多西环素对粪便温室气体潜力的毒性影响：噬菌体-微生物相互作用及沼气发酵预处理措施的应用

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Doxycycline-induced toxic perturbations on manure GHG potential: Phage-microbe interactions and BSF pretreatment mitigation

　　邓伟康|邓一恒|谢诗意|陈净媛|邢思成|廖新娣
中国广东省广州市华南农业大学动物科学学院，510642

摘要
大规模生产禽粪对环境安全构成重大挑战，黑水虻（BSF）作为一种潜在的资源利用解决方案应运而生。然而，禽粪中多西环素（DOX）污染对整个黑水虻粪便回收过程中甲烷（CH4）和一氧化二氮（N2O）排放潜力的毒理学影响尚不明确，尤其是从噬菌体-微生物相互作用的角度来看。本研究探讨了与“鸡粪-有机肥料”和“鸡粪-黑水虻-鸡”途径相关的细菌和噬菌体功能基因在CH4和N2O代谢中的作用。研究结果表明，禽粪中的DOX会干扰微生物群落，显著升高与温室气体排放潜力相关的重要功能基因（mcrA/pmoA和(nirS+nirK)/nosZ）的水平。这些由DOX诱导的基因水平在黑水虻衍生的有机肥料以及饲喂受污染粪便长大的产蛋鸡的粪便中仍然存在。然而，24小时禁食处理结合65°C下8小时干燥可以有效缓解DOX引起的负面毒理学效应，经此类处理的产蛋鸡粪便中的CH4和N2O排放潜力分别减少了91.1%和82.4%。重要的是，噬菌体介导的水平基因转移（HGT）在这些基因变化中起着关键的调节作用，进一步放大了DOX引起的温室气体排放风险。本研究强调了黑水虻预处理在降低抗生素污染禽粪环境风险方面的潜力，同时从环境毒理学的角度解决了气候问题。它还提供了一种可扩展的毒理学风险缓解策略，以减少禽类养殖系统中的温室气体排放潜力，这对集约化禽类生产的环境安全具有重要意义。

1. 引言
禽粪占全球畜牧废物的30%以上（Loyon, 2017），但其可持续回收利用仍需进一步探索（Wang et al., 2021）。未经处理的禽粪在分解过程中主要释放甲烷（CH4）和一氧化二氮（N2O），这些都是加剧全球变暖的强效温室气体（Manbeck et al., 2016）。值得注意的是，多西环素（DOX）是一种在集约化禽类养殖中广泛使用的兽用四环素抗生素，它作为一种典型的环境毒素，会干扰微生物群落结构和代谢功能（Wu et al., 2024）。这种DOX引起的毒理学干扰进一步加剧了CH4和N2O的排放潜力，形成了抗生素污染和农业气候变化的双重环境风险（Jiao et al., 2024; Ferreira et al., 2022; Zhang et al., 2024）。因此，安全处理和资源化利用DOX污染的禽粪对于确保环境安全至关重要，有必要阐明其背后的毒理学机制并开发针对性的缓解策略。
DOX污染禽粪的安全处理方法包括厌氧发酵、好氧堆肥和昆虫转化处理（Luo et al., 2020, Mazza et al., 2020）。与传统方法相比，黑水虻（BSF, Hermetia illucens）转化处理具有生产有机肥料和高质量昆虫蛋白饲料的双重优势（Singh and Kumari, 2019），从而实现了禽粪的资源化利用，并带来经济效益（Surendra et al., 2020）。黑水虻介导的鸡粪处理可以构建“鸡粪-黑水虻-鸡”和“鸡粪-有机肥料”的两个循环经济模型，这被认为是集约化养殖系统中禽粪管理的一个有前景的策略（Bruno et al., 2019）。然而，现有的基于黑水虻的禽粪回收技术尚未考虑DOX污染对整个回收链中温室气体排放潜力的毒理学影响，这是实际应用中的一个关键环境安全漏洞。
畜牧业中DOX的过度使用对基于黑水虻的粪便回收系统带来了挑战（Saady et al., 2024），因为DOX会严重干扰微生物群落，选择性抑制易感细菌并富集耐药菌株，从而改变微生物代谢过程并促进温室气体的产生（Wu et al., 2024; Wang et al., 2023）。除了抗生素抗性基因的传播外，DOX还会通过增加温室气体排放加剧农业气候风险（Shen et al., 2024）。CH4和N2O是禽粪的主要温室气体，其GWP分别是CO?的28倍和273倍（Deng et al., 2023），其排放潜力可通过功能基因比率mcrA/pmoA（对于CH4）和(nirS+nirK)/nosZ（对于N2O）来表征——这是微生物环境毒理学中一种可靠的量化方法（Qin et al., 2018; Bian et al., 2017）。噬菌体作为关键的微生物共生体，含有与CH4代谢相关的操作基因，并影响温室气体产生速率（Chen et al., 2020）；温带噬菌体可以通过转导在细菌之间介导水平基因转移（HGT）（Harrison and Brockhurst, 2017），促进抗生素抗性基因（Wang et al., 2024）和温室气体相关功能基因（Valencia-Toxqui and Ramsey, 2024）的传播，尤其是在黑水虻回收系统中的食物链介导的微生物传播过程中。然而，三个关键的微生物毒理学研究领域仍未解决：（1）DOX引起的毒理学干扰如何动态影响整个黑水虻回收链中的温室气体相关功能基因？（2）噬菌体-微生物相互作用通过HGT在DOX引起的温室气体排放潜力升高中的作用是什么？（3）是否有针对性的黑水虻预处理可以在确保环境安全的同时缓解持续的DOX引起的毒理学效应？
总体而言，畜牧粪料的资源化利用是实现环境友好和可持续发展的有效途径。然而，目前尚不清楚畜牧粪料中的抗生素污染如何影响整个资源化利用过程中CH4和N2O的排放，特别是在这一背景下的噬菌体影响。因此，本研究的主要目的是通过研究两种回收途径中细菌和噬菌体中CH4/N2O相关功能基因的动态变化，阐明黑水虻禽粪回收系统中DOX引起的温室气体排放潜力升高的微生物毒理学机制，并验证黑水虻预处理的缓解效果。本研究旨在为DOX污染禽粪管理的黑水虻资源化利用提供针对性的毒理学风险控制方案，并为禽类养殖的环境安全奠定微生物毒理学基础——这符合生态毒理学和环境安全的核心研究目标。

2. 材料与方法
2.1. 黑水虻和产蛋鸡的培育
从广东绿洋农业有限公司购买了30只150天的罗马粉红色产蛋鸡，分为两组，每组15只，每组3个重复实验，每个重复实验5只鸡。处理组在饲料中添加了DOX（30 mg/kg），而对照组则摄入等量的无菌水。连续喂养30天后，收集两组鸡的粪便用于喂养黑水虻。黑水虻卵从广州五良生物科技有限公司购买。黑水虻最初在无菌饲料中孵化7天，然后转移到含有DOX或不含有DOX的粪便基质中，饲养密度为300只幼虫/千克（黑水虻饲养箱的尺寸为50 cm×40 cm×10 cm）。在黑暗环境中，湿度为70%，温度为28°C的孵化箱中培育。饲养7天后，黑水虻幼虫接受两种处理方法：“禁食/饱食”或“干燥/新鲜”。“禁食”是指在饲养7天后让黑水虻禁食24小时以清除肠道内容物；“饱食”则表示不进行禁食处理。“干燥”是指在65°C的对流烤箱中干燥黑水虻8小时，然后用粉碎机研磨，“新鲜”昆虫则不进行处理。这样共产生了8种不同的黑水虻处理方式。随后，从上述公司购买了120只150天的罗马粉红色商业产蛋鸡，随机分为8组，每组3个重复实验，每个重复实验5只鸡。将8种不同的黑水虻处理方式以每天每只鸡10只幼虫的速率添加到产蛋鸡的饲料中，持续6周。所有黑水虻幼虫在喂食前都用无菌蒸馏水冲洗以去除表面残留的粪便。在饲养期间，保持适当的温度（25°C）和湿度（60%），光照时间为16小时，黑暗时间为8小时。在整个实验过程中，收集粪便、鸡的肠道内容物、黑水虻以及供黑水虻饲养的基质的样本以供后续分析。所有动物实验均获得了华南农业大学动物实验委员会的批准（SYXK2014–0136）。实验结束时，所有动物通过二氧化碳窒息法安乐死，并将其尸体焚烧。

2.2. 物理化学指标检测
醋酸的测定首先称取1克样品，放入15毫升离心管中，然后加入5毫升纯水，进行30分钟的超声波提取。样品在-4°C下冷冻2小时，然后在4500 rpm下离心10分钟。最后，使用0.45微米膜过滤器过滤溶液，并通过高效液相色谱法（HPLC, Agilent 1200）进行分析。分析使用C18柱（250 × 4.6 mm, 0.5 μm），在30°C下进行，流动相为甲醇和0.01 mol/L磷酸氢钾（pH = 2.55）（3:97, v/v），流速为0.6 mL/min，检测使用VWD检测器，在210 nm处进行，进样体积为30 μL。硝酸盐氮（NO3--N）使用1 M KCl溶液提取，并根据国家标准HJ 634–2012通过分光光度法进行测定。
多西环素浓度的测定参考了先前的研究，样品经过预处理后使用液相色谱-质谱法（LC-MS）进行分析（Liu et al., 2023）。简要来说，0.5克粪便样品用2.5毫升1 M KCl溶液提取2次，通过涡旋辅助均质化（5分钟）和冰浴超声处理（15分钟）。离心（13,000 × g, 6分钟, 4°C）后，合并的上清液通过预处理的萃取柱（Waters, USA）纯化，依次用甲醇和超纯水活化。柱子被洗涤（1毫升超纯水），真空干燥，然后用3毫升2%甲酸甲醇溶液洗脱。洗脱液通过0.22微米过滤器过滤到琥珀色小瓶中，并使用LC-MS（AB Sciex API 4000）通过离子转移445.0 → 428.02进行多西环素定量。

2.3. DNA提取和qPCR
细菌DNA使用QIAamp? DNA Stool Mini Kit（QIAGEN, Hilden, Germany）从粪便和肠道内容物样品中提取，而堆肥样本使用Fast DNA Spin Kit for soil（MP Biomedicals, America）提取。
噬菌体DNA的提取基于之前的研究并进行了一些修改。为了避免细胞裂解和细胞内DNA的释放，将3克粪便或肠道内容物样品与30毫升PBS缓冲液在管式滚筒上端到端旋转30分钟（4°C）。这种温和的提取方法有效释放噬菌体，同时保持宿主细胞的完整性。混合后，将溶液在4000 g下离心15分钟以获得上清液。上清液通过低蛋白结合的0.45 μm和0.22 μm过滤器（Millex-GP, Millipore, Bedford, MA, USA）过滤，使噬菌体通过而细菌被留在过滤器上。含有噬菌体的滤液通过蛋白质浓缩器（100-kDa Amicon Ultra离心过滤单元, Millipore, Bedford, MA）在4000 g下浓缩。浓缩后，为了消除噬菌体颗粒外的游离DNA，将浓缩的噬菌体溶液与DNase（100 U/mL）混合并在37°C下孵育1小时。随后，在75°C的水浴中加热10分钟以使DNase失活，最后使用TIANamp Virus DNA/RNA Kit（TIANGEN DP315, Beijing, China）提取噬菌体DNA。
使用Bio-Rad CFX96 PCR系统（Bio-Rad, USA）进行绝对定量，所使用的基因引物序列列在表S1中。反应程序与之前相同（Deng et al., 2023）。

2.4. 16S rRNA测序
16S rRNA检测由北京诺基因科技有限公司完成，具体步骤如下。使用含有条形码的特定引物扩增不同区域（16S V3-V4）的16S rRNA基因。热循环 protocol 包括一个初始的变性步骤，即在 98°C 下加热 1 分钟，随后是 30 个循环：每个循环包括在 98°C 下变性 10 秒，在 50°C 下退火 30 秒，在 72°C 下延伸 30 秒，最后在 72°C 下保持 5 分钟。然后，将 PCR 产物以等量混合。混合后的 PCR 产物使用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen，德国）进行纯化。根据制造商的协议，使用 TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina，美国）构建测序文库，并包含索引代码。文库的质量使用 Qubit@ 2.0 Fluorometer（Thermo Scientific）和 Agilent Bioanalyzer 2100 系统进行评估。最终，在 Illumina NovaSeq 平台上进行测序，生成 250 bp 的双端读取序列。测序数据已存放在 NCBI 数据库中，BioProject ID 为 PRJNA1344882.2.5。

统计分析：所有数据，包括物理化学数据和 q-PCR 结果，均使用 Microsoft Excel 2019（Microsoft，美国）进行分析，统计显著性通过 SPSS 22.0（IBM Corp，美国）确定。16S rRNA 测序数据使用 QIIME（V1.9.1）软件进行分析。结果使用 GraphPad Prism 10.1.2、R（版本 4.1.3）和 Adobe Illustrator 软件进行可视化。图中的所有误差条代表标准偏差（SD）。

3. 结果与讨论
3.1. 多西环素（DOX）喂养对产蛋鸡粪便中 CH4 和 N2O 相关功能基因的影响
为了研究长期在畜牧业中使用 DOX 是否会影响产蛋鸡粪便中 CH4 和 N2O 的排放潜力，我们构建了一个长期 DOX 喂养模型，如图 1A 所示。喂养 30 天后，我们测量了粪便中的 DOX 浓度，结果为 12.69 ± 0.69 mg/kg（表 S2）。这与先前的文献报告一致（Peng 等，2016），表明我们的模型构建成功。正如先前的文献所报道的，经过长期的抗生素适应后，不仅粪便中的抗生素残留量相对稳定，粪便中的微生物群落也达到了相对稳定状态（Knoop 等，2016）。某些厌氧细菌可以从各种底物产生 CH4，其中乙酸代谢途径是细菌产生 CH4 的主要和重要代谢途径（图 S1）。因此，我们重点关注了粪便中的乙酸含量。如图 1B 所示，长期喂养 DOX 的产蛋鸡粪便中的乙酸含量（177.86 ± 25.7 μmol/g）显著高于对照组（83.09 ± 0.64 μmol/g）。这表明长期 DOX 暴露对产蛋鸡的肠道微生物群产生了代谢毒理学效应，显著增强了它们的乙酸积累能力——乙酸是生成甲烷的关键前体——从而为 DOX 引起的 CH4 排放潜力增加提供了物质基础。接下来，我们进行了定量 PCR（qPCR）来分析细菌和噬菌体中的 CH4 相关功能基因。尽管古菌是 CH4 的主要生产者，但噬菌体在水平转移（HGT）中起着重要作用，因此噬菌体中的功能基因也值得关注（Gonzalez-Villalobos 和 Balcazar，2022a；He 和 Loffler，2024）。我们主要关注之前提到的关键基因 mcrA 和 pmoA，它们参与乙酸向 CH4 的代谢（Rocca 等，2015）（图 S1）。如图 1C 和 S2 所示，长期 DOX 处理后，粪便中细菌和噬菌体中的 mcrA 基因含量显著高于对照组，细菌和噬菌体中的 pmoA 基因含量也更高。这表明长期使用 DOX 显著增加了细菌和噬菌体中 CH4 相关功能基因的丰度。然而，如前所述，CH4 的产生是多个基因共同作用的结果，mcrA/pmoA 的比例可以很好地指示 CH4 排放潜力（Li 等，2017）。因此，我们计算了 mcrA/pmoA 的比例，如图 1D 所示，DOX 处理组的比例显著高于对照组。这表明长期喂食 DOX 增加了产蛋鸡粪便的 CH4 排放潜力。这一结论与先前的研究发现一致（Zhe 等，2024）。接下来，使用相同的策略，我们测量了鸡粪便中 N2O 前体物质 NO3--N 的含量（图 S1）。如图 1E 和 S2 所示，DOX 处理组粪便中的 NO3--N 含量（47.27 ± 0.56 μg/g）显著高于对照组（45.14 ± 0.26 μg/g）。然后，我们量化了参与 N2O 代谢的相关功能基因，即 norB、nosZ、nirS、nirK 和 narG（Maeda 等，2011）（图 S1）。如图 1F 所示，处理组细菌和噬菌体中这些基因的丰度与对照组相比有显著差异。值得注意的是，我们没有在噬菌体中检测到 norB 基因，这可能表明携带 norB 基因的特定菌株没有发生 HGT。这可能是因为针对携带 norB 的特定细菌的噬菌体主要是裂解型噬菌体，或者这些噬菌体没有能力包装 norB（de Sousa 等，2023）。同样，为了研究这些基因变化对实际 N2O 产生的影响，我们计算了 (nirS+nirK)/nosZ 的比例，该比例可以估计 N2O 的产生量（Xiong 等，2022）。如图 1G 所示，DOX 处理组的比例显著高于对照组。这表明长期喂食 DOX 增加了产蛋鸡粪便的 N2O 排放潜力。此外，DOX 组中显著升高的 nirS 基因是 (nirS+nirK)/nosZ 比例显著增加的主要原因。相关研究表明，nirS 基因在 N2O 排放中起主导作用，进一步证实了 N2O 排放增加的可能性（Maeda 等，2017）。接下来，为了研究噬菌体在细菌 CH4 和 N2O 代谢中的 HGT 贡献，我们分析了这些基因在噬菌体中的比例与细菌中的比例。如图 1H、1I 和 S3 所示，DOX 也导致噬菌体中相关功能基因的比例发生变化。对于 CH4，DOX 显著增加了噬菌体中 mcrA 基因的丰度，这可能有助于细菌处理组中 mcrA/pmoA 比例的显著增加。对于 N2O，DOX 组中 nosZ 基因的减少可能更多地导致了 (nirS+nirK)/nosZ 比例的增加。此外，我们量化了噬菌体中的细菌 16S 基因，这可以代表噬菌体整体获得的 HGT（Sander 和 Schmieger，2001）。如图 1J 和 S3 所示，DOX 处理组噬菌体中获得的基因整体比例减少，这也可以解释噬菌体中 nosZ 基因的减少。总体而言，长期在产蛋鸡产业中使用 DOX 可能显著增加产蛋鸡粪便中 CH4 和 N2O 的排放潜力。这些功能基因丰度的显著增加主要归因于多西环素引起的细菌群落失调。然而，这些温室气体（GHG）相关功能基因在噬菌体中的富集证实了噬菌体介导的 HGT 作为 DOX 引起毒理学效应的关键辅助机制，放大并传播这些遗传特征，进一步提高了 GHG 排放潜力。研究表明，抗生素的滥用不仅通过增加细菌耐药性影响生态环境，从而威胁人类健康，随着集约化养殖方式的发展，还会加剧对全球气候变化的影响（Gonzalez-Villalobos 和 Balcazar，2022）。

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图 1. 长期喂食 DOX 的产蛋鸡粪便中与 CH4 和 N2O 相关的功能基因的变化。(A) 实验流程图。(B) 乙酸含量。(C) 以热图形式显示的细菌/噬菌体中 CH4 相关功能基因（mcrA 和 pmoA）的绝对丰度（以 2 为底的对数数据).(D) 鸡粪便中 mcrA 和 pmoA 的绝对丰度比。(E) NO3--N 含量。(F) 以热图形式显示的细菌/噬菌体中 N2O 相关功能基因（narG、nirK、nirS、norB 和 nosZ）的绝对丰度（以 2 为底的对数数据).(G) 鸡粪便中 (nirK+nirS) 的绝对丰度比。(H) 以饼图形式显示的噬菌体中 CH4 相关功能基因的比例（以 2 为底的对数数据).(I) 以饼图形式显示的噬菌体中 N2O 相关功能基因的比例（以 2 为底的对数数据).(J) 以饼图形式显示的噬菌体中 16S 基因的比例（以 2 为底的对数数据）。所有实验均进行了三次生物学重复（n = 3）。* 表示在 0.05 水平上的显著差异，** 表示在 0.01 水平上的显著差异。

3.2. DOX 对 BSF 堆肥过程中 CH4 和 N2O 相关功能基因的影响
无害处理畜禽粪便是资源利用的必要步骤（Zhang 等，2022）。为了研究受 DOX 污染的畜禽粪便在 BSF 处理过程中 CH4 和 N2O 相关功能基因的变化，我们构建了 BSF 堆肥模型，如图 2A 所示，并检查了堆肥产物中的 CH4 和 N2O 排放相关指标。我们还测量了堆肥产物中的残留 DOX。如表 S2 所示，残留量为 3.77 ± 0.58 mg/kg，保留率为 29.7%。这与先前的研究一致，表明粪便成功通过了 BSF 的堆肥过程（Cai 等，2024）。对于乙酸，与鸡粪便类似，DOX 组有机肥料中的乙酸含量（154.12 ± 3.06 μmol/g）显著高于对照组（112.61 ± 14 μmol/g）（图 2B）。这表明经 BSF 堆肥后的有机肥料仍然保持了与未堆肥鸡粪便一致的趋势；值得注意的是，DOX 处理组和对照组之间的差异小于原始产蛋鸡粪便中的差异。在处理组中，细菌中的 mcrA 基因丰度显著高于对照组（图 2C 和 S4），这是处理组中 mcrA/pmoA 比例显著高于对照组的原因（图 2D）。这表明 DOX 的存在导致 BSF 处理产蛋鸡粪便时 CH4 排放潜力增加。此外，我们在有机肥料中的噬菌体中几乎检测不到 CH4 相关功能基因，可能是因为 BSF 具有重塑产蛋鸡粪便中微生物群落的能力。据推测，这一过程可能消除了能够整合 mcrA 和 pmoA 基因的宿主，导致噬菌体数量减少（Awasthi 等，2024）。然而，BSF 是否直接重塑了粪便中噬菌体的结构尚待进一步研究。对于 N2O，处理组中的 NO3--N 含量（24.17 ± 0.55 μg/g）显著低于对照组（27.61 ± 0.25 μg/g）（图 2E）。这表明经 BSF 堆肥后的有机肥料具有增强的硝化能力或减弱的反硝化能力（Li 等，2024）。在处理组中，细菌和噬菌体中的大多数 N2O 相关功能基因显著增加（图 2F 和 S4），这也证实了有机肥料中微生物群落的硝化能力增强。然而，处理组中 (nirS+nirK)/nosZ 比例显著低于对照组（图 2G），表明用 BSF 处理受抗生素污染的产蛋鸡粪便可以有效减少 N2O 的排放潜力。尽管处理组的整体硝化能力增强，但 N2 生成能力也增加了（如 nosZ 丰度的显著增加所示），这是处理组中 (nirS+nirK)/nosZ 比例显著降低的主要原因。先前的研究也表明，使用细菌固体发酵剂（BSFs）可以有效降低(nirS+nirK)/nosZ基因比率，并减少N2O的排放（Xiang等人，2024年）。接下来，我们分析了噬菌体中功能基因的比例，如图2H、I、J和S5所示。噬菌体不参与与CH4相关的功能基因的表达，但它们显著增加了与N2O生成相关的nosZ基因的比例。处理组噬菌体中的16S基因组装量也略高于对照组，表明处理组噬菌体中的基因组装总体丰度高于对照组。总体而言，在抗生素存在的情况下，使用BSFs进行堆肥可以有效降低N2O的排放潜力。尽管处理组的CH4排放潜力仍高于对照组，但与未经处理的鸡粪相比已经显著降低。因此，利用BSFs处理畜禽粪便以获得有机肥料不仅是一种将大量畜禽粪便转化为腐殖质的有效方法，也是减少受抗生素污染的畜禽粪便在堆肥过程中产生温室气体的有效手段（Manan等人，2024年）。下载：下载高分辨率图像（374KB）下载：下载全尺寸图像

图2. 在BSF堆肥过程中细菌/噬菌体中与CH4和N2O相关功能基因的变化。(A) 实验流程图。(B) 醋酸含量。(C) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的细菌/噬菌体中与CH4相关功能基因（mcrA和pmoA）的绝对丰度热图。(D) 有机肥料中mcrA和pmoA的绝对丰度比率。(E) NO3--N含量。(F) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的细菌/噬菌体中与N2O相关功能基因（narG、nirK、nirS、norB和nosZ）的绝对丰度热图。(G) 有机肥料中(nirK+nirS)与nosZ的绝对丰度比率。(H) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的噬菌体中CH4相关功能基因的比例饼图。(I) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的噬菌体中N2O相关功能基因的比例饼图。(J) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的噬菌体中16S基因的比例饼图。所有实验均进行了三次生物学重复（n=3）。*表示在0.05水平上有显著差异，**表示在0.01水平上有显著差异。

3.3. 不同处理对BSF肠道中与CH4和N2O相关功能基因的影响
BSFs的另一种资源利用途径是将其转化为昆虫蛋白质，这可以增加经济收益（Cammack等人，2021年）。过去的研究表明，虽然BSFs可以减少某些抗生素抗性基因（ARGs），但它们作为ARGs转移载体的作用也不容忽视（Chen等人，2022年）。因此，尚不清楚它们是否对温室气体相关功能基因也有类似的转移效应，以及这是否会导致全球气候变化。在实际生产中，BSFs作为蛋白质饲料通常是通过干燥和粉化处理的，而不是直接喂食（Daifuku等人，2024年）。此外，我们认为BSFs转移类似ARGs基因的能力是由于部分未消化的肠道内容物，我们还提出了一种涉及饥饿处理的加工方法。如图3A所示，获得了8种不同的BSFs处理方法。在这些处理方法中，B组的醋酸含量最高，其次是A组（图3B）。mcrA基因和pmoA基因在不同处理组之间存在差异（图3C和S6），并且在BSFs中的噬菌体中未检测到mcrA或pmoA基因，这与在有机肥料中发现的结果一致。B组的mcrA/pmoA比率也显著高于A组和其他组（图3D），主要是由于B组中pmoA基因的减少。这表明在抗生素存在的情况下，BSFs携带或转移与CH4相关功能基因的能力更强，从而导致更高的CH4排放潜力。65°C加热8小时结合24小时饥饿预处理对DOX诱导的温室气体排放潜力具有显著的协同毒性风险缓解作用。这是因为高温干燥可以使BSF中的大多数DOX诱导的温室气体相关微生物失活（Wang等人，2022年），而饥饿处理可以减少BSF肠道中携带功能基因的微生物的数量（Xu等人，2019年），这种联合预处理比单独处理具有更全面的缓解效果。对于NO3--N，A组和C组的水平最高，其次是B组和D组，而E组、F组、G组和H组的水平较为均匀且较低（图3E）。(nirS+nirK)/nosZ的比率与这一观察结果一致（图3G），这主要与A组、B组和C组中nosZ基因的较低丰度有关（图3F和S6）。对于BSFs的硝化功能，高温干燥处理可以显著减轻DOXs引起的效应，而饥饿处理的效果较为温和。如图3H、3I和S7所示，噬菌体中相关功能基因的比例表明，噬菌体也不参与CH4代谢（图3H）。然而，在N2O代谢方面，除了norB基因外，其他基因的比例相当高，特别是nirK基因（图3I）。这表明噬菌体在BSFs内部促进硝化过程的能力很强。值得注意的是，噬菌体中16S基因的丰度出人意料地高（图3J和S7C），表明BSFs噬菌体中的基因整合程度很高。这可能与BSFs作为昆虫的优势有关，即噬菌体的总体丰度相对较高（Chen等人，2019年；Tangkawanit和Ardburai，2023年）。总体而言，抗生素的存在影响了BSFs肠道内容物中与CH4和N2O相关的代谢基因，这种趋势与从BSFs获得的有机肥料一致，表明CH4排放潜力可能增加，同时在一定程度上减少了N2O的排放潜力。饥饿和干燥/粉化处理都可以有效降低CH4和N2O的排放潜力，尤其是干燥/粉化处理。

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图3. 不同BSF肠道细菌/噬菌体中与CH4和N2O相关功能基因的情况。(A) 实验流程图。“空”表示在饲养7天后让BSF经历24小时的禁食期以清除肠道内容物；“全喂食”表示不进行禁食处理。“粉状”表示将BSF在65°C的对流烤箱中干燥8小时，然后用粉碎机研磨，而“新鲜”昆虫则未进行任何处理。(B) 醋酸含量。(C) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的细菌/噬菌体中与CH4相关功能基因（mcrA和pmoA）的绝对丰度热图。(D) BSF肠道内容物中mcrA和pmoA的绝对丰度比率。(E) NO3--N含量。(F) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的细菌/噬菌体中与N2O相关功能基因（narG、nirK、nirS、norB和nosZ）的绝对丰度热图。(G) BSF肠道内容物中(nirK+nirS)与nosZ的绝对丰度比率。(H) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的噬菌体中CH4相关功能基因的比例饼图。(I) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的噬菌体中N2O相关功能基因的比例饼图。(J) 以（以2为底数的）对数数据形式显示的噬菌体中16S基因的比例饼图。所有实验均进行了三次生物学重复（n=3）。相同的字母表示组间无显著差异（P>0.05），而不同的字母表示有显著差异（P<0.05）。

3.4. 喂食BSFs对产蛋鸡粪便中与CH4和N2O相关功能基因的影响
在BSFs的资源利用过程中，其生物质成分主要用作水产养殖和家禽的饲料（Ahmad等人，2024年）。为了进一步研究不同BSF处理作为饲料对所喂养动物粪便中CH4和N2O排放的影响，我们使用之前获得的不同BSF处理方法来喂养产蛋鸡，以建立一个动物实验模型（图4A）。在分析产蛋鸡粪便时，发现所有含有抗生素的组中的醋酸水平显著升高，特别是在未经处理的B组（图4B）。关于与CH4相关基因的丰度，不同的BSF处理方法对粪便有显著影响，B组中的mcrA基因在细菌和噬菌体中均显著升高（图4C和S8）。这也可能解释了B组中观察到的较高mcrA/pmoA比率（图4D）。这表明直接喂食在含抗生素基质上生长的BSFs可能会增加畜禽粪便中的CH4排放潜力。值得注意的是，经过65°C干燥8小时结合24小时饥饿预处理后，H组的CH4排放潜力（0.05±0.02）比未经处理的含DOX的B组（0.59±0.07）降低了91.1%，证实了联合预处理的协同毒性风险缓解效果。这一结果与关于直接喂食DOXs的第一部分研究结果相似。在BSFs中检测到的与CH4排放相关的指标与喂食BSFs的鸡粪便中的指标并不完全一致，特别是在干燥和粉化组（E、F、G和H），这些组似乎失去了一些有效的减少能力。这表明BSFs中携带的抗生素或改变的微生物群落可能促成了这一现象（Lin等人，2023年）。关于N2O，B组的NO3--N水平最高（图4E）。在相关基因的丰度方面，噬菌体显示出与细菌相似的基因丰度模式（图4F和S8）。nirS基因的高丰度是(nirS+nirK)/nosZ比率升高的主要原因（图4G）。同样，H组的N2O排放潜力（0.05±0.02）较B组（0.59±0.07）降低了82.4%（p<0.05），进一步验证了联合预处理在缓解DOX诱导的毒性效应方面的可靠性。值得注意的是，我们在细菌中几乎检测不到norB基因，这可能是因为这种减少过程是由其他亚基如norC完成的（Sakurai等人，2017年）。关于噬菌体在转移与CH4相关功能基因方面的贡献，噬菌体中的mcrA基因比例高于pmoA基因，特别是在A组和C组（图4H和S9A），表明噬菌体也有助于甲烷的生成。关于噬菌体在转移与N2O相关功能基因方面的贡献，E组中narG、nirS和nosZ基因的比例较高（图4H和S9B）。然而，噬菌体的整体基因组包装与BSFs中的情况完全相反（图4J和S9C），这可能与噬菌体与细菌之间的拮抗相互作用有关，导致它们的丰度出现权衡（Wang等人，2022年）。总体而言，抗生素的存在增加了喂食BSFs的产蛋鸡粪便中CH4和N2O的排放潜力。尽管与BSFs本身相比，饥饿和干燥/粉化处理的效果有所减弱，但它们仍然显示出一定程度的减少。因此，在将BSFs作为蛋白质资源利用的过程中，有必要对其实施质量控制。

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图4.在不同底物处理下喂养的产蛋鸡粪便中，与CH4和N2O相关的功能基因。(A) 实验流程图。(B) 醋酸含量。(C) 以热图形式显示细菌/噬菌体中与CH4相关的功能基因(mcrA和pmoA)的绝对丰度（以2为底的对数数据）。(D) 在喂养BSF的产蛋鸡粪便中mcrA和pmoA的绝对丰度比值。(E) NO3--N含量。(F) 以热图形式显示细菌/噬菌体中与N2O相关的功能基因(narG、nirK、nirS、norB和nosZ)的绝对丰度（以2为底的对数数据）。(G) 在喂养BSF的产蛋鸡粪便中(nirK+nirS)和nosZ的绝对丰度比值。(H) 以饼图形式显示噬菌体中与CH4相关的功能基因的比例（以2为底的对数数据）。(I) 以饼图形式显示噬菌体中与N2O相关的功能基因的比例（以2为底的对数数据）。(J) 以饼图形式显示噬菌体中16S基因的比例（以2为底的对数数据）。所有实验均进行了三次生物学重复（n=3）。相同的字母表示组间无显著差异（P>0.05），不同的字母表示有显著差异（P<0.05）。此外，为了进一步验证功能基因所表征的温室气体潜在变化，我们还使用了来自所有不同阶段的样本进行了相关性分析。结果显示，CH4的前体物质醋酸与细菌中的mcrA/pmoA比值呈显著正相关，而N2O的前体物质NO3--N与(nirS+nirK)/nosZ比值呈显著正相关。因此，这种实验方法可以达到表征CH4和N2O排放潜力的目的。

3.5. 影响CH4和N2O相关功能基因的细菌微生物群落分析
细菌群落结构的变化通常会影响基因的丰度（Liu等人，2024年）。为了研究不同样本中CH4和N2O相关功能基因产生的原因，我们对不同样本进行了16S rRNA测序，以探索细菌微生物群落的结构变化。我们进行了主成分分析（PCA），首先观察到长期喂养DOX的鸡粪便中的微生物群落结构与对照组有显著差异（图5A）。这很可能是由于DOX的长期存在，破坏并重建了粪便中的微生物群落（Pham等人，2024年），这可能是影响CH4和N2O排放潜力的主要原因。从BSFs获得的有机肥料中的微生物群落结构在含有抗生素的组和对照组之间也有显著差异（图5B）。这表明，当鸡粪中含有DOX时，它们对微生物群落结构的影响即使在用BSFs堆肥后产生的有机肥料中仍然存在。这也表明，鸡粪中增加的温室气体排放潜力同样反映在有机肥料中。值得注意的是，有机肥料中微生物群落结构的变化也会影响植物的根际土壤（Deng等人，2023年）。这反过来可能会进一步增加植物栽培过程中的温室气体排放。在不同处理下的BSFs中的微生物群落结构也有所不同（图5C）。携带nirS基因的Bacteroidota和Cyanobacteria的丰度增加是(nirS+nirK)/nosZ比值上升的主要原因。在有机肥料中，Bacteroidota是影响mcrA/pmoA和(nirS+nirK)/nosZ比值的主要门类（图5F）。在BSFs中，影响CH4排放潜力的主要门类是Bacteroidota，而影响N2O排放潜力的门类包括Actinobacteria、Bacteroidota、Campylobacterota、Desulfobacterota和Firmicutes（图1G）。在喂养BSFs的鸡粪便中，影响CH4和N2O排放潜力的主要微生物与初始鸡粪中的显著不同，其中Actinobacteriota是主要参与的门类。先前的研究表明，Actinobacteriota与碳和氮循环有显著关联（Liu等人，2023年；Tang等人，2024年），这表明由于抗生素暴露导致的Actinobacteriota丰度的变化可能是影响全球气候变化的重要因素。

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图5. 细菌微生物群落结构和细菌功能基因
相关性分析。(A-D) 分别分析了鸡粪、有机肥料、BSF以及喂养BSF的鸡粪中的微生物群落结构的PCA图。(E-H) 分别分析了鸡粪、有机肥料、BSF以及喂养BSF的鸡粪中CH4和N2O相关功能基因与细菌门级丰度的相关性。所有实验均进行了三次生物学重复（n=3）。*表示0.05水平上的显著差异，**表示0.01水平上的显著差异，***表示0.001水平上的显著差异。

3.6. DOX驱动的噬菌体对CH4和N2O相关功能基因传递的贡献
噬菌体的水平基因转移（HGT）能力在食物链中的基因传递中起着重要作用（Szczepankowska和Lobocka，2024年）。因此，噬菌体在资源利用过程中的环境影响也值得注意。首先，我们建立了噬菌体、CH4和N2O相关功能基因、物理化学指标以及细菌之间的关系。如图6A所示，除了未检测到的norB基因外，噬菌体中的每个CH4和N2O相关功能基因都与细菌OTUs以及细菌中的CH4和N2O相关功能基因显著相关。这进一步验证了噬菌体确实在功能基因的水平转移中起作用（Gonzalez-Villalobos和Balcazar，2022b）。醋酸与mcrA和pmoA基因均呈显著负相关，而mcrA基因与pmoA基因呈显著正相关。这表明携带mcrA和pmoA基因的噬菌体可能是同一类型。此外，NO3--N与几乎所有N2O相关功能基因均呈正相关。这表明噬菌体也可能在促进硝化过程中发挥作用（Coutinho等人，2020年）。关于DOX，它与其他基因没有显著相关性，除了narG基因。这表明DOX并不直接影响噬菌体；相反，它可能通过间接破坏细菌群落结构来影响噬菌体内的相关功能基因（Leclerc等人，2022年）。为了更清楚地研究在“鸡粪-有机肥料”和“鸡粪-BSF-鸡”资源利用过程中噬菌体中包含的CH4和N2O相关功能基因的流动变化，我们构建并分析了一个Sankey图。首先，在“鸡粪-有机肥料”路径中，未检测到噬菌体中的CH4相关功能基因（图6B），因为我们认为噬菌体不参与这一过程中的CH4排放。在“鸡粪-BSF-鸡”路径中，如图6C所示，在DOX的影响下，噬菌体对产蛋鸡粪便中mcrA/pmoA比值的贡献显著增加。随后，mcrA/pmoA的贡献值也传递到了在含有抗生素的基质中生长的BSF中，并且这一趋势延续到了喂养BSF的鸡的粪便中。在“鸡粪-有机肥料”路径中，由于DOX导致噬菌体对(nirS+nirK)/nosZ的高贡献值在用BSFs堆肥后显著下降，表明这种堆肥过程可以有效降低DOX升高的N2O排放潜力（图6D）。相反，在“鸡粪-BSF-鸡”路径中（图6E），来自含有抗生素的产蛋鸡粪便的噬菌体中(nirS+nirK)/nosZ的高贡献值通过BSF和喂养BSF的产蛋鸡继续传递，最终导致新的产蛋鸡粪便中(nirS+nirK)/nosZ的贡献值持续较高。这些结果表明，抗生素的存在影响了资源利用过程中噬菌体对CH4和N2O相关功能基因的水平转移贡献。

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图6. DOX驱动的噬菌体对CH4和N2O相关功能基因传递的贡献。(A) 噬菌体中影响CH4和N2O的功能基因的思维分析。(B) “鸡粪-有机肥料”路径中没有检测到与CH4相关的功能基因。(C) “鸡粪-BSF-鸡”路径中噬菌体对mcrA/pmoA的贡献。(D) “鸡粪-有机肥料”路径中噬菌体对(nirS+nirK)/nosZ的贡献。(E) “鸡粪-BSF-鸡”路径中噬菌体对(nirS+nirK)/nosZ的贡献。所有实验均进行了三次生物学重复（n=3）。*表示0.05水平上的显著差异，**表示0.01水平上的显著差异，***表示0.001水平上的显著差异。

总体而言，DOX在禽类粪便中的持续存在不仅增加了温室气体排放，还威胁到了BSF衍生饲料的安全性（Zhang等人，2021年）。然而，干燥和饥饿处理有效地减少了这些风险，表明它们有可能被整合到禽类废物管理方案中，以符合现代禽类生产的“同一健康”框架。此外，噬菌体的HGT作用也不容忽视，因为它们对CH4和N2O相关功能基因的贡献在抗生素的影响下也发生了显著变化。因此，实施BSFs的质量控制措施对于减轻资源利用的负面影响尤为重要。未来的研究应评估BSF处理饲料对禽类健康参数的长期影响，如产蛋效率、肠道微生物群组成和抗生素抗性基因转移。这些数据对于优化基于BSF的循环经济模型在禽类产业中的应用至关重要。值得注意的是，我们的研究是通过公认的遗传指标（例如mcrA/pmoA和(nirS+nirK)/nosZ比值）来推断温室气体排放潜力的变化，而不是直接测量气体通量。虽然这些分子工具在预测代谢潜力方面非常强大，但未来结合气相色谱的研究对于直接量化大气影响至关重要。此外，在噬菌体颗粒中检测到功能基因虽然强烈表明了HGT潜力，但并不构成原位转导事件的直接证据。

4. 结论
长期暴露于DOX会导致产蛋鸡粪便中的微生物群落受到毒性干扰，从而提高CH?和N?O的排放潜力——这种毒性效应在整个BSF处理过程中持续存在。虽然BSF堆肥有效地降低了DOX引起的N?O排放潜力，但与未受污染的对照组相比，CH?的排放潜力仍然较高。使用在DOX污染的粪便中培育的BSF作为饲料会使鸡粪便中的这些温室气体排放潜力进一步增加，但24小时饥饿结合65°C干燥预处理BSF可以有效降低这种毒性风险（CH?减少91.1%，N?O减少82.4%）。我们的发现表明，噬菌体介导的水平基因转移是一个关键的辅助调节机制，放大了DOX引起的毒性效应。因此，将BSF预处理集成到禽类养殖系统中提供了一种实际的全毒理学风险控制策略，以遏制DOX驱动的农业气候和环境风险，这与联合国的可持续发展目标一致——符合生态毒理学和环境安全的核心范围。

RediT作者贡献声明
Wei-Kang Deng：撰写——原始草案、可视化、方法论、概念化。
Xin-Di Liao：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取。
Si-Cheng Xing：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理。
Jing-yuan Chen：软件、方法论、调查。
Shi-Yin Xie：验证、方法论、调查。
Yi-heng Deng：验证、方法论、调查。