不同物种间ABA/NO介导的杨树（Populus cathayana）和三角叶杨（P. deltoides）锈病防御机制的变异性

《Environmental and Experimental Botany》：Interspecific variation in ABA/NO-mediated rust defense dynamics in Populus cathayana and P. deltoides

　　姚晨|刘学蛟|张胜|宋海峰
中国教育部草原资源重点实验室，内蒙古农业大学草原科学学院，呼和浩特010011

摘要
杨树具有全球生态重要性，但同时也是全球受威胁最严重的树种之一。锈病菌Melampsora larici-populina Kleb.是一种专性生物寄生菌，是导致杨树叶片严重受害的病原体，造成巨大的生物量损失。目前对杨树与锈病菌在疾病不同阶段的相互作用了解仍然有限。本研究将杨树（Populus cathayana和P. deltoides）接种该病原体，考察了它们在多个感染时间点的抗病反应，并比较了这两种杨树的特异性抗病策略及其相关的生理机制。结果表明，感染后杨树叶片中的抗氧化酶、酚类物质和植物激素水平均有所升高，但P. deltoides的变化更为显著。与P. cathayana相比，P. deltoides由于其基线水平的抗氧化物质较高以及未感染叶片中较强的系统获得性抗性，表现出更轻度和系统的抗病反应。P. cathayana能持续应对锈病菌的感染，在感染早期就能抑制其定植，但在后期难以控制锈病菌的增殖和扩散。这两种杨树之间抗锈能力的差异可能与活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和植物激素的协同作用密切相关，因为P. deltoides对这些信号更敏感。在锈病菌感染期间，脱落酸（ABA）会诱导气孔关闭，并伴随一氧化氮的合成以抵御病原体的入侵。我们的发现为杨树抗锈病机制的研究提供了新的见解。

1. 引言
自然环境中的植物经常受到病原体的感染，它们能够迅速检测到病原体的侵入并通过复杂的机制启动有效的防御反应。受感染的部分会激活多种防御机制，包括信号传导、防御基因激活、植物抗性物质的合成、物理屏障的形成（如气孔关闭和细胞壁增厚），以及程序性细胞死亡（这些机制在初始防御被突破时发挥作用，以防止病原体扩散，Meng & Zhang, 2013）。除了这些局部防御机制外，在未受挑战的植物器官中建立系统获得性抗性（SAR）可以增强对次级病原体入侵的防护（Spoel, Dong 2012）。

活性氧（ROS）通常在感染时产生，引发生理变化以维持其稳态；而一氧化氮（NO）则通过缓和氧化应激来调节植物对病原体入侵的防御反应（Deng et al., 2016）。ROS与NO之间的相互作用在植物程序性细胞死亡过程中也有报道（Mira et al., 2016, Mittler, 2017）。ROS与NO在细胞和组织间的相互作用调节着植物应对逆境的生物化学级联反应（Romero-Puertas et al., 2021）。酶促和非酶促成分都对维持细胞内的ROS稳态至关重要，主要酶包括抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）。

植物合成的多种次级代谢物根据微生物的毒性特性，能够有效保护植物免受侵害。研究表明大多数次级代谢物具有抗真菌作用（Zaynab et al., 2018）。相关的酚类化合物和黄酮类物质属于植物化学物质的重要类别（Zaynab et al., 2018）。酚酸类物质能够改变微生物的通透性，并导致膜蛋白的结构和功能变形，进而影响pH值梯度、ATP的产生和保存系统、膜结合酶以及ATP合成的底物利用。许多参与病原体防御过程的苯丙素化合物可通过苯丙氨酸代谢途径合成，该途径涉及苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、查尔酮合酶（CHS）和白花青素还原酶（LAR）的活性（Wen et al., 2021）。苯丙胺代谢还能产生木质素，对木本植物的物理防御具有积极作用（Geng et al., 2020）。

在自然环境中，SAR可以被激活，为受病原体感染的植物远端部位提供长期的保护（Orlovskis & Reymond, 2020）。作为一种可诱导的防御机制，SAR伴随着水杨酸（SA）的积累和与病原性相关基因的表达。在拟南芥中，SA信号传导通常由非病原性相关基因1（NPR1）调节，该基因能够激活大量的转录因子和防御相关基因（Liu et al., 2020）。先前的研究表明，参与SA信号传导和苯丙素代谢的基因常常受到R2R3-MYB和/或bHLH转录因子的共同调控。例如，MYB182和bHLH131在SA的诱导下可以激活许多黄烷-3-醇生物合成途径的基因（Yoshida et al., 2015）。此外，脱落酸（ABA）是一种重要的信号分子，能够调节植物的发育和对生物和非生物胁迫的反应。早期研究表明，ABA介导的气孔关闭是一种针对细菌和真菌病原体的防御机制（Ye et al., 2020）。ABA诱导的抗氧化酶活性增强与ROS和NADPH氧化酶密切相关（Postiglione & Muday, 2020）。在保卫细胞中，NO和ROS作为强烈的第二信使共同发挥作用（Postiglione and Muday, 2020, Zhang et al., 2020a）。

杨树是北半球广泛分布的树种，但由于受到高度破坏性的锈病菌Melampsora larici-populina Kleb.的感染，会遭受显著的生物量损失。杨树（P. cathayana和P. deltoides）都与该病原体存在兼容的相互作用（Zhang et al., 2010, Wei et al., 2020），我们观察了接种后两种杨树的病情发展差异。本研究探讨了不同杨树物种对锈病菌感染的响应机制，重点关注ROS、NO、次级代谢物和植物激素在调节杨树-锈病菌相互作用中的作用。首先分析了宿主差异是否导致不同的抗病反应；接着通过检测感染叶片附近的叶片来评估SAR的程度，并确定了NO和ABA在气孔调控中的功能；最后分析了杨树-锈病菌相互作用过程中抗氧化酶、次级代谢物和植物激素的复杂网络。这项研究揭示了杨树抗锈病机制的多样性，有助于整合两种杨树的优势抗性机制，培育出具有更强抗病性的品种。

2. 材料与方法
2.1. 实验性锈病菌分离
锈病菌接种株是从生长在成都郊区防护林中的P. cathayana叶片上的孢子中分离获得的，这种病原体同时对P. cathayana和P. deltoides具有致病性。按照Newcombe（1998）的方法对叶片进行接种。将锈病菌的夏孢子悬浮在纯净水中，然后喷洒到温室条件下（约24℃、相对湿度60%、光照强度104 LUX、16小时光照/8小时黑暗周期）生长的P. cathayana叶片的背面。通过连续接种获得纯化的夏孢子。接种后，将每株植物放入黑色塑料袋中24小时以促进锈病菌夏孢子的萌发，之后取出塑料袋并继续使用相同方法维持培养。

2.2. 植物材料与锈病菌接种
实验用的P. cathayana和P. deltoides枝条分别来自南京林业大学（中国，北纬32°03′，东经118°46′）和四川林业科学院（中国，北纬30°67′，东经104°06′）的苗圃，在所有叶片脱落后的时期采集。每种植物选取50株插条（直径约8毫米，长度10厘米），种植在装有1:1（体积比）蛭石和培养土的2升盆中，模拟人工生长条件（约24℃、相对湿度60%、光照强度104 LUX、16小时光照/8小时黑暗周期）。发芽60天后，挑选出生长健壮、冠层形态均匀且枝条伸长差异较小的个体进行接种。接种方法是将含有约2克/升（约1.6×10^5个孢子/毫升水）的M. larici-populina夏孢子水悬浮液喷洒到从顶端第四和第五片完全展开的叶片背面（Duplessis et al., 2011）。每片叶片喷洒1毫升孢子悬浮液。对照组叶片则喷洒等量的蒸馏水。接种后7天、14天和21天，分别收集两种杨树的锈病菌感染叶片及上方两片未感染叶片，并立即置于液氮中冷冻。这些样本用于后续的生理测量和酶活性分析。

设计了一种体外生物测定系统，评估NO和ABA对杨树中M. larici-populina感染的抗真菌作用。在P. cathayana和P. deltoide插条培养60天后，向叶片喷洒 ddH2O或ABA（50 μM）。24小时后，切除顶端第三到第五片完全展开的叶片并倒置放置在含有无菌滤纸的培养皿中。SNP（硝普钠二水合物）是一种广泛用于植物研究中的一氧化氮供体，能够模拟内源性的NO信号传导，并已被证明能调节多种生理过程（包括防御反应）。C-PTIO（2-(4-羧基苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物钾盐）是一种水溶性强且稳定的NO清除剂，能与NO以1:1的摩尔比反应生成Carboxy-PTI衍生物，从而去除生物系统中的NO。处理过的叶片和对照组叶片分别与3毫升纯水、SNP（200 μM）或C-PTIO（200 μM）共同培养。锈病菌感染4小时后，向叶片喷洒1毫升均匀的孢子悬浮液（2克/升）。随后，使用乙醇-醋酸混合液（3:1，体积比）对叶片进行处理，并将叶片储存在混合溶液中（醋酸：甘油：水=5:20:75）。利用显微镜（Leica DM4 B；Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）观察叶片上的孢子萌发和菌丝生长情况。

2.3. 酶、ROS和NO含量的测定
冷冻叶片样本（0.1克）在液氮中粉碎后，使用含有50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）、0.1 mM EDTA和1%（重量/体积）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的提取缓冲液进行匀浆。匀浆液在4℃下以12,000×g离心15分钟。上清液用于通过Elisa试剂盒（江苏梅棉工业有限公司）测定POD、SOD、APX、硝酸还原酶（NR）、ROS和NO的活性，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2.4. 酶活性的测定
用于酶活性测定的上清液按照上述方法提取。APX活性的测定遵循Nakano和Asada（1981）的方案，通过测量290纳米处的吸光度下降来计算酶活性变化。POD活性在磷酸盐缓冲液（pH 6.5）、愈创木酚和H2O2混合物中测定，通过测量470纳米处的吸光度增加来计算活性。一个酶活性单位定义为相应波长下每分钟吸光度变化ΔA为0.01。SOD、CAT和NR的活性同样使用Elisa试剂盒（江苏梅棉工业有限公司）按照说明书进行测定。C4H和LAR的活性通过改进后的文献方法（Zhang et al., 2020b, Zhao et al., 2015）进行光谱测定，每个酶活性单位定义为相应波长下每分钟吸光度变化ΔA为0.01。

2.5. 次级代谢物和激素含量的测定
将100毫克新鲜叶片粉末与1毫升60%（体积比）甲醇混合，在4°C下振荡过夜提取次级代谢物（酚类、黄酮类和黄酮醇）。离心后收集上清液，合并后进行酚类、黄酮类和黄酮醇的含量分析。总酚含量使用Follin-Ciocalteu方法在765纳米处测定（Aryal et al., 2019）。黄酮类含量采用Gam等人（2020）提出的氯化铝比色法测定，略有修改。反应混合物包含75 μL提取液、675 μL甲醇、50 μL NaNO2（0.5 M）和50 μL AlCl3（0.3 M）。5分钟后加入250 μL NaOH，测量510纳米处的吸光度。黄酮醇含量使用ρ-DMACA方法在640纳米处测定（Wang et al., 2020）。

为了测定脱落酸（SA）、ABA和木质素的含量，将新鲜叶片材料在液氮中粉碎后用1毫升提取缓冲液（50 mM磷酸钾缓冲液、pH 7.4；0.1 mM EDTA；1%（重量/体积）聚乙烯吡咯烷酮）提取。提取后，样品在4℃下以12,000×g离心15分钟。使用ELISA试剂盒（江苏美棉实业有限公司，江苏，中国）按照制造商规定的程序对澄清的上清液进行了测量。2.6. RNA提取和qRT-PCR分析在7、14和21 dpi时，使用植物RNA提取试剂盒（成都Biofit生物技术有限公司）从受锈病感染和未感染的叶片中提取总RNA。为了合成cDNA，使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme生物技术有限公司，南京，中国）以1 μg的总RNA为模板进行逆转录。随后使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme生物技术有限公司）进行定量实时PCR（qRT-PCR）扩增，并严格遵循供应商的指导原则。泛素基因被用作内部参考。用于qRT-PCR分析的引物列在补充表S1中。每个反应进行了三次重复，相对转录本水平使用2?ΔΔCt方法计算（Zhao et al., 2021）。2.7. 统计分析所有实验均采用完全随机设计。所有数据使用SPSS 29.0（SPSS公司，芝加哥，IL，美国）进行统计分析。Tukey检验用于确定各组间测量变量的显著性差异，一般线性模型用于评估锈病感染和感染后的时间效应。数据可视化使用GraphPad Prism 10（GraphPad软件公司，拉霍亚，CA，美国）完成。主成分分析（PCA）由Origin 2018（Origin Lab，北安普顿，MA，美国）进行。使用R软件（版本4.4.1）中的‘ggpubr’和‘ggplot2’包对受感染和未感染叶片中的应激响应代谢物进行了相关性分析。在图形输出中，不同的字母表示显著差异（P<0.05）。3. 结果3.1. 锈病萌发我们首先研究了M. larici-populina的孢子发育，并比较了它在两种杨树物种间的感染特征。M. larici-populina的感染涉及孢子萌发和菌丝管的生长。孢子在培养2到4小时后开始萌发，此时1-5个菌丝管作为小突起出现在孢子表面（图1a）。这些突起逐渐增大、伸长并分支，在24小时内形成能够侵入宿主细胞的菌丝管网络。因此，在接种过程中提供了24小时的黑暗和高湿度环境以促进锈病孢子在宿主叶片上的萌发。在7dpi时，两种杨树的叶片上都形成了一些锈孢子器（图1b）。到了14dpi，锈孢子在叶片表面迅速产生，且P. deltoides的叶片上出现了更多的锈孢子器（图1c）。再过7天（21dpi），P. deltoides叶片上的锈孢子器大小没有显著变化，而P. cathayana叶片上的锈孢子器大小显著增加（图1d）。这些观察结果表明P. cathayana和P. deltoides对锈病感染的敏感性不同。下载：下载高分辨率图片（1MB）下载：下载全尺寸图片图1. 锈病的萌发和感染。培养皿中含水24小时后的锈病萌发特征（a）。条形图=100 μm。7、14和21 dpi时P. cathayana和P. deltoides叶片上锈孢子器的积累（b）。条形图=1 cm。锈孢子器数量和大小的统计分析（c, d）。条形图上不同的小写字母（a, b, c等）表示基于Tukey HSD事后检验在P < 0.05水平上的统计显著差异。相同字母的条形图之间没有显著差异。PR、PP和PS×PP表示锈病感染状态和感染时期的主效应及其交互效应的显著性水平。ns，不显著；*0.01 < P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。3.2. 锈病感染刺激叶片中的ROS和RNS水平氧化应激通常伴随各种应激反应。感染后的锈病杨树叶片及其邻近未感染叶片中积累了ROS和活性氮物种（RNS）（图2）。在P. cathayana中，从7到21 dpi，锈病感染叶片（RL）和邻近未感染叶片（NL）中的O2-、H2O2和NO含量发生变化（图2 a、c和e）。在感染后的早期阶段，P. deltoides的RL和NL都积累了O2-、H2O2和NO，但在后期NL中的前两种物质含量恢复到正常水平（图2 b、d和f）。同时，杨树积累了更多的抗氧化剂来清除ROS，其中抗氧化酶SOD、CAT、POD和APX发挥了主要作用（图3）。特别是在P. cathayana的RL和NL中，抗氧化酶的活性显著增强并且持续增加，RL中的活性高于NL（图3 a-d）。抗氧化酶蛋白含量的变化显示出相似的模式（图3 i-l）。在P. deltoides中，抗氧化酶的活性和含量最初很高，感染后NL和RL之间没有显著差异，除了POD活性有所增加（图3 e-h和m-p）。一致地，P. deltoides最初的O2-含量高于P. cathayana（图2）。催化NO生成的酶的活性及其编码基因的转录本丰度在两种杨树中都被激活，P. deltoides的初始NR活性更高（图S1）。这些结果表明P. deltoide具有更高的抗病物质积累能力和更快速的锈病入侵响应。下载：下载高分辨率图片（387KB）下载：下载全尺寸图片图2. 不同阶段P. cathayana和P. deltoides感染叶片及其邻近未感染叶片中的ROS和NO含量。条形图上不同的小写字母（a, b, c等）表示基于Tukey HSD事后检验在P < 0.05水平上的统计显著差异。相同字母的条形图之间没有显著差异。PR、PP和PS×PP表示锈病感染状态和感染时期的主效应及其交互效应的显著性水平。ns，不显著；*0.01 < P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。FW，鲜重；RL，感染叶片；NL，邻近未感染叶片；CK，对照。下载：下载高分辨率图片（523KB）下载：下载全尺寸图片图3. 不同阶段P. cathayana和P. deltoides感染叶片及其邻近未感染叶片中各种抗氧化酶的活性（a-h）和含量（i-p）。条形图上不同的小写字母（a, b, c等）表示基于Tukey HSD事后检验在P < 0.05水平上的统计显著差异。相同字母的条形图之间没有显著差异。PR、PP和PS×PP表示锈病感染状态和感染时期的主效应及其交互效应的显著性水平。ns，不显著；*0.01 < P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。FW，鲜重；APX，抗坏血酸过氧化物酶；CAT，过氧化氢酶；NR，硝酸还原酶；POD，过氧化物酶；SOD，超氧化物歧化酶。FW，鲜重；RL，感染叶片；NL，邻近未感染叶片；CK，对照。3.3. 锈病感染刺激叶片中的次级代谢物水平次级代谢物的积累是植物抗病策略的重要机制。酚类、黄酮类和黄烷醇类可以抑制病原体生长并增强植物的抗氧化能力，而木质素则提供物理屏障以抵抗疾病。两种杨树在锈病感染后的次级代谢物积累模式有所不同（图4）。在P. cathayana中，RL和NL中的酚类、黄酮类和黄烷醇类含量相对于对照组有所增加，而在P. deltoides中未观察到这种增加（图4 a-f）。P. cathayana的RL在7 dpi时显示出比对照组更高的酚类和黄烷醇类积累，而黄酮类含量在RL中于7 dpi时达到峰值（图4 a、c和e）。P. deltoides中的酚类和黄烷醇类虽然未受到锈病感染的刺激，但其基线水平高于P. cathayana（图4 b和f）。两种杨树的木质素含量持续增加以抵抗病原体入侵（图4 g和h）。下载：下载高分辨率图片（483KB）下载：下载全尺寸图片图4. 不同阶段P. deltoides和P. cathayana感染叶片及其邻近未感染叶片中次级代谢相关物质、酶和基因的检测。酚类、黄酮类、黄烷醇类和木质素的含量（a-h）。不同阶段感染叶片和邻近未感染叶片中肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和白花青素还原酶（LAR）的活性（i-m）。数据点或条形图上不同的小写字母（a, b, c等）表示基于Tukey HSD事后检验在P < 0.05水平上的统计显著差异。相同字母的条形图之间没有显著差异。PR、PP和PS×PP表示锈病感染状态和感染时期的主效应及其交互效应的显著性水平。ns，不显著；*0.01 < P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。FW，鲜重；RL，感染叶片；NL，邻近未感染叶片；CK，对照。热图显示了参与苯丙烷代谢途径的基因转录表达（m）。Pc，P. cathayana；Pd，P. deltoides。在P. cathayana的RL中，两种关键酶C4H和LAR的催化活性在感染后疾病发展过程中稳步增加（图4 i和k）。然而，在P. deltoides中仅观察到LAR在7和21 dpi时的活性增加（图4 j和l）。同时，qPCR分析揭示了苯丙烷途径中关键基因的差异表达。在P. cathayana中，锈病感染触发了DFR、LAR和ANR在RL和NL中的上调（图4 m）。在P. deltoides中，DFR、LAR和ANR的相对表达也上调，NL中的转录本水平高于RL（图4 m）。综上所述，这些结果表明锈病入侵改变了两种杨树叶片中的次级代谢，但变化在不同物种间存在差异，这可能导致了它们不同的防御反应。3.4. 锈病感染激活ABA和SA信号途径在7到21 dpi期间监测了锈病感染后植物激素含量的时间动态。在P. cathayana中，ABA和SA的含量在RL和NL中随时间显著变化，在21 dpi时达到最高水平，NL中的含量低于RL（图5 a和b）。相比之下，在P. deltoides的RL和NL中，ABA和SA的含量在7 dpi时显著增加，随后随时间减少，RL和NL之间没有显著差异（图5 c和d）。还监测了与ABA生物合成相关的基因的表达，包括玉米黄质环氧酶36（ZEP36）、9-cis-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）和醛氧化酶（AO）。尽管并非所有测量都显示出强烈反应，但我们观察到NCED的整体诱导趋势，在21 dpi时P. deltoides的NL中反应更强，表明ABA生物合成途径对锈病感染有响应，并且在两种杨树中的反应不同（图S2）。此外，还分析了响应ABA和SA的基因的相对转录本丰度。NPR1以及与病理生成相关的基因PR2.3和PR5的表达受到锈病入侵的影响，并在P. cathayana和P. deltoides之间有所不同（图S3）。已知参与SA诱导的病原体抵抗的转录因子bHLH131、MYB182、WRKY23、WRKY18和WRKY89在锈病感染后一个或多个时间点在RL和NL中被激活并增加（图S4）。同样，ABA响应基因RD20、MYB41和LTI65在两种杨树的RL和NL中也上调（图S5）。NPR和PR基因在两种杨树之间的差异反应表明它们的转录调控存在差异。这些表达差异的原因和后果需要进一步深入研究。下载：下载高分辨率图片（200KB）下载：下载全尺寸图片图5. 不同阶段P. deltoides和P. cathayana感染叶片及其邻近未感染叶片中SA和ABA的含量。数据点上方的不同小写字母（a、b、c等）表示在单因素方差分析（one-way ANOVA）后，根据Tukey的HSD事后检验，差异具有统计学意义（P < 0.05）。相同字母的条形图表示无显著差异。PR、PP和PS×PP表示锈病感染状态和锈病感染时期的主效应及其交互作用的显著性水平。ns表示无显著性；*0.01 < P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。FW表示鲜重。SA表示水杨酸；ABA表示脱落酸；Pc表示P. cathayna；Pd表示P. deltoildes；RL表示受感染的叶片；NL表示相邻未受感染的叶片；CK表示对照。

3.5. 在P. deltoildes中，未受感染叶片（NL）的获得性免疫反应更强。锈病感染也在P. cathayana和P. deltoildes的系统性叶片中引发了类似的防御反应。在接种后疾病发展过程中，受感染叶片中的防御相关物质水平与NL中的水平密切相关。在P. cathayana中，过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和硝酸还原酶（NR）的活性以及O2-、黄酮类、SA和ABA的含量在RL和NL中呈正相关（P<0.05）。在P. deltoildes中，POD和莱科抗胺酸还原酶（LAR）的活性以及ABA的含量在RL和NL中也呈正相关（图S6）。因此，两种杨树的未受感染叶片都通过受感染叶片的信号传递获得了系统性免疫。

对两种物种在接种后三个时间点的PCA分析显示，PC1分别解释了P. cathayana和P. deltoildes 62.7%和28.8%的变异。在P. cathayana中，所有测量变量都对PC1有正面贡献。而在P. deltoildes中，一些抗氧化酶和激素有正面贡献，而黄酮醇和酚类则具有负面影响。PC2分别解释了两种物种11.5%和22.7%的变异（图6 a和b）。P. cathayana的样本在各个时间点之间区分明显，酶的活性和含量、激素水平以及次生代谢产物的含量显著影响了分化（图6 a和c）。在P. deltoildes中，NL样本在各个时间点之间也区分明显，但不同时间的RL样本无法区分（图6 b）。在P. cathayana中，RL和NL通过PC1清晰分离，而在P. deltoildes中未观察到这种分离（图6 a和b）。因此，在P. deltoildes中，NL获得了与RL相当甚至更强的抗性，表明P. deltoildes的病原体防御更为系统化。ABA和SA对由锈病引起的分化有正面影响，但对感染后期阶段的分化有负面影响（图6 d）。这表明在P. deltoildes中，疾病防御期间的应激反应逐渐减弱，这可能与锈病入侵的抑制有关。

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图6. 主成分分析显示了P. cathayana（a）和P. deltoildes（b）的不同簇，以及P. cathayana（c）和P. deltoildes（d）中物理指标与感染和感染阶段的相关性。P. cathayana（a）和P. deltoildes（b）中病原体响应生理指标的相关性网络图。相关性分析的显著性用“*”表示，*0.01 < P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。下标“a”表示酶活性，下标“c”表示酶含量。Pc表示P. cathayna；Pd表示P. deltoildes；APX表示抗坏血酸过氧化物酶；NR表示硝酸还原酶；POD表示过氧化物酶；ROS表示活性氧；SOD表示超氧化物歧化酶；CAT表示过氧化氢酶；ABA表示脱落酸；APX表示抗坏血酸过氧化物酶；C4H表示肉桂酸-4-羟化酶；LAR表示莱科抗胺酸还原酶；SA表示水杨酸。

此外，还进行了相关性分析以探索测量变量之间的关系。在P. cathayana中，所有生理参数均呈成对正相关（图6 e）。在P. cathayana中，包括抗氧化酶、次生代谢物、植物激素和活性氧在内的大多数变量之间均呈正相关（图6 e）。相比之下，P. deltoildes中的指标之间的相关性较弱。具体而言，SOD和黄酮类含量与活性氧呈负相关，而NR和CAT活性与ABA和SA浓度呈负相关（图6 f）。ROS水平的增加和抗氧化物质的增加表明，在P. cathayana中锈病感染在21天 indoors post-inoculation day (dpi) 期间仍然活跃，而P. deltoildes可能已经达到了代谢和防御的平衡。

3.6. ABA和NO抑制了杨树叶上的锈病孢子萌发
ABA和NO在植物抗病信号传导中起着重要作用，ABA可以通过调节NO的产生来诱导气孔关闭，从而防止病原体入侵。如上所述，两种杨树在锈病感染后ABA和NO的含量发生了变化，尽管时间模式不同。因此，我们进一步研究了ABA和NO对P. cathayana和P. deltoildes锈病抗性的影响是否有所不同。在含有蒸馏水的Petri培养皿中的叶片上，大多数孢子在4小时内萌发并生长出菌丝。相比之下，在含有ABA或SNP（一种NO供体）的培养皿中，孢子萌发受到强烈抑制，而这种抑制可以通过添加C-PTIO（一种NO清除剂）得到缓解（图7 a-h）。在对照培养皿中，萌发的孢子表现出高度分枝的菌丝，而在添加了ABA或SNP的培养皿中菌丝分枝受到抑制。在两种杨树中，经过ABA处理的叶片上的气孔倾向于关闭，导致气孔纵横比增加。通过向经过ABA预处理的叶片中添加C-PTIO可以逆转这种效应（图7 i和j）。此外，P. deltoildes的气孔运动对ABA和NO的反应比P. cathayana更敏感，这可能部分解释了P. deltoildes在后期对锈病更有效的防御。

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图7. 在用蒸馏水（CK, a和e）、ABA（c和g）、SNP（b和f）以及ABA+CPTIO（d和h）处理的P. cathayana（a-d）和P. deltoildes（e-h）叶片上锈病孢子的萌发特征。分别计算了P. cathayana（i）和P. deltoildes（j）的气孔开口（气孔长度/气孔宽度）。数据点上方的不同小写字母（a、b、c等）表示在单因素方差分析后，根据Tukey的HSD事后检验，差异具有统计学意义（P < 0.05）。相同字母的条形图表示无显著差异。

4. 讨论
4.1. P. cathayana和P. deltoildes不同的锈病防御策略
图1中的数据表明，P. cathayana和P. deltoildes采用了不同的防御策略：P. deltoildes限制了锈孢子的大小（一种“大小抑制”策略），但在14天时允许更多的感染点。P. cathayana限制了感染点的数量（一种“数量限制”策略），但允许单个锈孢子变得更大。两种宿主在抵抗感染方面没有明显的一方更成功；它们只是在不同防御资源配置上采取了不同的折中措施。在进一步的研究中，一个设计良好的实验跟踪生长参数、叶片脱落和最终存活情况将对评估这两种防御策略的长期后果非常有帮助。

在P. cathayana中，14天时锈孢子的大小下降，这与P. deltoildes的持续增长不同（图1 b, d）。这是一种不典型的情况，但仍可以提出一个合理的解释。在一些杨树物种中，延迟的超敏反应（HR）介导的细胞死亡可能直到接种后的7天才完全激活（Laurans和Pilate, 1999）。一旦HR发生，它可以限制锈孢子的进一步扩展，甚至导致较老的脓包部分退化，从而在14天时平均大小显著降低。统计人为误差也可能是原因之一。在14天时，一些早期形成的脓包可能已经进入晚期孢子形成或衰老阶段，而新形成的小脓包仍在发育中。大量退化的脓包和新形成的脓包同时存在可能导致平均大小暂时下降。随着感染的进展，系统性抗性（SAR）可能会逐渐被激活，对新形成的锈孢子施加更强的防御压力，这可能减少了后期形成的脓包的大小，从而使14天的平均值降低，最终在21天时恢复。

4.2. 抗氧化酶在锈病抗性中的协同作用
生物胁迫打破了ROS产生和消除之间的平衡，导致氧化应激。抗氧化酶活性（特别是POD、SOD和APX）的同时增强表明它们在减轻锈病感染和维持ROS稳态方面的积极作用。在P. cathayana中，ROS含量以及POD、SOD和APX的活性和含量在感染后都增加了。相比之下，在P. deltoildes中，除了POD活性随时间变化外，其他酶仅在7天或14天时增加（图3）。这些酶的含量和活性在P. cathayana中几乎翻倍；而在P. deltoildes中，由于基线水平较高，它们保持相对稳定。相应地，P. deltoildes中较高的原始抗氧化酶活性有助于维持较低的ROS水平，并在锈病感染后更快地恢复稳态，从而增强了其抗锈病能力。然而，在P. cathayana中，ROS和抗氧化酶之间始终存在正相关，表明锈病入侵在叶片中仍然活跃。

ROS代谢还与抗氧化系统相互作用，以微调氧化还原信号。H2O2通过SOD催化的歧化作用产生，而CAT、APXs和POD作为关键酶将其转化为水（Li等，2018）。在缺氧条件下或通过CAT清除H2O2时，NO的产生会减少。相反，通过添加SOD增加H2O2水平会促进NO的生成，突出了这些信号分子之间的氧化还原相互作用（Rümer等，2009）。研究表明，NO增强了清除H2O2的酶的活性（Correa-Aragunde等，2015）。NO的一个重要来源是由NR催化的亚硝酸盐还原。与P. cathayana的RL和NL中NR和APX活性的增加不同，这些活性在P. deltoildes中变化不同，显示出与ROS的明显负相关。在这项研究中，CAT活性在两种杨树中的增加都不如POD、SOD和NR明显。特别是在P. deltoildes中，NR和APX与ROS的变化呈负趋势（图3）。APX活性在7天时达到峰值，而POD活性在14天和21天时增加（图3）。此外，APX对H2O2的亲和力高于CAT和POD（Gill & Tuteja, 2010）。因此，在P. deltoildes中，APX和NR的联合功能在早期阶段起重要作用，而POD在后期阶段起主导作用。

4.3. 次生代谢物在锈病预防中起重要作用
锈病真菌感染显著改变了宿主植物内的内源性黄酮类化合物谱型（Yan & Dong, 2014）。黄酮类化合物通过产生病原体毒素醌类物质和通过木质素生物合成增强细胞壁来参与防御。C4H和LAR是催化植物中黄酮类化合物合成的关键酶（Tsai等，2006）。在P. cathayana的RL中，防御期间SMs的含量比NL更稳定增加（图4）。在P. deltoildes的叶片中，锈病感染后木质素含量显著增加，而酚类、黄酮类和黄酮醇的水平没有变化。此外，我们的研究表明，木质素生物合成途径中的酶活性（例如LAR）和DFR、LAR和ANR的转录本丰度在RL和NL中协调诱导以对抗锈病感染。黄酮类化合物的生物合成途径受MYB-bHLH-WD（MBW）转录复合物的控制，该复合物对多种生物和非生物胁迫有响应（Xie等，2016）。在这项研究中，bHLH和WRKY89在P. deltoildes和P. cathayana的RL和NL中被诱导，其水平分别增加了近4倍和12倍。根据先前的研究，花青素结构基因在响应锈病感染时受到MYB转录因子的正向调控（Ullah等，2019）。P. deltoildes中MYB复合基因的更强诱导和SMs的积累表明它倾向于通过激活SAR来增强SMs的积累。

4.4. 锈病感染激活了SA和ABA通路
酚类植物激素SA显著促进了SAR的建立。它诱导NPR1的表达。此外，PRs通过NPR1被激活以建立SAR（Ullah等，2019）。此外，SA与JA信号传导相互促进，共同积累类黄酮植保素，并调节与程序性细胞死亡相关的基因（如KTI），以限制真菌的生长（Chen等人，2021a）。先前的研究已经探讨了在杨树受到锈菌感染时SMs与SA调节之间的相互作用（Ullah等人，2019）。锈菌感染增加了SA浓度，并激活了相应的标记基因（例如WRKY89），无论是在P. cathayana还是P. deltoides的叶片中（图5），这清楚地表明SA信号传导被激活了。此外，在杨树与Melampsora的相互作用中，SA和ABA之间存在拮抗作用，以平衡侵前和侵后的防御机制（Ullah等人，2019）。P. deltoides的RL部分的ABA浓度显著增加，在7dpi时达到峰值（图5b）。在接种后过程中，锈菌感染的P. cathayana的RL和NL部分观察到ABA的持续积累。我们还比较了RL和NL部分相关激素的含量和基因转录水平。ABA的生物合成首先通过9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase（NCED）酶对neoxanthin或violaxanthin进行氧化裂解，然后由aldehyde oxidase（AAO/AO）转化为ABA（Yamane等人，2021）。正如预期的那样，NCED和AO的转录水平在RL和NL部分显著增加（图S2）。此外，已知响应ABA介导的信号通路的基因MYB41、RD20和LTI65在P. cathayana和P. deltoides中都因锈菌感染而被诱导（图S5）（Yang等人，2020）。锈菌感染增加了P. cathayana和P. deltoides中的SA和ABA浓度，但在P. deltoides中的增加幅度较小，这表明两种物种对病原体的响应信号转导机制存在差异。P. cathayana和P. deltoides都受到锈菌的严重威胁，这严重影响了它们的生产力。然而，它们在抵抗M. larici-populina方面采取了完全不同的策略。进一步研究这两种物种在抗锈性上的相似性和差异将有助于增强优势、克服弱点、培育抗病品种以及开发环保的害虫控制产品。

4.5. 对抗锈菌的复杂生化网络
先前的研究报道，在应对生物胁迫时，ROS依赖的信号通路与激素之间存在相互作用。当植物受到病原体感染时，SA水平升高以调节与疾病相关的基因表达，SAR信号传导被认为包括ROS和NO（Zhao等人，2020；Kachroo和Kachroo，2020）。此外，据报道CAT是一种结合SA的蛋白质，这种结合可以减少H2O2的降解（Zhang等人，2016）。然后，积累的H2O2可以激活与防御相关的基因的转录水平。此外，另一种H2O2清除酶APX也会在植物受到病原体感染时被SA抑制（Durner & Klessig，1995）。在锈病早期阶段，SA与CAT和APX的活性呈正相关，但在P. deltoides中后期这种相关性变为负相关。然而，在P. cathayana中，这种相关性始终保持正相关。受感染杨树中SA的产生对促进H2O2积累以抵抗锈菌感染有重要作用。此外，由胁迫引起的ROS积累通常被抗氧化系统和SMs所抑制。P. deltoides中的酚类化合物随时间减少，而在P. cathayana中增加，表明两种物种对SA依赖的锈病响应代谢不同，由于P. deltoida初始积累量较高，其响应更快。显然，ROS和NO在气孔闭合和植物免疫反应中都起着重要作用。来自NO调节剂（清除剂C-PTIO/供体SNP）的证据表明ABA在增加保卫细胞NO含量方面起着关键作用（Sánchez-Vicente等人，2019）。ABA和SNP显著抑制了锈菌的萌发，尤其是在P. deltoides中。然而，C-PTIO在两种物种中都减弱了ABA的这种抑制效果（图7）。这表明当杨树受到锈菌感染时，保卫细胞中的NO合成可能是ABA诱导气孔闭合所必需的。此外，在胁迫条件下，植物中的ROS和NO产生有时会重叠，NO可以与ROS相互作用以降低它们的毒性（Chen等人，2021b）。本研究观察到NR活性与ROS含量之间存在负相关。然而，在拟南芥保卫细胞中，内源性H2O2在ABA调控气孔运动过程中增强了NO的产生（Xie等人，2014；Wang等人，2010）。此外，ABA可以增强抗氧化酶（包括SOD、CAT和APX）的活性（Sheikh Mohammadi等人，2017）。在P. deltoides中，感染后早期POD和SOD的活性都增加，其活性远高于P. cathayana。此外，在P. deltoides中，锈菌感染后SA与ABA呈负相关，而在P. cathayana中，SA和ABA的水平都增加。先前的研究表明，在生物胁迫下SA和ABA之间存在负调控（Cao等人，2018；Proietti等人，2018）。在拟南芥中，虽然SA对于启动全面的先天免疫反应是必需的，但病原体效应子会迅速激活ABA的生物合成，而ABA反过来通过下调SA的生物合成和SA介导的防御来抑制诱导的免疫反应（De Torres Zabala等人，2009）。在杨树与Melampsora锈菌相互作用的背景下，SA和ABA之间的相互作用更为复杂。Ullah等人（2017）报道，在受锈菌感染的杨树叶片中，SA和ABA的生物合成都得到上调，两者都对抗锈病具有积极作用。在杨树中，SA驱动的flavan-3-ol积累代表了强烈的侵后化学防御，直接抑制真菌定殖，而ABA触发的气孔闭合则作为侵前物理屏障限制病原体进入。SA和ABA途径之间的拮抗可能反映了资源分配的权衡，即在SA依赖的化学防御和ABA介导的气孔防御之间进行平衡。因此，在P. deltoides中SA和ABA可能是拮抗的，但在P. cathayana中则不是，这是由于响应信号和抗氧化系统的复杂相互作用。

5. 结论
总之，作为对抗锈菌攻击的防御机制，受到锈菌感染的杨树在P. cathayana和P. deltoides中显示出不同的代谢反应，包括抗氧化酶、酚类物质和植物激素。这些代谢物在P. cathayana中随接种后时间增加；然而，在P. deltoides中则没有。与P. cathayana相比，P. deltoides中SA诱导的锈病反应更快，且ABA诱导的气孔闭合伴随NO合成更为明显。此外，由于防御相关物质的积累更高以及疾病响应基因的快速激活，P. deltoides中的SAR更强（图8）。需要进一步的研究来阐明导致SAR建立以及这些植物激素之间相互作用的分子机制。尽管如此，我们的发现对于阐明植物对抗锈菌感染的防御机制具有重要意义。