从废物到资源：碱性蛋白酶将水产养殖沉积物转化为植物可利用的营养物质——基于代谢组学和农学证据的探讨

《Environmental Technology & Innovation》：From Waste to Resource: Alkaline Protease Converts Aquaculture Sediment into Plant-Bioavailable Nutrients—Metabolomic and Agronomic Evidence

　　埃比尼泽·安诺尔 | 徐慧敏 | 陈茜 | 钱丽萍 | 李丹丹 | 方龙翔 | 刘卓平 | 宋超 | 孟顺龙 | 范丽敏
中国无锡，南京农业大学无锡渔业学院，214081

**摘要**
水产养殖产生的沉积物堆积给环境带来了挑战，但同时也提供了资源回收的机会。本研究创新性地采用了碱性蛋白酶水解方法，将来自三种不同来源的沉积物——大口黑鲈（Micropterus salmoides）池塘、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）池塘以及大口黑鲈养殖场尾水处理区的沉积物——转化为液体有机肥料，并通过代谢组学和农艺试验对其进行了评估。沉积物分析显示，其总氮含量为536.02–530.12毫克/千克，总磷含量为747.97–649.13毫克/千克。酶处理（pH 8.3，45°C，3小时）显著提高了养分的生物可利用性，代谢组学结果显示植物可利用的化合物（如L-谷氨酸）显著富集（log?FC ≥ 3.2）。使用小白菜（Brassica rapa var. glabra Regel）进行的盆栽实验表明，使用大口黑鲈沉积物衍生的肥料能够促进植物生长，效果最佳（植株高度：6.6厘米；生长率：31.64%）。通路分析表明，氨基酸生物合成和碳代谢途径显著增强（P < 0.05）。这些结果表明，来自高蛋白质需求鱼类池塘的沉积物经碱性蛋白酶处理后的水解物具有更强的植物促生长效果；然而，其他来源的沉积物水解物可能具有不同的生物活性。这项工作为水产养殖废弃物的资源化利用提供了一种绿色、高效的方法，推动了循环生物经济的发展。

**1. 引言**
目前，水产养殖提供了全球超过一半的食用鱼类，对满足日益增长的蛋白质需求至关重要（FAO，2024年）。然而，其集约化养殖方式导致了严重的环境问题，尤其是池塘底部富含有机物的沉积物堆积。这些沉积物由未被食用的饲料、粪便和微生物残骸组成，是碳、氮、磷和微量营养素的储存库（Boyd等人，2007年）。关键的是，这些沉积物的成分高度异质，受多种养殖方式的影响。虽然它们代表了资源回收的机会，但也带来了处理难题。传统的清淤和填埋方法在经济和环境上成本高昂，常常加剧富营养化和温室气体排放（Dauda等人，2019年；Mehmood等人，2023年）。将这些沉积物用作有机土壤改良剂是一种循环经济的选择。它们的高有机质含量可以改善土壤结构和微生物活性，符合再生农业的理念（Burducea等人，2022年）。然而，直接施用于土地会受到养分矿化速度慢、生物可利用性不稳定、水分含量高以及潜在病原体风险的限制。进行全面的安全评估（包括重金属（如Cd、Pb、Hg、As）、有机污染物（如PCBs、PAHs）和病原体（如沙门氏菌、大肠杆菌、蠕虫卵）的分析）是获得监管批准和农业风险评估的必要前提。尽管本研究主要证明了酶转化的概念并评估了养分的生物可利用性，但我们认识到全面的安全性评估超出了本研究的范围。不过，所使用的碱性条件（pH 8.3）已知具有部分杀灭病原体的效果（Bujoczek等人，2001年），但这需要针对水产养殖沉积物进行专门验证。因此，需要先进的转化策略将这种复杂的有机基质转化为稳定、安全且植物可利用的资源。

**2. 材料与方法**
**2.1. 样本采集**
2024年8月，使用Van Veen抓取采样器从每个池塘或处理区的中心采集表层沉积物（深度0–10厘米）：一个来自尼罗罗非鱼池塘的中心点，一个来自大口黑鲈池塘的中心点，另一个来自大口黑鲈池塘尾水处理区的中心点。采样地点位于中国江苏省苏州市的吴江朱建国农场（大致GPS坐标：31.0°N，120.6°E）。尼罗罗非鱼池塘系统没有尾水处理区。每个采集的沉积物样本独立分成四个重复样本进行分析。这样得到了四个来自大口黑鲈池塘的样本（PS1–PS4）、四个来自其尾水处理区的样本（PtS1–PtS4）和四个来自尼罗罗非鱼池塘的样本（TS1–TS4）。这些池塘均位于吴江朱建国农场。沉积物样本随后被转移到标记好的干净塑料容器中，并在24小时内运输到实验室，在运输过程中保存在4°C的冷藏箱中。

**2.2. 细菌16S rRNA基因高通量测序及群落分析**
使用商业土壤DNA提取试剂盒（PowerSoil? DNA Isolation Kit，Qiagen，德国希伦登）按照制造商的 protocol从所有沉积物样本中提取 total genomic DNA。使用通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增细菌16S rRNA基因的V3–V4高变区。PCR反应条件如下：初始变性98°C持续2分钟，随后进行27个循环的98°C变性15秒、55°C退火30秒、72°C延伸5分钟。高通量测序使用Illumina MiSeq平台在苏州Panomike Biomedical Technology Co., Ltd.完成。原始读数使用QIIME 2（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v. 2023.7）进行处理。简单来说，正向和反向读数被解复用并过滤质量，然后合并和修剪。通过DADA2去噪算法生成扩增子序列变异体（ASVs）以解析微观微生物多样性。使用QIIME 2中的classify-sklearn算法（Bokulich等人，2018年）和Greengenes数据库（版本13.8）进行分类。使用R（版本4.4.2）和vegan包分析不同沉积物样本中细菌群落的β多样性（主成分分析，PCAS）。

**2.3. 沉积物的预处理及理化参数测定**
除了用于细菌16S rRNA基因高通量测序外，沉积物样本还经过预处理以进行理化分析并生产水解有机肥料。样本在真空条件下（通常<10 Pa）冰冻干燥76小时，以确保水分完全去除。干燥后的沉积物用研钵研磨并通过0.2毫米筛网筛选，以获得均匀的颗粒大小，以便进一步分析。总磷（TP）采用碱熔融-钼-锑抗色光法测定；氨氮（NH??–N）采用Nessler试剂色光法测定；硝酸盐氮（NO??–N）采用紫外色光法测定；亚硝酸盐氮（NO??–N）也采用色光法测定；总氮（TN）采用碱性过硫酸钾消化-紫外色光法测定。有机质含量通过火焰灰化法（LOI）测定（Hoogsteen等人，2018年），沉积物pH值按照土壤pH值测定协议进行分析。

**2.4. 水解有机肥料的制备与表征**
本研究使用来自Sigma-Aldrich的碱性蛋白酶（产品编号P4860，Bacillus licheniformis，比活性≥2.4 U/mg）。将0.25克该酶（相当于约600 U）溶解在30毫升含Tween 20（TBST）缓冲液的Tris缓冲液中，然后稀释至最终体积100毫升，并用NaOH调节pH至8.0。基于初步的单因素优化实验和中心组合设计（数据未展示），选择水解条件（pH 8.3，45°C，3小时）。评估的参数包括pH（7.5–9.5）、温度（35–55°C）和水解时间（1–5小时），以可溶性蛋白浓度（通过BCA测定）作为主要响应变量。在pH 8.3、45°C、3小时的条件下观察到最大可溶性蛋白释放量（1.2 ± 0.1毫克/毫升），这与Bacillus licheniformis的碱性蛋白酶的最佳活性范围（pH 8.0–8.5，40–50°C）一致（Hou等人，2021年）。该过程的产率，定义为上清液中回收的可溶性固体质量与沉积物干质量之比，在所有沉积物类型中约为18–22%，与其他有机废物（例如污泥）的酶水解产率相当或更高（例如Tongco等人，2020年）。不含酶的溶液（0克）用作对照组，含有0.25克碱性蛋白酶的溶液作为酶处理组。将5克每个冻干沉积物与上述两种溶液混合，然后在45°C下连续摇动孵育3小时。孵育后，在4°C下以1,500rpm离心20分钟，收集上清液并保存在4°C下进一步分析。随后，分别从大口黑鲈池塘、尼罗罗非鱼池塘和大口黑鲈尾水处理区的沉积物中制备三个对照组，分别标记为PC（PC1–PC4）、TC（TC1–TC4）和PtC（PtC1–PtC4）。来自相同沉积物来源的相应碱性蛋白酶处理组也分别标记为PE（PE1–PE4）、TE（TE1–TE4）和PtE（PtE1–PtE4）。

**2.5. 蛋白质定量**
使用Bicinchoninic酸（BCA）工作溶液进行蛋白质定量（Tsukazaki等人，2023年）。将上清液样品与BCA工作溶液混合，在60°C下孵育30分钟。使用分光光度计在562纳米处测量吸光度。蛋白质浓度基于牛血清白蛋白（BSA）生成的标准曲线确定。

**2.6. 沉积物水解物的非目标代谢组学分析**
采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行非目标代谢组学分析。色谱分离在Vanquish UHPLC系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）上完成，该系统配备ACQUITY UPLC? HSS T3柱（2.1 × 100毫米，1.8微米，Waters，美国米尔福德），流速为0.3毫升/分钟，进样量为2微升。对于ESI（+）模式，流动相为（A）0.1%甲酸水溶液和（B）0.1%甲酸乙腈溶液；对于ESI（?）模式，流动相为（A）5毫摩尔甲酸水溶液和（B）乙腈。两种模式下均施加了10%至98% B的线性梯度，持续5分钟。质谱检测在Q Exactive Focus四极杆质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）上进行，采用full MS/ddMS2模式。参数包括：m/z范围100–1000，MS1分辨率70,000，MS2分辨率17,500，喷雾电压+3.5千伏（ESI+）或?2.5千伏（ESI?），毛细管温度325摄氏度，固定碰撞能量30电子伏。使用metaX软件进行偏最小二乘（PLS）分析以识别区分样本组的代谢物。基于两个标准选择差异代谢物：（1）倍数变化≥2（|log?FC| ≥ 1）和（2）统计显著性（P < 0.05，通过双尾t检验确定）。为了评估代谢物的重要性，计算了综合得分|log?FC| × (?log??p值），综合考虑效应大小和显著性（Zhang等人，2023年）。

**2.7. 小白菜盆栽实验**
将小白菜种子（Brassica rapa var. glabra Regel）放置在与去离子水接触的湿润纸巾上（Reynolds等人，2024年）。设置置于光照下以刺激发芽，在进行盆栽实验前确认种子活力（Motsa等人，2015年）。当幼苗长到约1厘米高时将其移植到盆中。从农田中采集壤土，风干后筛除杂质（Bai等人，2024年）。每个塑料盆（直径4厘米×深度5厘米）中填充10克准备好的土壤。每个盆中移植两株小白菜幼苗。随后，将第2.4节中制备的每个重复实验溶液各50毫升施加到每个花盆中作为灌溉。50毫升的水解物在移植时作为单次剂量施用；在21天的生长期间未提供额外的灌溉，以避免混淆效应。对照组（PC、TC和PtC）接受了等体积（50毫升）的相应无菌水提取物（不含酶），其制备方法与第2.4节中描述的相同。根据用于制备灌溉溶液的沉积物来源和处理类型，盆栽实验产生了三个对照组——PC（来自鲈鱼池塘沉积物）、TC（来自罗非鱼池塘沉积物）和PtC（来自鲈鱼尾水处理区沉积物）——以及三个相应的碱性蛋白酶处理组：PE、TE和PtE。温室条件维持在25±2°C和70±5%的相对湿度下，光照时间为16小时（自然阳光加上人工照明）。21天后，测量了植物高度（从茎基部到最长叶尖）、叶片数量和生长速率，以评估处理效果（Azad等人，2020年）。小白菜的生长速率使用以下公式计算（Poorter等人，2005年）：生长速率（厘米/天）=（最终植物高度（厘米）- 初始植物高度（厘米）/ 天数。

2.7 统计分析
统计分析使用SPSS软件（版本23.0；SPSS公司，美国伊利诺伊州芝加哥）进行。结果以平均值±标准误差的形式呈现（Mean ± SE）。在确认数据正态性（Shapiro-Wilk检验）和方差齐性（Levene检验）后，使用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）来评估组间营养成分、细菌群落结构和白菜生长情况的差异。当P < 0.05时，认为不同沉积物类型之间的平均营养浓度差异具有统计学意义。对于总氮含量的比较，PS（536.02 ± 4.03 mg/kg）和TS（530.12 ± 3.00 mg/kg），单因素方差分析得出的P值为0.041，差异的95%置信区间为（0.28, 11.52）mg/kg。使用Fisher最小显著差异（LSD）检验进行事后多重比较，以确定组间的具体差异。使用R软件（版本4.4.2）中的vegan包进行了Procrustes分析，以评估沉积物细菌群落与其相应水解物中的差异代谢物之间的关联。还在R（版本4.4.2）中进行了随机森林（RF）分析，以确定促进白菜生长的关键因素。

3. 结果与讨论
3.1 不同来源沉积物的营养特征：资源回收的基础
本研究表征了三个不同水产养殖来源沉积物的基础营养特性：大口鲈鱼（Micropterus salmoides）养殖池（PS）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）养殖池（TS）和鲈鱼养殖场尾水处理区（PtS）的沉积物。这种评估对于制定有针对性的资源化策略至关重要，因为营养成分受特定物种的养殖实践和废物处理过程的影响。
图1显示了八种关键营养参数在不同沉积物类型中的浓度：铵态氮（NH??-N；图1A）、亚硝酸盐氮（NO??-N；图1B）、硝酸盐氮（NO??-N；图1C）、总氮（TN；图1D）、总磷（TP；图1E）、钾（K；图1F）、胞外聚合物物质（EPS；图1G）和有机物（OM；图1H）。结果显示，除了钾（其顺序为PS > PtS > TS）外，所有其他参数在池塘沉积物（PS和TS）中都显著高于尾水处理区沉积物（PtS）。这种模式表明，包括预处理在内的尾水处理区的净化过程显著降低了最终沉降到水体底部的悬浮颗粒中的营养物质浓度（Dauda等人，2019年），这与旨在减少废物排放的循环生物经济原则一致（Yang等人，2023年）。PtS沉积物中较低的养分水平表明其直接资源化潜力有限，尽管可以通过下游过程如酶法水解来增强其价值。

3.2 来自不同来源的沉积物的营养特性：资源回收的基础
本研究表征了三种不同水产养殖来源沉积物的基础营养特征：大口鲈鱼（Micropterus salmoides）养殖池（PS）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）养殖池（TS）以及鲈鱼养殖场尾水处理区（PtS）的沉积物。这一评估对于制定有针对性的资源化策略至关重要，因为营养成分受到特定物种的养殖实践和废物处理过程的影响。
图1展示了不同沉积物类型中八种关键营养参数的浓度：铵态氮（NH??-N；图1A）、亚硝酸盐氮（NO??-N；图1B）、硝酸盐氮（NO??-N；图1C）、总氮（TN；图1D）、总磷（TP；图1E）、钾（K；图1F）、胞外聚合物物质（EPS；图1G）和有机物（OM；图1H）。结果表明，除了钾（其顺序为PS > PtS > TS）外，所有其他参数在池塘沉积物（PS和TS）中都显著高于尾水处理区沉积物（PtS）。这种模式表明，尾水处理区的净化过程，包括预处理，显著降低了最终沉降到水体底部的悬浮颗粒中的营养物质浓度（Dauda等人，2019年），这与旨在最小化废物排放的循环生物经济原则一致（Yang等人，2023年）。PtS沉积物中较低的养分水平表明其直接资源化潜力有限，尽管可以通过下游过程如酶法水解来增强其价值。

关于氮的形式，总氮（TN）在PS中的浓度（536.02 ± 4.03 mg/kg）显著高于TS中的浓度（530.12 ± 3.00 mg/kg）（单因素方差分析：P = 0.041，95%置信区间：0.28–11.52 mg/kg）。事后LSD检验确认PS与TS之间存在显著差异（P = 0.041），但与PtS之间没有显著差异（P > 0.05）。相反，三种无机氮形式（NH??-N、NO??-N和NO??-N）在TS中更为丰富。这种差异主要归因于特定物种的喂养方式。作为肉食性鱼类，大口鲈鱼通常被喂食高蛋白饲料（通常超过40%的粗蛋白），导致未食用的饲料和粪便中的氮输入量较大，从而在沉积物中积累了更多的有机氮（Boyd等人，2007年；Ng和Romano，2013年）。相比之下，罗非鱼是杂食性鱼类，被喂食蛋白质含量相对较低的饲料，但其沉积物中显示出更活跃的微生物矿化作用，能迅速将有机氮转化为无机形式。这一机制得到了细菌群落分析的支持（图2），该分析显示TS沉积物中富含有利于矿化的菌门，如Firmicutes。

图2显示了所有沉积物样本在门（A）和属（B）水平上的细菌群落组成，以及基于主成分分析（PCA）的β多样性分析（C和D）。(A) 所有沉积物样本中前20个最丰富的细菌门的相对丰度。右上角的插图放大了相对丰度排名第11到20位的门，包括统计显著性比较的结果。(B) 前20个最丰富的细菌属的相对丰度。条形图上不同的字母表示通过单因素方差分析后进行的Fisher最小显著差异（LSD）检验确定的统计显著差异（P < 0.05）。在氮的形式方面，PS中的总氮浓度（536.02 ± 4.03 mg/kg）显著高于TS中的浓度（530.12 ± 3.00 mg/kg）（单因素方差分析：P = 0.041，95%置信区间：0.28–11.52 mg/kg）。事后LSD检验确认PS与TS之间存在显著差异（P = 0.041），但与PtS之间没有显著差异（P > 0.05）。相比之下，三种无机氮形式（NH??-N、NO??-N和NO??-N）在TS中更为丰富。这种差异主要归因于不同物种的喂养方式。作为肉食性鱼类，大口鲈鱼通常被喂食高蛋白饲料（通常超过40%的粗蛋白），导致未被食用的饲料和粪便中的氮输入量较大，这些氮在沉积物中积累为较大的有机氮库（Boyd等人，2007年；Ng和Romano，2013年）。相比之下，罗非鱼是杂食性鱼类，被喂食蛋白质含量较低的饲料，但其沉积物显示出更活跃的微生物矿化作用，能快速将有机氮转化为无机形式。这一机制得到了细菌群落分析的支持（图2），该分析显示TS沉积物中富含有利于矿化的菌门，如Firmicutes。

总的来说，不同来源的水产养殖沉积物需要定制化的处理策略，以最大限度地提高营养回收效率并支持可持续的农业应用。

3.2 鲈鱼池塘、罗非鱼池塘和尾水处理区沉积物中的细菌群落
水产养殖沉积物中的细菌群落组成和多样性在营养循环中起着关键作用，并可能显著影响酶法水解过程中的有机物分解和营养转化（Wu等人，2023年；Zhang等人，2024年）。在本研究中，高通量16S rRNA基因测序揭示了大口鲈鱼池塘（PS）、罗非鱼池塘（TS）和鲈鱼池塘尾水处理区（PtS）沉积物之间细菌群落结构的显著差异。如图2A所示，Proteobacteria、Bacteroidota、Actinobacteriota、Firmicutes和Chloroflexi是所有样本中的主导菌门，合计占总相对丰度的70%以上。其中，Bacteroidota、Firmicutes和Chloroflexi在不同沉积物类型之间存在显著差异（P < 0.05）。具体来说，Bacteroidota在PS中的丰度最高（24.0 ± 8.15%），而在TS中的丰度最低（5.84 ± 0.9%）；Firmicutes在TS中的丰度最高（11.4 ± 1.7%），而在PtS中的丰度最低（0.6 ± 0.2%）。相比之下，Chloroflexi在TS中的相对丰度最高（9.1 ± 1.7%），而在PS中的丰度最低（3.0 ± 0.2%）。这些菌门级别的模式与第3.1节描述的营养特征密切相关，因为Bacteroidota和Firmicutes在蛋白质降解和氮矿化过程中起着重要作用（Tang等人，2024年），这些过程可能调节随后的酶法水解效率。在属级别（图2B），Flavobacterium、Rhodoferax和Hydrogenophaga是最常见的菌属。Flavobacterium在PS中的丰度显著高于TS（17.9 ± 9.1% vs 1.1 ± 1.2%），而Hydrogenophaga在PtS中的丰度最高（9.2 ± 4.9%），在TS中的丰度最低（0.007 ± 0.009%）。尽管Rhodoferax在不同组之间没有显著差异（P > 0.05），但在TS中的相对丰度较高（15.2 ± 13.8%）。

主成分分析（PCA）进一步确认了不同来源沉积物细菌群落的明显聚类（图2C），前两个主成分（PC1和PC2）分别解释了44.5%和27.8%的总方差。相应的加载图（图2D）确定了驱动样本组间分离的关键菌属：Flavobacterium和Methylotenera与PS密切相关；Rhodoferax和候选分类单元SZB30与TS密切相关；Hydrogenophaga、Desulfuromonas和Massilia与PtS密切相关。这些微生物群落的变化可能反映了不同沉积物类型之间的有机物组成、营养物质的可用性和氧化还原条件（Zhao等人，2023年）的差异。例如，Flavobacterium在PS中的高丰度——其因其胞外蛋白酶活性而闻名（Zhao等人，2023年）——可能通过预先处理复杂蛋白质为更易利用的基质，从而协同增强碱性蛋白酶介导的水解作用。相反，Hydrogenophaga在PtS中的优势表明该菌属适应了微好氧或厌氧环境（Martinez-Rosales和Castro-Sowinski，2011年），表明微生物适应了尾水处理区的生物地球化学条件。总体而言，这些发现突显了沉积物来源如何塑造废物资源化过程中 resident microbiomes 的功能潜力。此外，代谢活跃细菌的持续存在表明它们可能在酶法处理过程中对营养物质的矿化有潜在贡献，尽管需要进行有针对性的宏基因组学或宏转录组学分析来确定具体的代谢途径（Kellogg和Kang，2020年）。总体而言，这种微生物特征分析为根据每种沉积物的独特微生物和生化背景优化水解协议提供了关键基础。

3.3 来自多种水产养殖沉积物的碱性蛋白酶水解物的化学性质
基础分析显示，大口鲈鱼池塘（PS）、罗非鱼池塘（TS）和鲈鱼池塘尾水处理区（PtS）沉积物中的总氮（TN）、总磷（TP）和有机物（OM）存在显著差异（图1）。这些沉积物强调了它们作为营养库的更大潜力（Braga等人，2019年）。经过碱性蛋白酶处理后，所有沉积物类型的水解物中关键营养物质的含量比仅用水处理的对照组显著增加（P < 0.05；图3A、D–H）。具体来说，氨态氮（NH??-N）、TN、TP、OM、钾（K）和胞外聚合物物质（EPS）在酶处理组（PE、TE、PtE）中的浓度明显高于相应的对照组（PC、TC、PtC）。这些结果证实了碱性蛋白酶能有效溶解复杂的有机基质，从而提高营养物质的生物可利用性。

值得注意的是，无机氮形式的影响因沉积物来源而异。亚硝酸盐-氮（NO??-N）仅在PE（鲈鱼来源的水解物）中显著增加，而硝酸盐-氮（NO??-N）仅在TE（罗非鱼来源的水解物）中增加。相比之下，NO??-N在PE和PtE中都减少了（图3B–C）。这些不同的模式可能反映了原始微生物活性和初始底物组成的差异。例如，TS沉积物具有较高的无机氮基线水平（图1A–C），这表明可能存在更活跃的矿化过程，这些过程可能与酶促水解相互作用，从而影响最终产品的特性（Zou等人，2022年）。总体上的营养物释放与已建立的蛋白酶辅助增值机制一致，在碱性条件下（pH 8–11），肽键被断裂，释放出植物可利用的氨基酸和肽（Tongco等人，2020年）。需要注意的是，本研究中使用的碱性条件（pH 8.3）可能具有内在的安全优势。先前的研究已经证明，碱性pH值和升高的温度可以灭活有机废物中的许多病原微生物（Lopes等人，2020年）。然而，在农业应用之前，需要使用标准化的病原体检测方法进行全面的验证。我们建议未来的研究应包括根据既定指南（例如WHO/FAO关于有机肥料安全的标准）进行定量风险评估。优化的水解条件（pH 8.3，45°C，3小时）被选为最大化蛋白质溶解度，这直接促进了水解物中观察到的营养物生物利用度的提高（图3）。18–22%的工艺产率表明沉积物有机物质有效转化为了可溶性、植物可利用的形式。

3.4. 非靶向代谢组学揭示了水解物的营养和生物活性潜力
基于LC–MS/MS的非靶向代谢组学提供了关于酶促水解引发的生化转化的深入分子见解。在PE（来自PS）中，识别出448种差异积累的代谢物，其中氨基酸和肽占了最大比例（16.07%；图S1）。值得注意的生物活性化合物包括rhodovibrin（抗氧化剂）、albaflavenone（抗菌剂）和norspermine（参与应激信号传导的多胺）（表S1），这些变化反映了沉积物中相关微生物基因表达的同步变化（Kellogg和Kang，2020年）。KEGG通路富集分析显示中央碳代谢、蛋白质消化和吸收以及矿物质吸收途径显著激活（P < 0.05；图S2）——这些过程直接与随后植物试验中观察到的营养物生物利用度提高相关。类似地，TE（来自TS）产生了364种差异代谢物，主要为氨基酸/肽（18.53%）和碳水化合物（9.91%；图S3）。棕榈油酸（一种抗炎脂肪酸）和L-色氨酸（生长素植物激素的前体）的水平升高（表S2）表明除了基本营养外，还可能具有额外的农学效益，可能促进植物生长和抗逆性（Noor等人，2023年；Xiong等人，2020年）。富集的通路包括咖啡因代谢和FoxO信号传导（图S4）——这两者都与植物的氧化应激耐受性和发育调节相关。

在PtE（来自PtS）中，检测到365种代谢物，其中包括生物活性脂质和生物碱，如前列腺素E?（一种信号分子）和东莨菪碱（一种托烷生物碱）（表S3）。通路分析突出了专门的代谢途径，包括异喹啉生物碱的生物合成（图S6），这可能有助于作物产生系统抗性（Menéndez-Perdomo和Facchini，2018年）。总体而言，代谢组学证实碱性蛋白酶水解不仅提高了蛋白质的可消化性，还释放了一系列低分子量的代谢物，包括维生素、脂肪酸和次级代谢物，这些代谢物具有抗氧化、抗菌和促进植物生长的特性。这将水产养殖沉积物水解物的功能范围从简单的肥料扩展到了多功能生物刺激剂。这种转化体现了循环生物经济的理念，将废物转化为高价值产品，并减少了对合成投入的依赖（Yang等人，2023年）。

3.5. 将原生细菌群落与水解物组成联系起来
Procrustes分析显示沉积物细菌群落结构与所得水解物的化学特征之间存在强烈一致性。观察到微生物组成与传统养分（例如NH??-N；M2 = 0.02239，P = 0.001）以及差异代谢物特征（M2 = 0.5892，P = 0.017；图5）之间存在显著相关性，表明本土微生物在酶处理过程中积极调节养分释放——可能是通过与外源蛋白酶的协同作用（Zou等人，2024年）。这些发现直接证明了现有的微生物生态是废物增值效率的关键决定因素，这一现象也在厌氧消化系统中观察到，其中预处理改变了微生物组和性能（Lu等人，2020年）。总的来说，我们的多组学和物理化学分析表明，碱性蛋白酶水解不仅有效地将异质的水产养殖沉积物转化为富含营养的、生物活性的水解物。本土微生物群、酶的作用以及沉积物特定组成之间的协同作用不仅增强了营养物的溶解度，还塑造了最终产品的功能特性。这种综合理解为根据沉积物来源定制增值策略提供了机制基础——将水产养殖废物转化为安全的多功能肥料，支持循环农业和可持续的营养循环。

3.6. 碱性蛋白酶水解物对小白菜生长的影响及其潜在驱动因素
使用小白菜（Brassica rapa subsp. chinensis）在盆栽试验中评估了来自水产养殖沉积物的碱性蛋白酶水解物的农学潜力。如图4所示，来自大口鲈鱼池（PE）、罗非鱼池（TE）和鲈鱼尾水处理区（PtE）的水解物显著提高了关键生长参数——植株高度（图4A）、叶片数量（图4B）、根长（图4C）和生长速率（图4D）——与只用无菌水处理的对照组（PC、TC、PtC）相比，后者反映了通过被动渗出或残余微生物活动释放的基线养分。这证实了酶促水解能够有效地将沉积物中的养分转化为植物可利用的形式，优于非酶提取方法。
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图4. 来自不同沉积物来源的水解物对小白菜（Brassica rapa subsp. chinensis）生长的影响。实验组定义如下：PC——仅用无菌水处理的大口鲈鱼池沉积物水解物；PtC——仅用无菌水处理的大口鲈鱼养殖场尾水处理区沉积物水解物；TC——仅用无菌水处理的罗非鱼池沉积物水解物；PE——经过碱性蛋白酶水解处理的大口鲈鱼池沉积物水解物；PtE——经过碱性蛋白酶水解处理的罗非鱼养殖场尾水处理区沉积物水解物；TE——经过碱性蛋白酶水解处理的罗非鱼池沉积物水解物。图(A)–(D)显示了反映小白菜生长的四个指标：(A) 高度，(B) 叶片数量，(C) 根长，(D) 生长速率。条形上方不同的字母表示通过单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）随后进行Fisher最小显著差异（LSD）事后检验后确定的统计显著差异（P < 0.05）。
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图5. 随机森林（Random Forest，RF）分析确定了与小白菜（Brassica rapa subsp. chinensis）生长指标相关的关键代谢物。x轴代表四个生长相关特征：植株高度、叶片数量、根长和相对生长速率。y轴列出了预测这些特征时最具影响力的前50种差异代谢物。百分比增长干扰均值平方误差（%IncMSE）衡量了当生育指标随机排列时预测误差的平均百分比增加。较高的值表示这些指标对预测生长指标的影响更大（高度/叶片数量/根长/生长速率）。颜色强度反映了每种代谢物的相对重要性——更深的颜色表示在RF模型中的重要性更高。
生长促进效果也因沉积物来源而异，反映了养分含量和微生物组成的内在差异。PE水解物使植株高度（6.6 ± 0.2厘米）、根长（2.5 ± 0.2厘米）和生长速率（31.65 ± 3.19%）最高，超过了TE和PtE。尽管6.6厘米的植株高度可能看起来不高，但在21天内它比对照组（PC，5.0 ± 0.2厘米）增长了31.6%，这对于通常在25–30天内收获的快速生长的叶类蔬菜小白菜来说是农学上相关的。在相同条件下，商业液体肥料（例如，20-20-20 NPK，浓度为1克/升）产生的植株高度为7.1 ± 0.3厘米，表明PE水解物的效果约为合成肥料的93%。成本效益分析显示，PE水解物的成本约为每个盆0.04美元，而商业NPK肥料的成本为每个盆0.06美元，成本降低了33%，同时保持了相当的性能。此外，还计划对其他叶类蔬菜（如菠菜、生菜）进行田间试验，以验证这种沉积物衍生肥料的更广泛的农学适用性。这种优异的性能与鲈鱼池沉积物中较高的总氮（TN：536.02毫克/千克）和总磷（TP：747.97毫克/千克）相吻合（第3.1节），这可能归因于蛋白质丰富饲料残渣的输入更多。TE表现出中等效果，而来自养分贫乏尾水处理区的PtE则显示出最弱的反应，这突显了沉积物来源作为肥料质量的关键决定因素。为了识别促进生长的化学驱动因素，应用了随机森林（Random Forest，RF）回归分析。NH??-N、TN和有机物（OM）成为所有生长特征的最主要预测因子（图S7），显示出最高的%IncMSE值。氮的可用性直接支持叶绿素生物合成、叶片扩展和光合作用能力（Muhammad等人，2022年）。钾（K）与植株高度和生长速率有很强的正相关性，可能通过其在渗透调节和酶激活中的作用（Xu等人，2021年），而总磷（TP）对根系发育影响最大，这与其在能量转移（ATP）和细胞分裂中的作用一致（Kihara等人，2020年）。这些结果证实了在优化肥力条件下，氮（N）和磷（P）之间的协同作用能够促进植物生物量（Bhardwaj等人，2022年）。

在代谢物水平上，综合RF分析识别出50种与生长结果显著相关的差异代谢物（图5）。氨基酸及其衍生物构成了最大的功能组（34%），包括作为植物激素（如生长素）和缓解压力化合物前体的必需氨基酸（如异亮氨酸、缬氨酸）（Sun等人，2024年）。维生素及其衍生物（24%）——尤其是吡哆胺和核黄素——可能作为促进植物生长和发育的潜在因素（Gopala等人，1987年）。它们在各种代谢和生物学功能中起着重要作用，特别是在氮代谢中（Caldés等人，2011年；Miret和Munné-Bosch，2014年）。特定的代谢物，如3-羟基月桂酸和γ-丁内酯，与植株高度有很强的关联（图S8），可能作为信号分子（Al-Babili和Bouwmeester，2015年；Weber，2002年）。值得注意的是，N?-乙酰氨基丁醛和脱氢组氨酰色氨酸二酮哌嗪在多个生长特征中反复出现（图S8–S11），表明它们可能在调节中起核心作用（Alcázar等人，2010年）。总体而言，这项研究表明，碱性蛋白酶水解不仅提高了蛋白质的可消化性，还释放了多种低分子量代谢物，包括维生素、脂肪酸和具有抗氧化、抗菌和促进植物生长特性的次级代谢物。这将水产养殖沉积物水解物的功能范围从简单的肥料扩展到了多功能生物刺激剂。这种转化体现了循环生物经济学的原则，将废物转化为高价值产品，并减少了对合成投入的依赖（Yang等人，2023年）。

3.7. 限制与未来展望
这项研究表明，碱性蛋白酶能够有效地将水产养殖沉积物转化为植物可利用的营养物质，但仍存在一些限制。首先，沉积物的安全性评估不完整：没有对重金属（如Cd、Pb、Hg、As）、有机污染物（如PCBs、PAHs）或病原体（如沙门氏菌、大肠杆菌、蠕虫卵）进行分析。这些参数对于监管批准和农业风险评估至关重要。未来的研究应使用标准化方法（如EPA的重金属检测方法、GC-MS的有机污染物检测方法和ISO的病原体检测方法）进行全面的安全性评估。此外，虽然本研究中使用的碱性条件（pH 8.3，45°C）根据文献证据预计可以减少病原体负荷（Bujoczek等人，2001年），但仍有必要专门研究处理后沉积物的生物安全性。对于实际应用，我们建议采取分层的安全评估方法：(1) 初始筛查重金属和病原体，(2) 小规模田间试验并监测，(3) 基于验证的安全阈值进行监管批准。其次，实验仅使用了鲈鱼和罗非鱼池塘的沉积物，限制了其应用于其他系统（如虾塘或双壳类农场）的可能性。第三，实验室实验缺乏实际环境的复杂性——如土壤变异性、气候和生物相互作用——因此田间表现尚未得到验证。第四，尽管代谢组学显示营养物生物利用度有所提高，但并未评估长期风险（如土壤微生物组破坏、重金属积累或残留病原体），尽管假设碱性条件可以抑制污染物。第五，没有进行经济分析；碱性蛋白酶的成本大约为每克0.15–0.30美元，加热所需的能源成本（45°C，3小时）也不可忽视。初步的成本估计显示，每盆酶的成本约为0.04美元，而商业NPK肥料的成本为每盆0.06美元，这代表了33%的成本降低。此外，还计划对其他叶类蔬菜（如菠菜、生菜）进行田间试验，以验证这种沉积物衍生肥料的更广泛的农学适用性。这种优异的性能与鲈鱼池沉积物中较高的总氮（TN：536.02毫克/千克）和总磷（TP：747.97毫克/千克）相符（第3.1节），这可能归因于富含蛋白质的饲料残渣的输入较多。TE表现出中等效果，而来自养分贫乏尾水处理区的PtE显示出最弱的反应，这强调了沉积物来源作为肥料质量的关键决定因素。为了识别促进生长的化学驱动因素，应用了随机森林（RF）回归分析。NH??-N、TN和有机物（OM）成为所有生长特征的最主要预测因子（图S7），显示出最高的%IncMSE值。氮的可用性直接支持叶绿素生物合成、叶片扩展和光合作用能力（Muhammad等人，2022年）。钾（K）与植株高度和生长速率有很强的正相关，可能通过与渗透调节和酶激活的作用有关（Xu等人，2021年），而总磷（TP）对根系发育影响最大，这与其在能量传递（ATP）和细胞分裂中的作用一致（Kihara等人，2020年）。这些结果证实了在优化肥力条件下，氮（N）和磷（P）之间的协同作用能够促进植物生物量。在代谢物水平上，综合RF分析识别出50种与生长结果显著相关的差异代谢物（图5）。氨基酸及其衍生物构成了最大的功能组（34%），包括作为植物激素（如生长素）和缓解压力化合物前体的必需氨基酸（如异亮氨酸、缬氨酸）（Sun等人，2024年）。维生素及其衍生物（24%）——尤其是吡哆胺和核黄素——可能作为促进植物生长和发育的潜在因素（Gopala等人，1987年）。它们在各种代谢和生物学功能中起着重要作用，特别是在氮代谢中（Caldés等人，2011年；Miret和Munné-Bosch，2014年）。特定的代谢物，如3-羟基月桂酸和γ-丁内酯，与植株高度有很强的关联（图S8），可能作为信号分子（Al-Babili和Bouwmeester，2015年；Weber，2002年）。值得注意的是，N?-乙酰氨基丁醛和脱氢组氨酰色氨酸二酮哌嗪在多个生长特征中反复出现（图S8–S11），表明它们可能具有核心调节作用——可能是通过抗氧化调节（Alcázar等人，2010年）。总体而言，这项研究表明，碱性蛋白酶水解将水产养殖沉积物转化为多功能有机肥料，其效果受生物可利用的氮/磷（N/P）、有机物和一系列生物活性代谢物的调控。沉积物来源对产品品质至关重要，需要根据来源调整处理方法以最大化资源回收。通过将废物污泥转化为高价值的植物生物刺激剂，这种方法推动了循环水产养殖-农业系统的发展，并减少了对合成投入的依赖（Yang等人，2023年）。

3.7. 限制与未来展望
这项研究表明，碱性蛋白酶能够有效地将水产养殖沉积物转化为植物可利用的营养物质，但仍存在一些限制。首先，沉积物的安全性评估不完整：没有对重金属（如Cd、Pb、Hg、As）、有机污染物（如PCBs、PAHs）或病原体（如沙门氏菌、大肠杆菌、蠕虫卵）进行分析。这些参数对于监管批准和农业风险评估至关重要。未来的研究应使用标准化方法进行全面的安全性评估。此外，虽然本研究中使用的碱性条件（pH 8.3，45°C）根据文献证据预计可以减少病原体负荷（Bujoczek等人，2001年），但仍有必要专门研究处理后沉积物的生物安全性。对于实际应用，我们建议采取分层的安全评估方法：(1) 初始筛查重金属和病原体，(2) 小规模田间试验并监测，关于微生物-酶相互作用的机制研究可以优化水解过程，并开发出超越传统肥料的多功能生物刺激剂。最终，这种方法提供了一种循环解决方案——将水产养殖废弃物转化为有价值的肥料——以支持可持续农业和资源回收。4. 结论 本研究首次将碱性蛋白酶水解技术与多组学（微生物组学和代谢组学）以及农艺学验证相结合，系统地阐明了将不同来源的水产养殖沉积物转化为功能性肥料的潜力及其机制差异。结果表明，来自水产养殖池塘的沉积物具有比尾水处理区沉积物更高的营养成分潜力，尤其是那些养殖高蛋白需求物种（如大口黑鲈）的池塘沉积物，其营养成分潜力更是显著。碱性蛋白酶水解显著提高了养分生物有效性，特别是通过显著增加氨氮和氨基酸衍生的代谢物（如L-谷氨酸）的相对浓度，这些代谢物与小白菜的生长呈显著正相关。值得注意的是，沉积物中天然存在的微生物也参与了水解过程。此外，代谢组学分析显示，水解产物富含多种生物活性化合物，这表明来自不同水产养殖物种的沉积物可以用来生产不同的功能性生物刺激剂。通过将水产养殖废弃物转化为高附加值的有机肥料，这一策略同时解决了两大全球性问题：减少水产养殖操作造成的营养污染和沉积物积累，并通过提供合成肥料的可持续替代品来推进绿色农业的发展。这种双重贡献体现了循环生物经济的原则。

作者贡献声明：
孟顺龙：资金获取
刘卓平：方法学研究
宋超：实验设计
方龙翔：方法学研究
陈曦：实验设计
李丹丹：方法学研究、实验设计
徐慧敏：数据可视化、软件应用
邱丽萍：实验设计
范立民：写作、审稿与编辑、项目监督、概念构思
埃比尼泽·阿诺尔：原创稿撰写