克/天）基于先前研究中规定的剂量选择原则（Kong等人，2025年；Bolognesi等人，2017年）。这些剂量水平对于评估职业环境和污染热点地区的健康风险仍然具有相关性，因为在这些环境中暴露量可能显著增加（Pagano等人，2019年；Sarazin等人，2026年；de Souza等人，2026年；Dunn等人，2025年）。因此，我们的发现为评估这种新兴环境污染物在高暴露情景下的毒性提供了重要理论依据。为期一个月的治疗期（从6周开始）旨在与从青春期到成年早期的过渡期相一致，从而最小化潜在的发育混淆因素（Dutta和Sengupta，2016年）。由于这一时期与肝脏的关键成熟阶段重合，TBBPS在此阶段的干扰不仅可能损害肝功能，还可能导致个体面临长期的代谢和系统健康风险（Trefts等人，2017年）。我们的研究显示，TBBPS暴露在小鼠中引发了病理性的肝纤维化，表现为胶原蛋白的沉积（Masson三色染色/Sirius红染色，图1E-G）。观察到的LW/BW比值下降可能归因于细胞萎缩（Yin等人，2024年）。尽管有明显的纤维化变化，但血清中的ALT和AST水平及其比值保持不变。临床证据表明，正常的ALT并不能排除显著的纤维化。例如，一项大型NHANES研究报告称45.9-64.2%的肝纤维化病例ALT水平正常（Li等人，2023年），一项荟萃分析显示32%的慢性乙型肝炎患者ALT水平正常（≤ 40 IU/L）但仍有显著纤维化（Condon等人，2024年）。此外，一项针对91,914名患者的一级护理队列研究显示，78.7%的晚期纤维化风险或高度风险患者氨基转移酶水平完全正常（Xiao等人，2024年）。综合这些临床数据，我们的TBBPS暴露模型中组织学确认的纤维化与ALT/AST水平未改变的情况与慢性、低度进行性损伤一致。此外，对肝脏转录组数据的综合KEGG/GO分析显示，与纤维化相关的过程路径得到富集，包括初级BA生物合成、胆汁分泌、脂质代谢过程以及含有胶原蛋白的细胞外基质（图2G-L和图3D-G）。体外证据进一步证实了这些发现，表明TBBPS抑制肝细胞增殖和线粒体自噬，触发坏死凋亡、ROS积累和炎症反应，这些都与体内观察到的纤维化病理有关（Yin等人，2024年；Yang等人，2021年；Lin等人，2025年）。TGF-β1是一种关键的促纤维化因子，它驱动ECM的沉积（Lv等人，2020年；Zhang等人，2022年；Xu等人，2016年），在TBBPS处理的样本中显著上调（图6A和B）。类似地，先前的研究也表明BPA通过上调TGF-β来诱导肝毒性（Amin等人，2023年；Wang等人，2024年），这进一步支持了TGF-β在双酚诱导的肝纤维化效应中的关键作用。我们的分析还揭示了SBA代谢与TBBPS处理后特定肠道微生物丰度变化之间的显著联系。先前的研究已经证明，肠道微生物-BA轴对肝脏功能具有关键调节作用；例如，褪黑素通过调节这一途径来改善镉诱导的肝纤维化（Liu等人，2024年）。BA代谢是脂质稳态的关键组成部分，与肝纤维化密切相关，由肝-微生物组-肠道轴这一动态功能网络调控，其中肝胆汁流动和肠道微生物群之间的相互作用通过肠肝循环整合（Pabst等人，2023年；Lang和Schnabl，2020年；Fuchs和Trauner，2022年）。在肝细胞中，胆固醇通过Cyp7a1转化为初级胆汁酸（PBAs），然后结合并分泌到胆汁中，再运输到肠道（Fleishman和Kumar，2024年）。在那里，肠道微生物群如乳酸菌首先解 conjugate PBAs，然后通过Ruminococcaceae和Lachnospiraceae等微生物群进行7α-脱羟作用，将其转化为如LCA这样的SBAs（Qu等人，2016年；Lee等人，2020年；Ma等人，2015年；Song等人，2023年）。在我们的研究中，TBBPS处理组的Ruminococcaceae和Lactobacillus丰度显著降低（图4E）。这种减少与LCA浓度的显著下降同时发生（图5G），表明TBBPS诱导的Ruminococcaceae和Lactobacillus减少与LCA的减少相关。此外，非酒精性脂肪性肝炎患者中也记录了Ruminococcaceae的减少，这证明了肠道菌群失调与肝脏疾病发病机制之间的密切联系（Parks等人，1999年）。Ruminococcaceae和Lachnospiraceae_NK4A136组的相对丰度略有增加，这被认为是一种对慢性TBBPS暴露的小鼠的适应性微生物反应。然而，这种适应性变化可能会通过改变其他细菌群落的丰度而不经意地扰乱肠道微生物群。由于这种破坏，LCA影响了BA的循环和代谢途径，然后激活了TGF-β通路，最终导致了肝纤维化。同时，LCA作为Cyp7a1基因表达的负调控因子（Fuchs和Trauner，2022年；Parks等人，1999年；Wang等人，1999年；Makishima等人，1999年）。在这项研究中，我们观察到Cyp7a1的表达显著上调，这与LCA水平下降的现象相符。这种反向关系表明，LCA的减少解除了对Cyp7a1的抑制，从而导致了胆汁酸（BA）稳态的破坏，并形成了一个自我延续的循环，该循环超出了肝脏的代谢能力，加剧了肝脏损伤。这些发现与先前的研究结果一致，即TBBPA和BPS的处理可以上调Cyp7a1的表达（Gomez等人，2021年）。此外，最近的研究表明LCA通过TGF-β信号通路抑制肝干细胞（HSC）的激活（Fuchs和Trauner，2022年）。在我们的研究中，观察到的LCA水平下降与TGF-β信号通路的激活精确对应，形成了一个功能上的连贯反馈回路。根据我们的实验结果，我们得出结论：TBBPS破坏了小鼠体内的胆汁酸稳态，导致LCA减少，并随后激活了TGF-β信号通路。

除了胆汁酸代谢细菌的变化外，我们还在暴露于TBBPS的小鼠中发现了Desulfovibrio的显著增加（图5G）。Desulfovibrio通过异养性硫化合物的还原产生硫化氢（H2S），当其过度产生时，可能会破坏肠道屏障的完整性并引发全身炎症（Lin等人，2022年；Takahashi等人，2020年）。值得注意的是，从肝硬化患者中分离出的Desulfovibrio与健康个体相比，具有更强的H2S产生能力、更高的胃肠道耐受性和抗生素抗性（Lu等人，2023年）。这些发现表明，TBBPS处理导致的Desulfovibrio数量增加可能是肝纤维化的一个促成因素，尽管这种关联的具体机制仍需进一步阐明。

先前的研究表明，TBBPA可以通过触发氧化损伤、代谢功能障碍、免疫细胞浸润和铁依赖性细胞死亡来诱导肝毒性（Yao等人，2021年；Bai等人，2024年；Chen等人，2016年；Liu等人，2025年）。例如，每天5毫克/公斤的TBBPA剂量暴露会导致肝脏组织损伤和肝细胞线粒体的结构变化（Liu等人，2025年）。值得注意的是，我们的研究表明，相同剂量的TBBPS（1毫克/公斤/天和5毫克/公斤/天）也会强烈引发肝纤维化。此外，我们的多组学数据揭示了由肝脏-微生物群-肠道轴驱动的TBBPS的全身性致病机制。总体而言，这些发现强调了将TBBPS作为TBBPA替代品的应用需要仔细审查，而本研究为其未来的环境健康和生态风险评估提供了重要的科学见解。

尽管我们的多组学方法具有优势，但这项研究也存在一些局限性，指出了未来研究的重要方向。首先，尽管由于雄性小鼠对纤维化更为敏感（Link和Reue，2017年；Chen等人，2022年；Jamalinia等人，2024年；Cooper等人，2023年），本研究仅使用了雄性小鼠，这限制了研究结果的普遍性（Schwabe和Luedde，2018年）。值得注意的是，我们在引言中引用的生物监测数据来自母体血清样本，这进一步强调了纳入雌性受试者的重要性。因此，未来的研究应包括雌性小鼠，以评估性别差异并更好地评估人类健康风险，特别是对于孕妇和育龄妇女。其次，尽管我们的数据证实了肠道微生物失调与肝纤维化之间的明确关联，但仍需要通过益生菌补充、粪便微生物群移植和抗生素诱导的微生物耗竭模型来进一步研究微生物群在TBBPS诱导的纤维化中的作用。最后，Desulfovibrio在TBBPS诱导的肝纤维化中的作用仍不清楚；需要进一步的研究来阐明Desulfovibrio产生的代谢物（尤其是硫化氢）是否与胆汁酸代谢紊乱和HSC激活有关。总体而言，基于多组学分析，我们的研究表明TBBPS暴露通过破坏肝脏-微生物群-肠道轴在小鼠体内诱导全身性肝毒性。

5. 结论

总之，通过灌胃给予TBBPS并采用综合多组学方法，本研究提供了确凿的证据，证明长期暴露（1毫克/公斤/天和5毫克/公斤/天）会在小鼠中诱发肝纤维化，揭示了其肝毒性的新机制基础。这种暴露导致肠道微生物群发生显著变化，进而扰乱了胆汁酸代谢——表现为LCA水平显著下降。LCA水平的降低通过激活TGF-β通路促进了纤维化的进展。同时，受损的肝脏通过上调Cyp7a1表达进一步扰乱了胆汁酸稳态。这种调节紊乱加剧了胆汁酸代谢紊乱，从而形成了一个恶性循环。

肝脏-微生物群-肠道轴是一个有前景的治疗靶点，可用于缓解TBBPS在小鼠模型中诱导的全身性毒性。通过重新平衡肠道细菌并优化胆汁酸代谢，可能需要恢复肠道-肝脏轴，从而减轻TBBPS相关的肝纤维化。这些机制性见解突显了在鼠模型中进行转化研究的必要性，以评估微生物干预的效果。总之，我们的发现为评估TBBPS相关的毒理学和生态危害提供了重要的基础。

研究伦理批准

本项研究已获得青岛大学医学院伦理委员会的批准，如需证明批准文件，可随时索取。