6-羟基香豆素（来自Artemisia lavandulaefolia）通过行为抑制和线粒体功能障碍，在Solenopsis invicta（红火蚁）体内引发多种毒性反应

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：6-Hydroxycoumarin from Artemisia lavandulaefolia Induces Multimodal Toxicity in Solenopsis invicta via behavioral inhibition and mitochondrial disruption

　　荣超罗 | 周恩来 | 明琪吴 | 德祥尹 | 离力 | 成杰徐 | 希高 | 国星吴 | 敬王 | 梅布布·侯赛因 | 有你查 | 德强秦
中国云南省农业大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明650500

**摘要**
红火蚁（Solenopsis invicta）是一种全球性的入侵物种，对生态系统和经济造成了严重影响。随着传统化学控制方法的局限性日益明显，植物源杀虫剂成为了一个有前景的替代方案。本研究确定6-羟基香豆素（6-hydroxycoumarin）是来自薰衣草叶蒿（Artemisia lavandulaefolia）的关键杀虫化合物，并系统地阐明了其多机制毒性。该化合物表现出强烈的胃毒性（LC?? = 55.144 mg/L，在72小时时），在125 mg/L浓度下会导致完全的行为紊乱，消除抓握/行走能力，并几乎抑制所有聚集/攀爬活动。代谢组学分析显示广泛的代谢紊乱，尤其是CYP450介导的外来物质代谢途径受到显著干扰。相应的酶谱检测证实CYP450活性降低了23%，同时GST、CarE和SOD活性增加了119–422%。组织病理学和超微结构检查发现中肠上皮细胞发生损伤，线粒体 cristae 分解，细胞出现空泡化。这些发现共同表明6-羟基香豆素通过同步抑制行为能力、破坏代谢功能、抑制CYP450酶活性以及诱导细胞凋亡途径来导致死亡，使其成为可持续管理红火蚁的有效植物源杀虫剂。

**1. 引言**
红火蚁（Solenopsis invicta Buren）是一种全球性入侵物种，在其入侵区域造成了严重的生态和经济损失。由于其侵略性强的殖民特性，红火蚁会降低农业生产效率，破坏灌溉基础设施，并通过毒液和对生态系统的破坏对人类和动物健康构成重大威胁（Ascunce等人，2011年；Calcaterra等人，2008年）。目前的管理策略主要依赖于合成杀虫剂，如吲哚卡巴（indoxacarb）和氢化甲基萘（hydramethylnon），这些方法能够迅速控制红火蚁，但面临着抗药性进化、环境污染和非目标生物毒性的挑战（Calcaterra等人，2008年；Sakamoto和Goka，2021年）。因此，在综合害虫管理（IPM）框架内开发环保替代品的需求日益迫切，而植物源杀虫剂因其结构多样性、生物降解性和较低的生态足迹而成为可持续的选择（Isman，2005年；Pavela和Benelli，2016年）。

植物提取物已显示出对红火蚁的显著杀虫效果。例如，从黄檀豆（Sophora flavescens）中分离出的马汀（matrine）和索福卡平（sophocarpine）具有显著的毒性（7天LC??分别为71.49 mg/L和85.87 mg/L），并且在亚致死浓度下会干扰红火蚁的扩散行为（Tian和Zhang，2023年）。同样，菖蒲（Acorus calamus）中的α-和β-阿萨酮（α- and β-asarone）也具有毒性和驱虫效果（Kafle和Shih，2017年）；来自阿格拉蒂纳腺草（Ageratina adenophora）的天然生物活性化合物（如黄檀素（safranal）和二氢香豆素（dihydrocoumarin）也对红火蚁具有毒性和驱虫效果（Wu等人，2025年）。尽管取得了这些进展，但来自东亚的药用植物薰衣草叶蒿（Artemisia lavandulaefolia DC）的生物活性在控制红火蚁方面的研究仍不足。这种植物以其广泛的药理特性而闻名，包括抗菌、抗炎和抗氧化作用（Bisht等人，2021年），其精油成分（尤其是1,8-桉叶油烯、查玛祖琳和β-石竹烯）对储藏产品害虫（如锯齿木蠹Lasioderma serricorne）具有强效杀虫作用（Zhou等人，2018年）。然而，目前尚未对其粗提物或其成分针对红火蚁的活性进行全面评估。属于菊科的薰衣草叶蒿能够产生多种次生代谢物，包括萜类、黄酮类和香豆素，其中许多成分具有已记录的杀虫活性（Ding等人，2021年）。结合其对其他节肢动物的已知生物活性，薰衣草叶蒿成为探索控制这种入侵蚂蚁的有效候选植物。

植物源杀虫剂通常根据核心生物活性骨架进行分类，包括生物碱、萜类和香豆素。其中，香豆素（1,2-苯并吡喃酮类）是一类结构多样化的化合物，具有多方面的杀虫活性。这些化合物通过抑制食欲、神经毒性和调节生长等方式干扰昆虫生理，靶向关键的代谢途径，如细胞色素P450（CYP450）介导的解毒作用（El-Sayyad等人，2020年；Kirsch等人，2016年；Serra等人，2012年；Wu等人，2025年）。例如，吡喃香豆素对Lucilia cuprina具有拒食作用（Mukandiwa等人，2013年），而香豆素衍生物可导致Spodoptera frugiperda幼虫死亡（Vera等人，2006年），对桃蚜（Myzus persicae）具有急性毒性（LC?? = 1.3 mg/L，Pavela等人，2019年），并对红火蚁工蚁具有致死作用（Hussain等人，2025年）。关键的是，香豆素通过竞争性结合CYP450酶的活性位点来抑制其活性，从而破坏解毒能力并引发氧化应激（Liu等人，2016年；Sridar等人，2008年；Xia等人，2023年）。这种机制协同作用使香豆素成为新型杀虫剂开发的高价值骨架。

尽管具有这些特性，化合物“6-羟基香豆素”虽然在其他植物物种（如Prangos pabularia，Farooq等人，2014年）中已有报道，但之前在薰衣草叶蒿中尚未被鉴定。我们的初步代谢组学分析证实了其在薰衣草叶蒿叶提取物中的存在，但其对红火蚁的杀虫效果和作用机制仍不清楚。鉴于迫切需要可持续的火蚁管理工具，本研究结合行为学、代谢组学、基因表达（qPCR）和组织病理学分析，量化了6-羟基香豆素对红火蚁的毒性，阐明了其对聚集、运动和抓握行为的影响，并揭示了相关的代谢紊乱、CYP450基因表达和中肠超微结构损伤。这项研究可为6-羟基香豆素作为多模式植物源杀虫剂提供机制洞察，对其在综合害虫管理（IPM）策略中的应用具有很高的转化潜力。

**2. 材料与方法**
2.1. 昆虫和植物采集
红火蚁群体采集自中国昆明云南省农业大学（25°03′36.90″N，102°42′1.45″E；海拔1912.9米）。根据Li等人（2025年）的方法，在聚乙烯容器（40 × 30 × 10厘米）中以26 ± 2°C、70%相对湿度及12:12光周期条件下进行饲养。在14天的适应期内，为稳定蚁巢提供10%（重量/重量）的蜂蜜水，随后添加蜂蜜水和Tenebrio molitor幼虫。在生物测定前6小时停止供应食物。薰衣草叶蒿植物在同一地理位置的生长期采集（植株高度：50–60厘米）。凭证标本存放在云南省生物资源保护与利用国家重点实验室（凭证编号AL-2024–001）。
2.2. 化学试剂
天然生物活性化合物6-羟基香豆素（纯度>98%）购自上海Aladdin生化技术有限公司（中国上海）。HPLC级甲醇、乙腈和甲酸购自Merck公司（德国）。醋酸铵和无水乙醇购自天津富晨化学试剂厂（中国天津）。
2.3. 薰衣草叶蒿提取物的制备
根据Salinas-Sánchez等人（2012年）的方法制备乙醇提取物，略有修改。将植物部分阴干、置于60°C oven中脱水4小时，然后研磨成40目粉末。将研磨后的生物量（30克）用95%乙醇（体积比1:10）进行超声辅助提取（Branson 3800，40kHz，60分钟，25°C）。滤液通过旋转蒸发（40°C，60rpm）浓缩，并用95%乙醇（1克/毫升）复溶，储存在4°C。用于鉴定6-羟基香豆素和其他香豆素的代谢组学分析的色谱和光谱数据见后续部分（第2.6节）。
2.4. 毒性评估
将粗提物（浓度范围62.5–500 mg/L）和6-羟基香豆素（从1000 mg/L甲醇溶液中制备，浓度为31.25–500 mg/L）稀释到15%（重量/体积）的蜂蜜水中。浓度梯度是基于初步范围测试建立的，并遵循常规的二倍系列稀释方法。这种方法常用于初步毒性筛选，以有效确定有效剂量范围（LC??）并观察显著的毒理学和行为学趋势。每组5–7只工蚁（n = 20/重复）被放置在玻璃烧杯（9 × 6厘米）中，并置于装有棉塞的微离心管（1.5毫升）中。对照组接受乙醇平衡的蜂蜜水。溶液在控制条件下每天更新（25 ± 1°C，70 ± 5%相对湿度，12:12光周期）。每隔24小时记录一次死亡率，持续120小时（n = 3次重复；每处理组60只蚂蚁）。死亡率通过Abbott公式进行校正。
2.5. 红火蚁的行为学测定
使用修改后的Fu等人（2023年）协议，评估红火蚁在暴露于粗提物（浓度范围62.5–500 mg/L）和6-羟基香豆素（浓度范围31.25–500 mg/L）后的聚集、抓握和攀爬行为。所有行为测定中，对照组仅接受溶剂（如2.4节所述的乙醇平衡蜂蜜水），与处理组相同但不含测试化合物。连续五天每天观察，采用完全随机设计，每个重复组有3个独立重复（n = 20只工蚁）。重复次数和每个重复的样本量基于已建立的社会昆虫行为测定方法，足以检测处理组之间的统计学差异（Li等人，2025年；Wu等人，2025年）。
- **聚集率**：轻轻搅动蚁群以分散工蚁。5秒后统计物理接触的蚂蚁数量（≥3只）。聚集率计算公式为：聚集率（%）= (p1/p2) × 100%。其中，p1 = 聚集的工蚁数量，p2 = 实验中的工蚁总数。
- **抓握能力**：将蚂蚁放置在垂直方向的滤纸上（210 × 297毫米），以90°/秒的速度旋转180°。保持接触的个体计为阳性。抓握率计算公式为：抓握率（%）= (q1/q2) × 100%。其中，q1 = 具有抓握能力的工蚁数量，q2 = 实验中的工蚁总数。
- **攀爬能力**：将蚂蚁转移到直径2毫米、长度15厘米的垂直木桩上。5秒内垂直位移≥3厘米（记录频率为120帧/秒）定义为攀爬能力。攀爬率计算公式为：攀爬率（%）= (q1/q2) × 100%。其中，q1 = 具有攀爬能力的工蚁数量，q2 = 实验中的工蚁总数。
- **行走能力**：将蚂蚁放置在直径10厘米的圆形 arena中。持续行走≥3秒定义为阳性行走。行走率计算公式为：行走率（%）= (q1/q2) × 100%。其中，q1 = 具有行走能力的工蚁数量，q2 = 实验中的工蚁总数。
注：每次实验后，蚂蚁被放回原始烧杯中。
2.6. 薰衣草叶蒿的代谢组学分析
**提取**：在初步毒性筛选后，由于其对红火蚁的优异杀虫活性，选择其叶提取物进行详细的非靶向代谢组学分析（见结果3.1.1）。样品提取物使用UPLC-ESI-MS/MS系统（UPLC，Waters Acquity I-Class PLUS；MS，Applied Biosystems QTRAP 6500+）进行分析。分析条件如下：
- **UPLC**：色谱柱Waters HSS-T3（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）；流动相A为含有0.1%甲酸和5 mM醋酸铵的纯水，流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈。样品测量采用梯度程序，开始条件为98% A，2% B，保持1.5分钟；随后逐渐增加至50% A，50% B；再逐渐减少至2% A，98% B，保持1分钟；最后调整至2% A，98% B，保持1分钟。流速设定为每分钟0.35毫升；柱温设定为50°C；进样体积为2微升。流出物连接到ESI-triple quadrupole-linear ion trap（QTRAP）-MS系统。
**LC-MS/MS分析**：ESI源操作参数如下：源温度550°C；离子喷射电压（IS）5500 V（正离子模式）/ -4500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI）、气体II（GSII）和 curtain气体（CUR）分别设定为50、55和35 psi；碰撞激活解离（CAD）设置为中等强度。使用10和100 μmol/L的聚丙烯糖醇溶液进行仪器调谐和质量校准，分别采用QQQ和LIT模式。QQQ扫描作为MRM实验，碰撞气体（氮气）设置为中等强度。根据不同时间段洗脱的代谢物，选择特定的MRM跃迁进行监测（Wang等人，2016年）。
**数据分析**：将原始峰面积信息归一化后进行后续分析。使用主成分分析和Spearman相关性分析评估组内样本和质控样本的重复性。在KEGG、HMDB和LipidMaps数据库中搜索鉴定化合物的分类和通路信息。根据分组信息计算差异倍数，使用T检验计算每种化合物的差异显著性p值。使用R语言包ropls进行OPLS-DA建模，并进行200次置换检验以验证模型的可靠性。采用多重交叉验证方法计算模型的VIP值。结合差异倍数、p值和VIP值来筛选差异代谢物。筛选标准为FC > 1，p值 < 0.05且VIP值 > 1。使用超几何分布检验计算KEGG通路的差异代谢物的富集显著性。**S. invicta 代谢反应的分析**

为了捕捉与显著死亡率开始相关的代谢状态，选择了72小时的时间点进行代谢组学分析。这一时间点的选择基于之前的毒性试验（图1、图2、图3、图4e），这些试验显示在48小时到72小时之间死亡率呈现出急剧的、浓度依赖性的增加，表明在毒理学反应上发生了关键转变。在72小时时间点，即在死亡发生之前，收集了暴露于6-羟基香豆素的工蚁和对照组工蚁，并立即将其迅速冷冻在液氮中以保存体内代谢状态。从整个蚂蚁身体（0.1克）中提取了代谢物（n=6个生物重复实验）。

**图1. A. lavandulaefolia的粗乙醇提取物对S. invicta的毒性和行为影响。** 使用含有A. lavandulaefolia根、茎和叶提取物的蜂蜜水喂养的S. invicta的死亡率分别为500、250、125和62.5毫克/升浓度。

**图2. ** 使用含有A. lavandulaefolia叶乙醇粗提取物的蜂蜜水喂养的S. invicta的聚集率（a）、攀爬率（b）、抓握率（c）和行走率（d）分别为500、250、125和62.5毫克/升浓度。

**图3. ** A. lavandulaefolia叶提取物的KEGG富集分析。

**图4. ** 6-羟基香豆素对S. invicta的毒性和行为影响。** 给S. invicta喂食含有6-羟基香豆素的蜂蜜水 mixture（浓度为31.25、62.5、125、250、500毫克/升），并记录死亡率（e）、聚集率（a）、攀爬率（b）、行走率（c）和抓握率（d）。

**代谢物提取：** 用于代谢组学分析的LC/MS系统由Waters Acquity I-Class PLUS超高性能液相色谱仪和Waters Xevo G2-XS QTof高分辨率质谱仪组成。使用了Waters Acquity UPLC HSS T3柱（1.8微米×2.1×100毫米）。正离子模式：流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈。负离子模式：流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈。注射体积为2微升。

**LC-MS/MS分析：** Waters Xevo G2-XS QTOF高分辨率质谱仪可以在MassLynx V4.2（Waters公司）的控制下以MSE模式收集一级和二级质谱数据。在每次数据采集周期中，可以同时进行低碰撞能量和高碰撞能量的双通道数据采集。低碰撞能量范围为10-40伏特，扫描频率为0.2秒/质谱。ESI离子源的参数如下：毛细管电压：2500伏特（正离子模式）或-2000伏特（负离子模式）；锥形电压：30伏特；离子源温度：100摄氏度；还原气体流速：50升/小时；脱溶剂气体流速：800升/小时。

**MassLynx V4.2获得的原始数据使用Progenesis QI软件进行峰值提取、峰值对齐和其他数据处理步骤。** 代谢物的鉴定是通过与在线METLIN数据库、公共数据库以及Progenesis QI中的内部库进行匹配，并结合理论碎片离子分析完成的。

**2.8 基因表达分析：** 按照Zhang等人的方法（2016年）提取总RNA（BGMG Fast Total RNA Kit），逆转录（PrimeScript? RT Kit），并通过qPCR（SYBR? Premix Ex Taq?）进行分析。根据其在昆虫中的异生物质解毒作用（特别是在膜翅目中）以及初步筛选或相关转录组研究中观察到的差异表达模式，选择了七种CYP450基因（CYP6AS165、CYP369A2、CYP301A1、CYP4BW10、CYP9P26、CYP336A45、CYP4CY5v1）进行qPCR验证。使用S. invicta的内部参考转录基因GAPDH进行初步标准化和定量。qPCR实验条件：94℃，30秒，40个循环（94℃ 10秒，56℃ 10秒，72℃ 10秒）。熔解曲线根据Eco48设置，实验生物学上重复3次，技术上重复3次，数据分析采用2-??CT方法。

**2.9 S. invicta的酶活性：** 细胞色素P450（CYP450）、谷胱甘肽S转移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性使用商业试剂盒（北京Box Biotechnology有限公司，中国）进行定量。分析样本为均匀化的蚂蚁组织（0.1毫克，pH 7.4磷酸盐缓冲液）。

**2.10 组织病理学和凋亡分析：** 使用光学显微镜观察6-羟基香豆素对蚂蚁中肠的影响。将暴露于6-羟基香豆素（浓度分别为55毫克/升[T1]和110毫克/升[T2]，时间72小时）的蚂蚁的中肠固定于4%甲醛中，然后进行石蜡包埋和切片（4微米）。切片用苏木精-伊红（H&E）染色，并在明场显微镜（Nikon Eclipse E100）下观察。凋亡检测使用In Situ Cell Death Detection Kit（Servicebio）进行。切片与蛋白酶K（20微克/毫升，37℃，20分钟）孵育，随后与dTd酶-dUTP混合物（37℃，60分钟）孵育。细胞核用DAPI复染。荧光信号（TUNEL+：绿色；DAPI：蓝色）使用Nikon Eclipse C1显微镜捕获。

**TEM观察：** 中肠组织先在2.5%戊二醛（4℃，24小时）中固定，然后在1%锇四氧化物中后固定，并嵌入Epon 812中。超薄切片（70纳米）用尿嘧啶酰乙酸/柠檬酸铅染色，并在80千瓦电子显微镜（Hitachi HT7800）下观察。

**2.11 统计分析：** 所有统计分析均使用SPSS软件（版本27.0）进行。对于毒性和行为试验，数据以平均值±标准误差（S.E.）的形式呈现。每个时间点不同处理组间的差异通过单因素方差分析（ANOVA）进行分析。对于ANOVA显示显著效应（p<0.05的情况），使用Tukey的HSD检验进行不同处理组与溶剂对照组之间的后续比较。显著差异（p<0.05）在图中用不同的小写字母表示。半数致死浓度（LC50）值及其95%置信区间使用Probit回归分析计算。

**对于非靶向代谢组学数据，** 使用多标准方法识别6-羟基香豆素处理组和对照组之间的差异代谢物。来自正交投影到潜在结构的判别分析（OPLS-DA）的VIP（变量重要性）得分大于1.0的代谢物，以及绝对倍数变化（FC）大于1.5的代谢物被认为具有进一步的意义测试。双尾Student's t检验的p值使用Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）校正进行调整。满足VIP > 1.0、FC > 1.5和FDR校正后的p值（q值）< 0.05标准的代谢物被定义为显著差异丰富的代谢物。所有图表均使用GraphPad Prism软件（版本10.1.2）生成。

**3 结果：**

**3.1 A. lavandulaefolia提取物的毒性和行为抑制：**
**3.1.1 对S. invicta的浓度和时间依赖性毒性**
A. lavandulaefolia的乙醇提取物在根、茎和叶组织中对S. invicta工蚁表现出显著的毒理学效应（图1a-c）。死亡率表现出浓度依赖性和时间依赖性，500毫克/升的提取物在72小时内导致所有植物部分的死亡率超过50%。到120小时时，该浓度下的致死率超过90%。Probit分析显示叶提取物具有最高的效力，其LC50为127.403毫克/升（95% CI：96.471–161.799毫克/升），显著低于根（158.983毫克/升；CI：121.133–206.729毫克/升）和茎提取物（258.824毫克/升；CI：210.270–325.529毫克/升；p<0.05，Tukey's HSD）（表1）。值得注意的是，第5天时叶提取物在500毫克/升浓度下达到了98.33%的死亡率，证明了其优异的杀虫活性。**

**表1. 120小时处理A. lavandulaefolia乙醇提取物后的LC50值和毒性回归方程。**

**位置**
**毒性回归方程**
logLC50
LC50 (mg/L)
95%置信区间
显著性

**根**
y = -6.1667 + 2.9167x
2.20
158.983
121.133–206.729
0.833

**茎**
y = -9.6667 + 2.9167x
2.41
258.824
210.270–325.529
0.415

**叶**
y = -6.83 + 3.33x
2.10
127.403
96.471–161.799
0.289

**3.1.2 行为抑制：**
与死亡率同时，叶提取物引起了严重的行为障碍（图2a-d）。聚集能力随剂量增加而下降，从第5天的62.5毫克/升开始显著抑制（对照组为80%，p<0.05）。在500毫克/升浓度下，第5天聚集能力几乎完全消失（1.67%±1.67%）。同样，攀爬能力也表现出浓度依赖性的抑制，500毫克/升时下降到0%，而对照组为91.67%。抓握和行走能力也表现出类似的恶化，在500毫克/升时完全消失（对照组为95%）。这些发现表明A. lavandulaefolia可以通过神经肌肉损伤干扰基本的群体维持行为。

**3.2 A. lavandulaefolia的代谢组学分析：**
对表现出最高杀虫活性的A. lavandulaefolia叶提取物进行代谢组学分析，鉴定出1474种代谢物，这些代谢物被分类为18个类别，包括萜类、黄酮类、生物碱、氨基酸、有机酸、糖和醇、脂类、多酚、核苷酸、酮类、醛类、酸类、苯丙素类、香豆素类、甾醇类、醌类、木质素类、维生素类、黄酮酮类和其他激素。萜类化合物的代谢物最多，有237种；黄酮酮类的代谢物最少，只有4种。鉴定出的化合物通过KEGG数据库进行注释和分类，发现差异代谢物主要分布在8个主要的代谢途径中，分别是：氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅因子和维生素代谢、其他氨基酸代谢、核苷酸代谢、翻译。其中，代谢物最多的代谢途径是其他次级产物代谢，共有92种；而代谢物最少的代谢途径是辅因子和维生素代谢，只有10种（图3）。

**通过非靶向代谢组学分析，** 从“各种植物次级代谢物的生物合成”途径中鉴定出八种潜在的杀虫化合物（表2），主要是萜类和醌类，其中1-O-乙酰-牛蒡内酯（峰值为72,988,657.46）的丰度最高，其次是6-羟基香豆素（峰值为6637,408.62）。尽管其丰度较低，但由于香豆素对真社会性昆虫的已知疗效及其抑制CYP450的潜在结构作用（Hussain等人，2025年；Wu等人，2025年），6-羟基香豆素被优先进一步评估。本研究中鉴定出的香豆素化合物的完整数据见补充材料3。

**表2. A. lavandulaefolia粗乙醇提取物中含有的具有杀虫活性的物质。**

| 序列号 | 物质 | 主要分类 | 次要分类 | 峰值 |
| ---- | ---- | ---- | ---- |
| 1 | 1-O-乙酰-牛蒡内酯 | 萜类 | 72,988,657.46 |
| 2 | 6-羟基香豆素 | 香豆素 | 6637,408.62 |
| 3 | 3-表牛儿烯酸 | 萜类 | 33-表氧stonequinone | 7930,32.92 |
| 4 | 1,4-蒽醌 | 黄酮类 | 5545,38.87 |
| 5 | 苯醌 | 醌类 | 3356,34.34 |
| 6 | 叔丁基-p-苯醌 | 醌类 | 3301,55.02 |
| 7 | 3-甲基-9H-咔唑-2-醇 | 生物碱 | 6124,7.92 |
| 8 | 3-乙酰-oleanolic acid | 萜类 | 8893.86 |

**3.3 6-羟基香豆素对S. invicta的毒性和行为效应：**
**3.3.1 致死性和时间动态：**
生物活性化合物6-羟基香豆素对S. invicta工蚁表现出显著的毒性（图4e）。72小时时的LC50为55.144毫克/升（95% CI：37.655–72.655毫克/升），死亡率随剂量和时间增加（表3）。在62.5毫克/升浓度下，第5天的累积死亡率达到了76.67%，而对照组仅为5%（p<0.001）。同样，在第7天，即使是在低浓度62.5毫克/升下，死亡率也上升到了80%。在第7天，500毫克/升浓度下的致死率上升到100.00%。**

**表3. 3天处理后6-羟基香豆素的LC50值。**

**毒性回归方程**
logLC50
LC50 (mg/L)
95%置信区间
y = 2.432 + 1.396x
1.742
55.144
37.655–72.655

**3.3.2 行为表型崩溃：**
行为试验显示了全面的 incapacitation（图4a-d）。对于经过7天处理的对照组，聚集率（图4a）、攀爬率（图4b）、行走率（图4c）和抓握率（图4d）均高于80%。然而，在31.25毫克/升的处理后，S. invicta的聚集率、攀爬率、抓握率和行走率分别下降了28.33%、21.67%、23.33%和46.67%。在更高剂量500毫克/升的6-羟基香豆素处理下，第5天的聚集率为0%，攀爬率和抓握率为0%，行走率在第2天下降到0%（p<0.05）。这种逐步的行为失败表明神经毒性作用先于死亡，可能干扰了突触传递或肌肉协调。

**3.4 6-羟基香豆素引起的S. invicta系统代谢失调：**
为了阐明6-羟基香豆素杀虫机制背后的代谢扰动，在S. invicta工蚁暴露于LC50浓度72小时后进行了非靶向代谢组学分析。主成分分析（PCA）显示处理组（DX6）和对照组（CK）之间存在明显的代谢分离，主成分1（PC1）解释了47.16%的总方差，PC2解释了19.41%的方差（图5a）。两种成分的明显分离表明6-羟基香豆素暴露后代谢景观发生了根本性改变。正交投影到潜在结构的判别分析（OPLS-DA）进一步确认了代谢的显著差异（R2Y = 0.983，Q2 = 0.921），处理组和对照组分布在95%置信区间之外（图5b）。这种多变量建模有效地过滤了非区分性的代谢特征，同时放大了处理相关的变异，验证了分析方法的有效性。6-羟基香豆素处理72小时后S. invicta的非靶向代谢组学分析。(a) 差异代谢物的主成分分析，(b) OPLS-DA评分图，(c) 分类注释图，(d) 火山图，(e) KEGG通路富集分析；(f) 药物代谢-细胞色素P450代谢通路中的差异代谢物：A：Glycinexylidide；B：5-苯基-1,3-恶唑烷-2,4-二酮；C：可待因-6-葡萄糖醛酸酯；D：他莫昔芬；E：卡马西平；F：2-正丙基-4-戊烯酸；G：去甲基西酞普兰；H：非巴米特；I：3-氨基甲酰-2-苯基丙酸；J：4-羟基-5-苯基四氢-1,3-恶唑-2-酮；K：2-正丙基-2,4-戊二烯酸；(g) 细胞色素P450对外源性物质的代谢通路中的差异代谢物：A：5-(3-吡啶基)-2-羟基四氢呋喃；B：黄曲霉毒素B1二醛；C：4-氧代-1-(3-吡啶基)-1-丁酮；D：2-S-谷胱甘肽乙酸酯；E：4-(N-亚硝基甲基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮；F：α-[3-亚硝基氨基)丙基]-3-吡啶甲醇；G：4-[(羟甲基)亚硝基氨基]-1-(3-吡啶基)-1-丁酮。火山图可视化（图5d）量化了1085种差异丰富的代谢物（VIP >1.0；倍数变化阈值 >1.5；p < 0.05），包括327种上调和758种下调的代谢物。差异丰度的大小对应于点的大小，较大的标记代表VIP值超过2.0的代谢物（占特征的68.3%），表明识别具有高信心度。这种深刻的代谢重编程展示了6-羟基香豆素破坏S. invicta核心生化过程的能力。KEGG通路注释（图5c，e）将这些差异代谢物分为20条显著富集的代谢通路（超几何检验；p < 0.05，FDR校正），其中氨基酸代谢（占差异代谢物的28.1%）、脂质代谢（18.7%）和外源性物质生物降解（15.6%）占比较高。关键的是，在显著富集的通路中，主要的解毒系统受到了严重损害。对S. invicta代谢组的分析显示，这些包括：药物代谢 - 细胞色素P450（图5f）：在11种差异调控的代谢物中，有8种显著下调，包括Glycinexylidide和他莫昔芬。三种代谢物上调：可待因-6-葡萄糖醛酸酯、卡马西平和去甲基西酞普兰。细胞色素P450对外源性物质的代谢（图5g）：所有7种注释的代谢物均被抑制，包括黄曲霉毒素B1二醛和4-(N-亚硝基甲基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮。谷胱甘肽代谢：12种代谢物中有9种下调，特别是亲电底物的谷胱甘肽结合物。在最重要的解毒通路中具体的代谢物变化详见图5f和5g。CYP450介导的解毒通路的协调抑制（通路代谢物下调）表明对外源性物质的处理能力受损，可能导致有毒中间体的积累。这些结果证实6-羟基香豆素针对S. invicta的核心代谢功能，对与杀虫剂抗性相关的酶促解毒系统具有特定作用。

3.5. 与S. invicta相关的CYP450基因的qPCR分析
定量实时PCR分析显示，6-羟基香豆素暴露后S. invicta中的细胞色素P450（CYP450）基因表现出浓度依赖性的失调（p < 0.05，Tukey's HSD）。在2 × LC50（T2 = 110 mg/L）时，观察到CYP6AS165（图6a）、CYP369A2、CYP301A1、CYP4BW10和CYP9P26（图6c-f）显著上调。相反，在1 × LC50（T1 = 55 mg/L）暴露时，CYP336A45（图6b）和CYP4CY5v1（图6g）的表达显著下调。这种双功能转录反应表明了异构体特异性敏感性，反映了在外源性物质解毒通路中的不同作用。

3.6. 6-羟基香豆素处理下S. invicta的酶活性
酶活性测定显示，6-羟基香豆素暴露后S. invicta的解毒系统发生了显著变化（图7）。细胞色素P450（CYP450）在LC50浓度（T1 = 55 mg/L；p < 0.05与对照组[CK]相比）活性下降，而在T1和2 × LC50（T2 = 110 mg/L）处理之间没有显著差异（图7d）。相反，在6-羟基香豆素LC50处理后，谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性逐渐增加。当6-羟基香豆素的浓度增加到2 × LC50时，酶活性显著增加，表明对外源性物质压力的抗氧化和解毒反应有所补偿（图7a-c）。

3.7. 6-羟基香豆素处理下的S. invicta组织病理学观察
6-羟基香豆素暴露后，对S. invicta中肠组织的病理学评估显示了浓度依赖性的超微结构损伤（图8a）。对照组样本（CK）表现出特征性的结构：连续的上皮单层，紧密粘附的柱状细胞，明显的刷状边界，以及基底定位的核，显示出均匀的苏木精亲和力。相比之下，处理组显示出剂量依赖性的病理变化，T1浓度引发了初始的上皮损伤，包括细胞脱离和组织紊乱。在T2浓度下观察到更严重的效应，其中广泛的上皮脱落进入肠腔和明显的组织间隙。

4. 讨论
S. invicta的全球扩散继续带来严重的生态和经济负担，需要开发可持续的多目标控制剂，以克服传统合成杀虫剂的局限性（Isman，2006；Sakamoto和Goka，2021）。S. invicta生态成功的基础在于其高度协调的社会行为——聚集以进行防御和体温调节，攀爬以觅食和探索巢穴，抓取以捕获猎物和运输幼虫，以及行走以获取资源（Ascunce等人，2011）。

4.1. 杀虫活性的鉴定
对A. lavandulaefolia提取物的植物化学分析显示，其对S. invicta具有剂量依赖性的杀虫活性，其中乙醇叶提取物（500 mg/L）在处理后5天显示出卓越的效力（98.3%的死亡率）。值得注意的是，这些提取物几乎完全破坏了基本的社交行为（聚集、攀爬、抓取和运动）。随后的靶向代谢组学分析确定了6-羟基香豆素——一种来自植物次级代谢物生物合成途径的次级代谢物——作为主要的生物活性成分，其选择基于其记录的杀虫特性和与目标的相互作用结构能力。虽然6-羟基香豆素本身的杀虫活性很少有文献记载，但相关的香豆素衍生物显示出显著的生物活性。例如，二氢香豆素对S. invicta具有毒性（Hussain等人，2025），其他天然香豆素通过抑制解毒酶对鳞翅目害虫如Spodoptera litura具有毒性（Xia等人，2023）。我们的研究现在确定6-羟基香豆素对入侵蚂蚁S. invicta具有强效的多模态毒性，突显了其作为植物杀虫剂骨架的潜力。

4.2. 6-羟基香豆素在S. invicta中的毒理学效应
昆虫的中肠是营养吸收、外源性物质代谢和微生物共生的关键节点，因此是杀虫干预的主要目标（Hakim等人，2010；Wu等人，2023）。我们综合的组织病理学和超微结构研究表明，6-羟基香豆素选择性地对这一重要器官系统造成严重破坏。光学显微镜分析揭示了中肠上皮的剂量依赖性退化，而TUNEL/DAPI共染色证实了伴随的凋亡，表现为渐进的核碎裂（蓝色荧光）和凋亡小体的形成（绿色/青色）（图8b）。透射电子显微镜（TEM）阐明了这种病理的细胞亚基基础，揭示了线粒体的超微结构破坏——包括嵴的破坏和基质的空泡化。作为氧化磷酸化的主场所，线粒体的崩溃导致ATP的灾难性耗竭，危及基本的解毒和细胞稳态（Galluzzi等人，2018）。受损的线粒体产生过多的活性氧（ROS），建立一个自我放大的氧化损伤循环，加剧细胞损伤并激活程序性细胞死亡级联（Lushchak等人，2018；Xia等人，2023）。从抗性机制的角度来看，线粒体功能与昆虫抗性之间的关系主要表现在以下几个方面。首先，线粒体编码基因的转录调控直接参与对杀虫剂压力的响应。研究表明，在氯吡硫磷压力下，三种蜻蜓物种的线粒体蛋白编码基因（例如COI、ND1、ND2、ND4和Cytb）的转录水平显著上调，ND4在所有测试物种中均一致上调，表明其作为关键应激响应基因的潜力（Chen等人，2025）。同样，线粒体编码的基因已被证实介导东方果蝇（Bactrocera dorsalis）的杀虫剂耐受性（Jiang等人，2023）。其次，线粒体定位的P450酶有助于代谢抗性。在棕色飞虱Nilaparvata lugens中，线粒体特异性P450基因CYP419A1通过可变剪接和过度表达赋予对乙虫啉的耐受性，代表了一种不同于经典CYP3/4家族的新型代谢抗性机制（Zeng等人，2025）。最后，线粒体呼吸链本身是重要的杀虫剂靶点。在柑橘红螨Panonychus citri中，线粒体复合物I的PSST亚单位中的突变（H107R和V103I）已被证明与对METI-I类杀虫剂的抗性密切相关；值得注意的是，这些突变同时降低了复合物I的活性和ATP水平，并导致繁殖力和运动能力的下降（Shafiei Alavijeh等人，2020）。在抗DDT的Drosophila melanogaster 91-R品系中，221个线粒体相关基因表现出差异表达，包括线粒体P450基因Cyp12d1-p和Cyp12a4的上调，表明抗性品系可能利用ROS调节途径来应对DDT引起的氧化压力（Steele等人，2018）。我们在S. invicta中肠细胞中观察到的严重线粒体超微结构损伤（图9）与这些新出现的研究范式一致。这表明6-羟基香豆素对线粒体的靶向不仅驱动急性毒性，还可能与参与杀虫剂抗性的基本途径相互作用。

综合代谢组学分析表明，6-羟基香豆素在S. invicta中诱导了广泛的代谢重编程，对外源性物质解毒系统造成了特别严重的后果。主成分分析（PCA）和正交投影到潜在结构-判别分析（OPLS-DA）揭示了显著的代谢分离，鉴定出1085种显著改变的代谢物（327种上调，758种下调）。通路富集分析突出显示了CYP450介导的解毒功能的灾难性破坏，例如：药物代谢-细胞色素P450：8/11种差异丰富的代谢物下调（例如，Glycinexylidide、他莫昔芬）；细胞色素P450对外源性物质的代谢：所有7种注释的代谢物均被抑制（例如，黄曲霉毒素B1二醛）。酶的阻滞可能是由于6-羟基香豆素直接与CYP450血红素中心相互作用，这与bergamottin（CYP3A4）和scopoletin（CYP6B）观察到的抑制机制相似（Sridar等人，2008；Liu等人，2016）。通过损害I期解毒（解毒过程的关键第一步），这种抑制导致了未代谢毒素的致命积累。

与观察到的代谢抑制相反，qPCR分析显示在T2浓度下多个CYP450基因（CYP6AS165、CYP369A2、CYP301A1、CYP4BW10和CYP9P26）显著上调，只有CYP4CY5v1显示下调。这与文献中记录的昆虫防御机制一致（Li等人，2002；Siddiqui等人，2022）。II期解毒酶（GST、CarE）和超氧化物歧化酶（SOD）的协调诱导反映了系统性但不充分的抗氧化反应。谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的显著增加（图7a-c）代表了S. invicta对外源性物质攻击的经典多方面防御机制。GST和CarE是关键的第二期解毒酶，它们将（可能由I期CYP450代谢受损产生的）反应性中间体结合成更易溶于水的可排泄形式。SOD的诱导是一种直接的响应，旨在减轻6-羟基香豆素引起的ROS水平升高和氧化应激。这种模式，即特定解毒和抗氧化基因/酶的诱导是严重压力的生物标志物，而不是有效的抵抗力，在接触强效植物毒素的昆虫中已有记录（例如，Pavela等人，2019年；Xia等人，2023年）。在较高浓度（T2）下，CYP450酶活性受到抑制（图7d）与多个CYP450基因的转录上调（图6a, c-f）之间的明显差异值得注意。这种模式在毒理学中并不罕见，可能作为一种 compensatory cellular response（补偿性细胞反应）。6-羟基香豆素对CYP450酶的直接抑制可能是通过与其活性位点的竞争性结合来实现的，从而导致功能缺陷。作为响应，昆虫可能会激活转录反馈机制，试图合成新的酶蛋白以克服这种抑制，这种现象在其他外源物质中也观察到（Li等人，2002年；Siddiqui等人，2022年）。然而，如果新合成的酶也易受持续存在的6-羟基香豆素的抑制，或者蛋白质的翻译/功能成熟受到损害，那么这种诱导的基因表达可能不足以恢复功能活性。因此，观察到的基因上调可能代表了一种应激反应，但最终被该化合物的强效和持续的抑制作用所压倒，从而导致代谢解毒能力的净下降，这一点通过代谢组学和酶学数据得到了证实。从机制上看，CYP450的抑制可能导致：氧化还原失衡：反应性中间体的积累和电子流动的破坏（Zanger和Schwab，2013年）；线粒体功能障碍：ROS介导的ETC组分损伤（Zorov等人，2014年）；凋亡级联：细胞色素c的释放和caspase的激活（Galluzzi等人，2018年）。我们提出了一个模型，在该模型中，最初的CYP450抑制和随后的线粒体功能障碍可能会进入一个自我放大的循环，最终可能导致中肠上皮细胞的崩溃。这一模型得到了营养吸收和解毒能力受损（与代谢失调相关）、屏障功能受损以及凋亡途径被诱导（与超微结构和TUNEL检测结果相关）的观察结果的支持。尽管这些事件之间的确切时间和因果关系需要进一步研究，但它们的同时发生为6-羟基香豆素的强大杀虫效力提供了多方面的解释。值得注意的是，这种机制与香豆素的抗癌活性类似（Kirsch等人，2016年），同时显示出对社会性昆虫的独特选择性（Xia等人，2023年）。我们的发现表明，6-羟基香豆素迅速且严重地破坏了S. invicta的重要社会行为。在低至125毫克的浓度下，该化合物在7天内完全消除了抓握和行走能力，同时将聚集和攀爬行为减少到对照水平的1.67%。这种深刻的神经肌肉麻痹发生在LC50以下（72小时时的浓度为55.144毫克/升），表明其主要通过干扰乙酰胆碱信号传导或电压门控钠/钾通道来发挥神经毒性作用（Cassereau等人，2017年；Richardson等人，2019年）。即使在更低的关键浓度下（31.25毫克/升），几乎完全丧失了协调运动能力，从而损害了群体的觅食效率、育幼能力和防御反应。这种早期的行为崩溃通过在死亡发生之前削弱群体生存能力，提供了相对于传统神经毒性杀虫剂的战略优势。观察到的效果与其他生物活性香豆素的作用一致，包括在S. frugiperda中的黄烷醇（Vera等人，2006年）和在S. invicta中的沙芬醇（Wu等人，2025年），这突显了香豆素衍生物作为下一代社会性昆虫控制剂的潜力。综合我们的发现，6-羟基香豆素是一种针对S. invicta具有多重分子靶点的高效植物杀虫剂。其多模式作用机制——同时破坏神经肌肉功能、代谢解毒和细胞稳态——使其效果优于传统的单一靶点合成杀虫剂（LC50 = 72小时时的55.144毫克/升），同时降低了抗性风险（Isman，2005年；Pavela和Benelli，2016年）。6-羟基香豆素在72小时时的LC50为55.144毫克/升，与其他测试过的针对S. invicta的植物化合物相比具有优势，如马亭（LC50=71.49毫克/升，7天）（Tian和Zhang，2023年）、α/β-阿萨隆（显著的死亡率和驱避效果）[7]、沙芬醇（显著的毒性）（Kafle和Shih，2017年）以及含有秋水仙碱的球茎粉（5000毫克/升时54.67%的死亡率，3天）（Lin等人，2020年）。虽然香叶醇内酯是A. lavandulaefolia提取物中最丰富的化合物（表2），但由于6-羟基香豆素已证明的杀虫效力和CYP450抑制潜力（Kirsch等人，2016年；Serra等人，2012年；Wu等人，2025年；Hussain等人，2025年），因此被优先考虑。我们的结果证实了这一选择，揭示了一种具有明确和多方面作用方式的强效化合物。作为可持续管理工具的潜力要求考虑其环境命运和生态安全性，这是任何植物杀虫剂候选物的关键方面。尽管关于6-羟基香豆素的特定数据有限，但可以从相关的香豆素中获得见解。关于环境持久性，一些羟基香豆素衍生物易受微生物降解（例如，通过醇脱氢酶途径），表明其在环境中的积累有可能减少（Krik?taponis等人，2021年）。然而，某些香豆素在水处理过程中可以转化为稳定的卤代副产物，这突显了进行化合物特异性命运研究的必要性（Liu等人，2024年）。关于非靶效应的初步证据令人鼓舞；某些羟基香豆素作为蚊子吸引剂的现场应用没有报告在操作浓度下对非目标昆虫造成显著急性伤害（Andrianjafy等人，2018年）。这些间接数据表明6-羟基香豆素可能具有良好的环境特性，但这仍是一个待验证的假设。在田间应用之前，必须解决关键的研究缺口，包括关于降解动力学、土壤迁移性、渗出潜力以及6-羟基香豆素对有益土壤生物和传粉者的慢性毒性的明确研究。此外，其对本地非目标蚂蚁种类的潜在影响尚未探索，这些蚂蚁在生态系统中发挥着重要的工程师、捕食者和种子传播者的作用。这是一个重要的数据缺口，因为本地蚂蚁可能通过直接接触或营养传递接触到该化合物。尽管我们的当前研究为其杀虫效力建立了坚实的基础，但对这些环境参数的同时调查是将其整合到可持续IPM策略中的关键下一步。本研究提供了确凿的证据，证明来自A. lavandulaefolia的天然6-羟基香豆素是一种对入侵性S. invicta非常有效的植物杀虫剂。其效力源于一种独特的综合机制，包括快速神经肌肉麻痹、靶向抑制CYP450介导的解毒途径以及线粒体功能障碍的诱导，最终导致中肠细胞凋亡。这种多方面的攻击不仅确保了高致死性，而且在亚致死剂量下也严重破坏了重要的群体功能。关键是，同时针对多个生理系统为抗性发展提供了强大的障碍，这是传统合成杀虫剂的显著优势。通过综合行为、代谢、酶学和组织病理学分析阐明这一复杂机制，我们的工作将6-羟基香豆素定位为一种有前景且环保的候选物，可用于应对这一全球性严重害虫。未来在配方、现场验证、环境安全性和抗性管理方面的努力对于将这一有前景的实验室发现转化为实用的可持续火蚁控制解决方案至关重要。

作者贡献声明：
- You Zhou：撰写原始草稿、可视化、验证、方法学、正式分析、概念化。
- Rongchao Luo：撰写原始草稿、可视化、验证、方法学、正式分析、概念化。
- Deqiang Qin：可视化、验证、监督、项目管理、资金获取、正式分析。
- Yougui Zha：可视化、验证、监督、项目管理、资金获取、正式分析。
- Mehboob Hussain：可视化、验证、监督、项目管理、资金获取、正式分析。
- Jing Wang：可视化、方法学、正式分析。
- Guoxing Wu：可视化、方法学、正式分析。
- Xi Gao：可视化、方法学、正式分析。
- Chengjie Xu：可视化、方法学、正式分析。
- Chi Li：可视化、方法学、正式分析。
- Dexiang Yin：可视化、方法学、正式分析。
- Mingqi Wu：验证、方法学、正式分析。