低氮供应会降低叶肉的导水性，从而限制高二氧化碳浓度在多代冬小麦光合作用中的影响

《Environmental and Experimental Botany》：Low nitrogen supply decreases the mesophyll conductance and limits the effects of elevated CO2 on photosynthesis in winter wheat across multiple generations

　　朱正宗|王熙子|Eva Rosenqvist|王卫峰|王殷|侯金香|刘 folderai
山西农业大学农学院，晋中030801，中国

摘要
尽管在单代内已经广泛研究了高浓度二氧化碳（e[CO?]）和氮（N）供应对光合作用的影响，但它们在多代之间的相互作用仍知之甚少。本研究调查了小麦（Triticum aestivum L.）对大气二氧化碳浓度（对照组为400 μmol mol?1，e[CO?]组为800 μmol mol?1）和土壤氮供应（0.5 g N pot?1 vs 1.5 g N pot?1）的光合作用响应，这些条件作用于同一品系的第1代（F1）和第4代（F4）植株。我们定量评估了在籽粒灌浆期间，气孔导度（g?）、叶肉导度（g?）和生化因素（Vc,max）对叶片光合作用的限制作用。与二氧化碳浓度和氮水平的显著影响相比，代际暴露导致的改变较为微小。在e[CO?]和高氮条件下，两代植株都表现出叶绿体二氧化碳浓度和净光合速率的提高，且叶肉导度没有下降。而在e[CO?]和低氮条件下，叶肉导度（下降68–73%）和净光合速率（下降32–41%），F1代和F4代植株的下降幅度相似，这表明即时氮状态的影响远大于代际暴露的影响。在高氮条件下，光合作用主要受到生化因素的限制（57%）；而在低氮条件下，限制机制转变为叶肉导度和生化因素的共限制（38%和44%），这种模式在两代植株中都存在。路径分析证实，氮供应对净光合速率的影响最大（路径系数=0.95），而代际效应则很小。多变量分析显示二氧化碳和氮处理之间存在明显分组，但代际组之间完全重叠。我们得出结论，在四代的时间框架内，e[CO?]对小麦光合作用的积极影响受到土壤氮供应的强烈影响。光合作用装置对当前条件表现出高度可塑性，而代际效应对其修改有限。这些结果表明，在未来高二氧化碳环境中，改善氮管理对于维持小麦的光合作用表现和潜在产量至关重要。这强调了在气候变化背景下，氮管理在确保作物生产力方面的持续重要性。

1. 引言
年平均大气二氧化碳浓度已达到418 μmol mol?1，比工业革命前的约280 μmol mol?1有了显著增加（Masson-Delmotte等人，2021年）。在最坏的情况下，预计到本世纪末这一浓度将上升至1300 μmol mol?1（RCP 8.5）（Masson-Delmotte等人，2021年）。一些研究表明，高浓度二氧化碳（e[CO?]可以促进植物生长，但另有一些研究则相反（Ainsworth & Long，2020年）。这种变异性背后的关键决定因素是土壤氮（N）的可用性，它是C3植物光合作用来度和方向的关键调节因素（Gao等人，2020年；Lau等人，2008年）。此外，氮限制已经限制了许多农业区域的作物产量——这一问题预计会因大气二氧化碳浓度上升而加剧。虽然关于植物对e[CO?]适应性的大多数知识来自于单代研究（Aleminew和Abera，2020年；Jahan等人，2021年），但自然和农业系统中的植物将在多代中经历二氧化碳浓度的升高。这种长期暴露需要考虑代际效应，即亲本环境通过表观遗传修饰、母体供应和微妙的适应性变化等方式影响后代的表型（Fitz-James和Cavalli，2022年；Herman和Sultan，2011年）。重要的是，这些多代响应可能会产生与单一生命周期内观察到的不同的适应轨迹（Burton & Greer，2022年）。新兴证据表明，e[CO?]的代际效应在生态学和农学上具有重要意义。例如，母体在e[CO?]条件下的经历可以影响后代的表现在草地中（Lau等人，2008年），而在小麦等作物中，多代暴露被证明可以改变种子代谢和叶片功能特性（Li等人，2023年，Li等人，2024年，Li等人，2019年）。在六倍体小麦中，这些响应似乎是逐渐积累的，通常在连续暴露三到四代后才会出现可检测的生理和生化变化（Li等人，2019年；Wang等人，2023年）。考虑到小麦的异源六倍体基因组（AABBDD），这种延迟出现是合理的，因为该基因组可能通过亚基因组相互作用和同源基因冗余来缓冲表型变化（Cheng等人，2024年）。因此，比较第1代（F1）和第4代（F4）可以为测试长期e[CO?]暴露是否会导致六倍体小麦光合作用能力的累积调整提供一个实用框架。然而，关于这种多代暴露如何具体重新编程光合作用的核心过程——即生长和产量的最终驱动因素——仍存在关键空白。尽管一些自由空气二氧化碳富集（FACE）研究表明关键光合作用特征在不同时间尺度上的响应方向相似（Saban等人，2019年），但受控的多代实验表明，这些响应的幅度、持续性和调节受氮供应的强烈影响（Fitz-James和Cavalli，2022年；Wang等人，2024年）。因此，高浓度二氧化碳和氮供应在多代间的相互作用可能创造了一个独特的生理环境，只有通过针对特定植物品系的跨因素实验才能阐明。

在这些动态中，光合作用适应性是一个核心过程。一个众所周知的模式是e[CO?]最初会刺激C3作物的净光合速率（AN），但在同一代内长期暴露后这种刺激往往会减弱（Ainsworth & Long，2020年）。对于这种光合作用适应性的机制包括由于氮分配改变而导致的Rubisco含量减少（Byeon等人，2021年）、碳水化合物积累对光合基因表达的抑制（Wingler & Henriques，2022年）以及硝酸盐同化的抑制（Adavi和Sathee，2021年；Bloom等人，2020年）。此外，叶肉导度（gm）的下降也被认为是C3作物光合作用下调的机制之一，因为gm影响二氧化碳从细胞间隙（Ci）向叶绿体基质（Cc）中的羧化部位的扩散（Jahan等人，2021年；Kitao等人，2015年）。历史上，人们认为gm是无限的或足够大而不会成为限制因素，因此经常在计算关键光合作用参数（如最大羧化速率（Vc,max）和电子传输速率（Jmax）时忽略它（Evans，2021年；Flexas等人，2012年）。然而，过去二十年的大量证据表明gm是有限的，并且通过减少Cc相对于Ci的比例对光合作用产生显著限制（Evans，2021年；Nadal和Flexas，2019年）。例如，先前的研究表明，豆类的gm为0.16–0.39 mol CO2 m?2 s?1 bar?1，小麦为0.20–0.64 mol CO2 m?2 s?1 bar?1，棉花为0.3–1.8 mol CO2 m?2 s?1 bar?1（Flexas等人，2008年）。一般来说，一年生或二年生草本作物的gm约为0.4 mol CO2 m?2 s?1 bar?1（Flexas等人，2008年），这与气孔导度（gs）的值相似。在计算光合作用参数（如Vc,max和Jmax）时包括gm，可以准确评估二氧化碳扩散和羧化的相对限制。由于Vc,max和Jmax是基于核酮糖1,5-二磷酸（RuBP）羧化部位处的二氧化碳定义的，生长二氧化碳对gm的任何影响都可能改变几项研究中报道的光合作用适应性机制（Evans，2021年；Flexas等人，2008年；Singsaas等人，2004年）。因此，量化gm对于准确评估扩散和生物化的相对限制以及解决关于适应机制的矛盾报告至关重要（Evans，2021年；Flexas等人，2008年）。尽管如此，目前仍完全不清楚多代e[CO?]暴露，尤其是在不同氮供应条件下，如何重塑光合作用的限制特性，包括gm的潜在作用。

在这项研究中，我们量化了多代e[CO?]暴露和氮供应对gm的相互作用效应，进而影响了光合作用的限制特性。我们关注两个假设：（i）e[CO?]对光合作用的促进作用将受到低土壤氮水平的显著限制；（ii）这种限制将涉及gm的减少，并且这些效应（氮和gm的效应）的强度将在多代中得到评估。为了验证这些假设，我们采用多因素设计来量化在多代e[CO?]和氮供应条件下冬小麦中由g?、g?和生化因素（Vc,max，Jmax）引起的限制。这种方法使我们能够超越以往的单代适应研究，直接探讨光合作用的基本瓶颈是否以及如何被同时发生的多代因素重新配置。

2. 材料与方法
2.1. 实验设计
多代二氧化碳暴露实验在丹麦哥本哈根大学Taastrup校区（55°40′6.61′N，12°18′25.62′E）的两个气候控制温室中进行。盆栽植物从发芽到收获都是在环境二氧化碳浓度（a[CO?]：400 μmol mol?1）或高浓度二氧化碳（e[CO?]：800 μmol mol?1）条件下生长的。温室环境受到控制，以确保代际间的一致性。每个温室中的大气二氧化碳浓度由CO2 Transmitter Series GMT220（Vaisala Group，赫尔辛基，芬兰）监测，并由气候计算机（LCC4，Senmatic，Soendersoe，丹麦）每分钟记录一次。温室的上层结构由具有>80%可见光透射率的亚克力板组成。补充的宽谱LED阵列（型号：Philips GreenPower LED）集成在屋顶框架中。当环境光合光子通量密度（PPFD）低于300 μmol m?2 s?1时，自动化系统会激活补充LED，提供恒定的500 μmol m?2 s?1强度，从而确保16小时的光周期。空气温度在白天保持在20.5 ± 1.5 °C（06:00–22:00），晚上保持在17.0 ± 1.0 °C，使用强制通风和冷却系统。相对湿度通过高精度湿度控制器维持在65 ± 5%，并配备喷雾和除湿装置。大气二氧化碳浓度、温度和蒸气压亏缺（VPD）的每日数据见补充文件（图S1）。每个温室的面积为8 m × 6 m。所有处理的盆栽植株在温室中央区域以完全随机的方式排列。每隔三到四天系统性地轮换位置，以最小化潜在的光照或温度梯度对植物的影响。

使用的是由中国山东省农业科学院发布的现代六倍体小麦品种（Triticum aestivum L. cv. Jimai 325）。实验品系是通过在恒定控制的二氧化碳和氮条件下连续繁殖几代建立的。具体来说，从最初的a[CO?]和e[CO?]处理中收获的F1种子分别在其各自的二氧化碳和氮水平下播种和生长，以产生F2种子。这种处理内的繁殖方式重复进行，以获得后续的每一代。因此，主实验中使用的F4种子来自已经连续三代暴露于指定大气二氧化碳浓度[环境（a[CO?]，400 μmol mol?1）或高浓度（e[CO?]，800 μmol mol?1）和土壤氮供应[低氮：0.5 g N pot?1；高氮：1.5 g N pot?1]的亲本植物（图S2）。根据我们的系列研究，选择第4代作为评估多代效应的终点。早期关于F4植物的研究表明，代际效应会导致营养质量（如蛋白质、矿物质）的逐渐下降以及氮代谢的显著重新编程（Li等人，2019年；Li等人，2023年）。这些发现表明，F4代表了一个相关的代际阶段，在该阶段，对e[CO?]的累积生理和生化调整可能变得明显。

根据我们之前的实验，每盆2株小麦的最佳生长需要提供1.5–2.0 g N。选择1.5 g N/盆作为适当的氮供应水平。低氮（0.5 g N）供应水平是高氮水平的三分之一（未发表的数据）。植物每盆接受1.07 g（0.5 g N）或3.22 g（1.5 g N）尿素（CH4N2O）和3.49 g磷酸二氢钾（H2KO4P）。播种前，所有种子在26 °C的黑暗条件下处理48小时以加速发芽。盆栽（4 L，高21.8 cm，直径18.7 cm）填充了泥炭（Plugg-och S?jord，干物质约110 kg m?3，有机物>95%，pH = 5.6–6.5，EC = 1.5–2.5 mS?cm?1），每个盆栽中种植两株植物。每盆保持两株植物，以实现与田间相关的密度（74株/m2，符合冬小麦的农学范围200–300株/m2），同时确保根部有足够的空间且无竞争，这一点通过预先试验的生物量稳定性得到验证（每盆1–3株植物的变异≤5%）。这项设计在受控条件下最小化了边缘效应，并保持了生理代表性的准确性。每个处理都有6个盆栽重复实验。

2.2. 气体交换
在茎伸长期（Z36，可检测到的第6个节点）和籽粒充实期（Z71-Z72，籽粒水分成熟）测量了叶片的气体交换参数（Zadoks等人，1974年）。使用开放式气体交换系统（GFS-3000FL，配备标准测量头3010-S和荧光计3057-FL；Walz，Effeltrich，德国）来测量主分蘖的最后一片完全展开的叶片的气体交换和叶绿素荧光。在每日测量之前，使用经过认证的校准气体（400 ± 2 μmol mol?1 CO?在N?平衡中；AGA Gas AB，瑞典）和零气体（纯N?）对GFS-3000系统的红外气体分析仪（IRGA）进行校准。流量计和叶片比色皿温度传感器按照制造商的手册进行校准。通过测量标准条件下的参考叶片或模拟叶片室来每日验证仪器的稳定性；在这些检查中，AN和gs的变化保持在3%以下。

基于我们对多年小麦实验在不同CO?浓度下的重复观察，生活在a[CO?]条件下的植物比生活在e[CO?]条件下的植物略早达到旗叶测量阶段。因此，生活在a[CO?]条件下的植物在三天后进行测量，以确保具有相当的生理叶片年龄（完全展开、未衰老的旗叶），并最小化发育过程中的混淆效应。所有植物都在气候稳定的房间内，在09:00至16:00之间进行测量。在叶片比色皿中，CO?浓度设置为a[CO?]处理的400 μmol mol?1，e[CO?]处理的800 μmol mol?1，使用CO?混合物。比色皿温度保持在25 °C，PPFD为1500 μmol m?2 s?1，光线为蓝光和红光，叶片与空气的蒸汽压力差（VPD）为1.5 kPa。叶片达到稳态后（通常需要15分钟），在光强度为1500、1300、1100、900、800、700、500、300、200、150、100、50和0 μmol m?2 s?1的情况下进行A/PPFD曲线测量，每个步骤维持3–5分钟以达到稳态条件。通过将比色皿中的CO?浓度调整到400、300、200、150、100、50、400、600、800、1000和1200 μmol mol?1来生成A/Ci曲线，分别对应于环境CO?浓度和处理e[CO?]的处理，同时不将叶片从比色皿中取出。为了最小化与CO?浓度立即变化相关的瞬态响应，每个A/Ci曲线都是在处理的相应生长CO?浓度下开始的。每个CO?浓度维持3–5分钟以确保气体交换稳定后进行记录。

2.3. 测定叶肉导度
叶肉导度（gm）是使用变量J方法和曲线拟合方法估算的，这两种方法基于不同的假设，并在其他地方有详细说明（Sharkey等人，2007年；von Caemmerer，2000年；Warren和Dreyer，2006年）。变量J方法基于Farquhar-von Caemmerer-Berry（FvCB）光合作用模型（Farquhar等人，1980年），并利用电子传输率（J）和AV（AN）之间的关系（Harley等人，1992年）。在FvCB模型中，当电子传输速率限制光合作用时，可以使用公式（1）预测AV。（1）AV = Cc ? Γ*4Cc + 8Γ*J?RL。J的计算公式为：（2）J = ΦPSII?PPFD?αβ，其中α是叶片的光吸收率，β是PSII吸收的量子比例。αβ的乘积是根据ΦPSII_O2和4ΦCO2之间的关系（即CO?固定的量子效率）的斜率估算的。这是通过在非光呼吸条件下测量光合作用光响应曲线来确定的，通过精确控制叶片比色皿中的O2浓度来实现。使用GFS-3000系统的集成气体混合单元，通过用纯N2从压缩气体钢瓶中稀释环境空气将O2浓度降低到2%，同时通过系统的CO2注入器将CO2浓度保持在1500 μmol mol?1。通过系统的内部传感器连续监测实际O2浓度以确保准确性（Valentini等人，1995年）。实际的光系统II光化学效率（ΦPSII）是根据Genty等人（1989年）的方法，结合气体交换和叶绿素荧光测量来确定的。在气体交换测量期间，使用其集成的LED光源将叶片比色皿中的PPFD主动维持在1500 μmol m?2 s?1。叶片达到稳态后（通常需要15分钟），在这些光照条件下记录稳态荧光（Fs）。随后，通过施加持续0.8秒的8000 μmol m?2 s?1的饱和光脉冲来确定最大荧光（Fm′）。（3）ΦPSII = (Fm′- Fs)/Fm′。叶绿体基质中的CO?浓度（Cc）和gm的计算公式为：（4）Cc = Γ*(J+8(AN+Rd))/J?4(AN+Rd）和（5）gm = ANCi?Cc，其中Γ?是在没有呼吸作用的情况下的CO?补偿点，AN是在饱和光照下（PPFD 1500 μmol m?2 s?1）的气体交换测量得到的净光合作用，Rd是日呼吸作用。对于每个生成的数据点，我们检查它是否满足标准（10 < dCc /dA < 50）（Harley等人，1992年）。J是根据公式（2）获得的。Rd和Γ?是根据Laisk等人（1977年）的方法确定的。简而言之，在五个PPFD水平（40、100、160、220和280 μmol m?2 s?1）下，测量响应曲线的线性部分（在120、90、70、50和40 μmol CO2 mol?1的空气中）的A/Ci曲线。然后，对每个叶片应用光合作用率（AN）和Ci之间的线性回归，将线性回归的交点视为表观的CO?光补偿点（Ci?，x轴）和Rd（y轴）（von Caemmerer等人，1994年）。Γ?的计算公式为：（6）Γ*=Ci*+Rdgm。本研究中测得的αβ、ΦPSII、J以及独立确定的参数Rd和Γ?的值显示在补充数据（表S1）中。为了避免与低CO?浓度相关的大型估算误差（Harley等人，1992年），利用从Laisk方法（Laisk等人，1977年）得到的Rd和Γ?参数，在大气CO?浓度400 μmol mol?1的情况下计算和报告gm值。我们还使用Ethier和Livingston（2004年）引入的曲线拟合方法来估算gm值，以验证通过变量J方法获得的gm值。曲线拟合方法的核心概念是gm减少了AN/Ci响应曲线中受Rubisco限制部分的曲率（Ethier & Livingston 2004年）。在受Rubisco限制的条件下，光合作用对CO?的响应取决于Rubisco的动力学性质（Kc、Ko、Cc）：（7）AV = Vcmax(Cc?Γ*)Cc + Kc(O/KO)?Rd，其中Vcmax代表最大羧化速率，Kc是羧化的米氏常数，Ko是氧化的米氏常数，O代表氧浓度。用Ci?AN/gm替换Cc会导致一个二次方程。这个方程的解是正根：x = ?b ± √(b2?4ac2/a)，其中a = ?1/gm，b = [(Vcmax?Rd)/g] + Ci + Kc(1+O/Ko)，（8）c = RdCi + Kc1+OKo?Vc,maxCi?Γ*。方程（8）用于拟合A/Ci响应曲线中受Rubisco限制的部分。我们使用Sharkey（2016年开发的Excel软件包和曲线拟合方法计算gm。Kc和Ko的值根据Sharkey（2016年）设置。Γ?的值在表S1中提供。我们通过绘制测量的AN与受Rubisco活性限制的净光合作用率（Ac）的关系图，图形上确定了曲线中受Rubisco限制部分过渡到RuBP限制的部分。从曲线拟合方法获得的gm估计值显示在图S3a中，两种方法的比较显示在图S3b中。

2.4. 估算光合作用中涉及的生化参数
从A/Cc曲线中，使用公式（11）（Bernacchi等人，2002年）计算了基于Cc的Rubisco的最大羧化能力（Vc, max Cc）：（11）Ac = (Cc?Γ*)/(Cc+Kc1+OKcVc,maxCc?Rd），其中Rubisco的动力学参数对Cc的温度依赖性是按照Bernacchi（2002年）的方法估算的。基于Cc的驱动RuBP再生的最大电子传输速率（Jmax Cc）使用公式（12）（Farquhar等人，1980年；Ethier和Livingston 2004年）估算：（12）Aj = Cc?Γ*Cc + 2Γ*JmaxCc/4?Rd

2.5. 估算光呼吸速率
光呼吸速率（F）是根据同时测量的气体交换和叶绿素荧光参数估算的，遵循Valentini等人（1995年）和Harley等人（1992年）的方法。在光照饱和条件下，J在Rubisco的羧化和氧化反应之间分配。根据FvCB模型，J、AV和F之间的关系可以表示为：（13）J = 4(AN+Rd+F)，解出F得到：（14）F = J?4(AN+Rd)。或者，方程可以写为：（15）F = J?4(AN+Rd)/12，其中F是光呼吸CO?释放的速率（μmol CO? m?2 s?1）。因子12的出现是因为在氧化反应中需要8个电子来还原一个O?，每个光呼吸CO?释放对应于2次氧化（Valentini等人，1995年）。所有用于计算的参数都是在相同的环境条件下获得的：在相应的生长CO?浓度（aCO2为400 μmol mol?1或eCO2为800 μmol mol?1）下的饱和光合作用光子通量密度（PPFD 1500 μmol m?2 s?1）。AV直接从稳态下的气体交换记录中取得。电子传输率J是根据方程（2）从叶绿素荧光中计算得出的。Rd是根据Laisk方法（Laisk等人，1977年）确定的，如前所述。

2.6. 光合作用的定量限制分析
为了阐明各种功能组分对AV的动态控制，我们使用Grassi和Magnani（2005年）描述的定量限制分析框架，推导了气孔导度（Ls）、叶肉导度（Lm）和光合作用生化（Lb）施加的相对限制。核心假设是AV受到分数限制之和（Ls + Lm + Lb = 1）的约束。AV的相对变化被分配给气孔对CO?的导度（gsc）、gm和替代生化能力（?AV/?Cc）的平行相对变化，按各自的控制系数（相对限制）加权：（16）?AV/AN = Ls?gsc + Lm?gm + Lb?Vc,maxCc/Vc,maxCc，其中?gsc、?gm和?AV/?Cc是处理之间的相对差异，初始限制是根据以下公式计算的：（17）Ls = gtotgs×?AN/?Cc + gtot + ?AN/?Cc（18）Lm = gtotgm×?AN/?Cc + gtot + ?AN/?Cc（19）Lb = gtot + gtot + ?AN/?Cc，其中gsc是gs/1.6，对CO?的总导数（gtot）计算为1/(1/gsc+1/gm)。关键的是，我们根据A/Ci曲线确定的操作限制点，使用Bernacchi等人（2001年）的酶动力学参数（Kc、Ko和Γ?）细化了?AV/?Cc的定义。对于生活在a[CO?]（400 μmol mol?1）下的植物，在Rubisco限制条件下，?AV/?Cc定义为在Vcmax限制状态下A对Cc的偏导数：（20）?AV/?CC = ?AN/?CCrub = Vcmaxcc(K+Γ*)(Cc+K)2，其中K=KC（1+O/KO），O是氧浓度（210 mmol mol?1）。对于生活在e[CO?]（800 μmol mol?1）下的植物，这些植物通常会转变为RuBP再生限制条件，?AV/?Cc定义为在电子传输限制状态下A对Cc的偏导数：（21）?AV/?CC = ?AN/?CCphoto = J×3Γ*4(Cc+2Γ*)2。这种状态依赖的计算为高CO?环境中的生化限制提供了更严格的数学表示，包括对Rubisco活性和电子传输速率的限制。

2.7. 叶氮、生物量和叶面积
对于叶片级别的性状测量，每个处理收集五到六片旗叶进行叶片性状分析。使用扫描仪（LI-COR 3000；Lincoln，NE，美国）测量叶面积，然后样品在70 °C下干燥（48小时），称重并研磨。通过燃烧法（Flash 2000，Thermo Fisher Scientific，Cambridge，英国）测定叶片氮浓度，并据此计算LMA。光合氮利用效率（PNUE）计算为AV与叶片氮含量的比率（μmol CO? mol?1 N s?1），其中叶片氮含量是基于叶片氮浓度（g kg?1）和LMA（g m?2）得出的。为了评估植物生长，记录同一植株上的单分蘖生物量和分蘖数量以评估生长反应。

2.8. 统计分析
使用R统计软件（版本4.0.0）（R Team，2022年）进行了多元方差分析（MANOVA），以比较CO2处理、氮处理和世代对旗叶光合作用特征的个别影响。用不同字母标记的平均值±标准误差表示处理之间的显著差异（P < 0.05），根据Duncan的多重范围测试。应用主成分分析（PCA）使用R中的FactoMineR包来评估不同CO?浓度、土壤氮供应和世代之间光合作用特征的变化。路径分析采用最大似然法进行，以研究生长条件（CO?浓度、氮供应和世代）、气孔导度（gs）、叶绿体导度（gm）、叶绿体碳浓度（Cc）、胞间碳浓度（Vc）、净光合速率（Jmax）和净光合力（AN）之间的关系。标准化路径系数表示各变量之间线性关系的方向和强度（表S3）。我们使用SPSS 20（https://www.ibm.com/products/spss-statistics）构建了最大似然多重模型。我们根据以下标准评估模型拟合度：卡方统计量与自由度的比值（χ2/df）、拟合优度指数（GFI）、比较拟合指数（CFI）和标准化拟合指数（NFI）。最终模型的拟合指数均符合要求（χ2/df = 1.94、GFI = 0.93、CFI = 0.98、NFI = 0.98），这支持了所提出路径的有效性。

3. 结果
3.1. 叶子和植物生长特性
低土壤氮供应显著降低了旗叶的氮含量（P < 0.001）、叶面积（P < 0.001）、叶生物量（P < 0.01）、单分蘖生物量（P < 0.01）以及每株植物的分蘖数量（P < 0.001）（表1）。CO?浓度升高显著增加了叶生物量（P < 0.01）、氮利用效率（PNUE）（P < 0.001）和单位面积叶质量（LMA）（P < 0.01），而氮的可用性、世代暴露程度及其交互作用对LMA没有显著影响（P > 0.05）。
表1. 在两种CO?浓度（400 μmol mol?1和800 μmol mol?1）下，小麦灌浆期（Zadoks阶段75，中期乳熟期）旗叶的面积、生物量、单位面积生物量（LMA）和氮含量、单分蘖生物量及每株植物的分蘖数量。

3.2. 叶气体交换特性
空气中的CO?浓度、氮供应和世代对灌浆期和茎伸长期的光合速率（AN）均有显著影响（图1）。此外，空气中的CO?浓度和世代在伸长期表现出交互作用（P < 0.05）。此外，在e[CO?]条件下，净光合速率（AN）显著增加了33%-55%，但在茎伸长期没有显著增加，除了在高氮条件下的F1植物。因此，e[CO2]对灌浆期的光合速率影响大于对茎伸长期的影响。

3.3. 光合作用生化参数和光呼吸速率
基于叶绿体碳浓度（Cc）计算了Rubisco羧化最大速率（Vc,max Cc）和电子传输最大速率（Jmax Cc）（图3）。氮供应和氮与CO?浓度的交互作用显著影响了Jmax Cc（P < 0.001）和Vc,max Cc（P < 0.001）。CO?浓度对F值（F）有显著影响（P < 0.001），氮供应和它们的交互作用也有影响（P < 0.01）。在高氮条件下，e[CO2]使F值降低了80%；在低氮条件下，F值降低了43%。F1和F4植物之间的F值没有显著代际差异。

3.4. 相对限制分析
氮和氮与CO?浓度的交互作用对相对叶肉限制（Lm）和生化限制（Lb）有显著影响（表2）。在e[CO2]条件下，充足的氮供应主要限制了光合作用，而低氮条件下两者共同限制了光合作用。此外，低氮供应使F1和F4植物的Lm分别增加了84%和82%。世代对Ls没有显著影响。

3.5. 光合作用特性路径和多元分析
主成分分析（PCA）用于可视化光合作用特性对CO?浓度、氮供应和世代暴露的响应模式（图6）。PC1和PC2解释了总变异的44.3%和23.8%。生长中的CO?浓度将数据清晰地分为两个不同的组：a[CO?]组与g?、Vc,max Cc、Jmax Cc和Lm的向量对齐，而e[CO?]组与C?、Cc和AN对齐。这表明e[CO2]下净光合力的增加主要是由于叶绿体碳浓度的提高，而非生化能力的变化。氮供应也将数据分为两个组：高氮条件与净光合力、g?、g?、Vc,max Cc和Jmax Cc相关，而低氮条件与Lm的增加相关。F1和F4世代几乎完全重叠，表明相对于CO?和氮处理的主导影响，世代间的光合作用性能变化很小。**生成效应对g?有轻微但显著的负面影响（?0.25，P < 0.05），但对C?、Cc、Vc、max Cc、Jmax Cc或AN没有显著影响。这些分析共同表明，即时氮素可用性和二氧化碳浓度是决定光合作用表现的主要因素，在所研究的四代时间框架内，任何跨代效应在生物学上都可以忽略不计。**相比之下，当二氧化碳（CO?）浓度增加时，氮（N）的限制显著降低了光合速率（AN）和光合有效量子产率（g?），这导致光合作用的主要限制因素从单纯的生化能力转变为中柱组织电导率和生化能力共同作用的结果。尽管在某些性状上观察到了轻微的代际差异，但其影响远不及氮供应的即时效应。综合这些发现可知，在高二氧化碳环境下，小麦的短期恢复能力和光合表现主要取决于可持续的氮管理策略以及当前品种的遗传潜力，而非通过几代时间逐渐形成的适应过程。我们的研究揭示了一个生理机制：当前资源的可用性是光合可塑性的主要驱动力。从应用角度来看，这凸显了提高作物氮利用效率（NUE）的紧迫性。因此，未来的研究应优先考虑综合策略，将改进的氮管理技术与培育具有更高氮利用效率和更高内在光合有效量子产率的 wheat 品种相结合，以充分发挥大气二氧化碳富集对作物生产力的理论潜力。

**作者贡献声明：**
Eva Rosenqvist：方法学研究
Xizi Wang：正式数据分析与数据整理
Yin Wang：方法学研究
Weifeng Wang：正式数据分析与数据整理
Yuzheng Zong：撰写初稿及方法学研究
Fulai Liu：研究监督与概念框架构建
Jinxang Hou：数据整理