两栖动物长期接触农药：评估氟吡啶呋酮（Flupyradifurone）和2,4-滴丁酸（2,4-D）对Galganoi盘舌蟾（Discoglossus galganoi）及Perezi青蛙（Pelophylax perezi）发育的影响

《Environmental Toxicology and Pharmacology》：Chronic Exposure to Pesticides in Amphibians: Assessing the Effects of Flupyradifurone and 2,4-D on the Development of Discoglossus galganoi and Pelophylax perezi

　　塞缪尔·冈萨雷斯-洛佩兹（Samuel González-López）、佩德罗·佩罗（Pedro Peiró）和曼努埃尔·E·奥尔蒂斯-桑塔利埃斯特拉（Manuel E. Ortiz-Santaliestra）
西班牙雷阿尔城（Ciudad Real）ISC（CSIC-UCLM-JCCM）游戏与野生动物研究研究所

**摘要**
两栖动物是全球受威胁最严重的脊椎动物类群之一，但在农药风险评估中却常常被忽视。本研究评估了除草剂2,4-D和杀虫剂氟吡呋喃（flupyradifurone）单独使用或联合使用对两种生态特征不同的两栖动物物种——Discoglossus galganoi和Pelophylax perezi幼体发育的长期影响。实验中，幼体在整个发育过程中暴露于不同浓度的这两种农药中（0.01–100 mg/L），监测指标包括存活率、变态时间、身体状况以及畸形情况。结果表明，Pelophylax perezi对这些农药的敏感性较低，只有在最高浓度（100 mg/L）下才表现出明显影响；而Discoglossus galganoi则对两者及其混合物均表现出高度敏感性，表现为死亡率升高、生长受抑制、变态延迟以及畸形增加，尤其是在2,4-D的作用下。这些物种特异性的反应凸显了现有脊椎动物替代模型的局限性，强调了在涉及农药混合物的真实暴露情景下开展包含两栖动物的风险评估的必要性。

**1. 引言**
全球范围内，两栖动物种群数量持续下降，超过40%的物种被列为濒危或近危物种（IUCN《濒危物种红色名录》2025-1版）。这些下降趋势归因于多种环境压力因素，包括栖息地破坏、气候变化、新发疾病和污染（Blaustein等人，2003年）。其中，农药污染是一个重要因素，尤其是在农业环境中，两栖动物经常接触到多种除草剂、杀虫剂和杀菌剂的混合污染（Egea-Serrano等人，2012年）。尽管人们对农药对两栖动物的潜在毒性越来越担忧，但美国环境保护署（EPA）和欧洲食品安全局（EFSA）等监管机构在批准农药时并未进行专门针对两栖动物的毒性测试（EFSA植物保护产品及其残留物小组，2018年）。目前，监管框架通常基于脊椎动物替代物种推导毒性数据，这种方法未能充分考虑两栖动物独特的生理、发育和生态特性（Ortiz-Santaliestra等人，2018年）。

历史上，环境风险评估主要依赖基于鱼类的毒性模型来预测农药对两栖动物的影响（Glaberman等人，2019年）。一些研究表明鱼类和两栖动物对化学物质的敏感性存在一定相关性，尤其是在急性毒性方面（Weltje等人，2013年）；然而也有研究指出，两栖动物的敏感性可能因化学物质性质、暴露途径和发育阶段而异（Awkerman等人，2024年；Brühl等人，2011年）。例如，幼年两栖动物还可能通过喷雾、皮肤接触或食物摄入等方式暴露于农药中，而这些途径在鱼类测试中并未得到充分考虑（Johnson等人，2016年；Weltje等人，2018年）。实际上，两栖动物和鱼类对化学物质的敏感性之间的关联主要集中在短期致死性（96小时半数致死浓度LC50）上，而长期发育、行为和繁殖等方面的影响则尚未得到证实（EFSA植物保护产品及其残留物小组，2018年）。这种忽视导致了对慢性、亚致死性毒性的严重低估，尽管有证据表明，暴露于实际环境浓度的农药会改变两栖动物的运动能力、进食行为、能量代谢和免疫功能（Pavan等人，2021年）。

两栖动物在多个方面不同于典型的脊椎动物实验物种，这些差异影响了它们对农药的脆弱性。它们具有渗透性皮肤、复杂的生命周期以及双相栖息地，这使得它们更容易受到污染物影响（Ortiz-Santaliestra等人，2018年）。许多两栖动物会经历变态过程，即从水生幼体转变为半水生或陆生幼体，这一生理过程对内分泌干扰化学物质特别敏感（经合组织，2009年；Thambirajah等人，2019年）。这种发育的可塑性使得毒理学预测变得复杂，因为早期幼体阶段的化学暴露可能导致延迟或潜伏性的影响，这些影响可能直到变态后才显现（Hayes等人，2006年）。

不同脊椎动物类群以及不同两栖动物物种对农药的毒性反应存在差异。例如，Triana Velásquez和Bernal Bautista（2025年）发现，Engystomops pustulosus蝌蚪对杀虫剂吡虫啉（imidacloprid）和除草剂2,4-D的敏感性高于Boana platanera，这表明物种特有的生理和生活史特征会影响其对农药的敏感性。Salgado Costa等人（2021年）的研究表明，氯吡rifos会影响Ceratophrys ornata的捕食者-猎物关系，表明农药即使不立即致死，也可能破坏其行为和生态动态。

此外，两栖动物栖息在短暂存在的湿地、池塘和农业沟渠中，这些生态系统经常受到农药径流的影响，且水文条件难以预测，因此亚致死性影响可能对它们的生长、发育或行为造成危害，进而影响生存和繁殖成功率（Adams等人，2021年）。在伊比利亚半岛，Discoglossus galganoi是一种特有的无尾两栖动物，它们在浅水临时池塘中繁殖，其短暂的幼体期使其面临较大的干燥风险。Pelophylax perezi则生活在永久或半永久性水域中，繁殖活动主要发生在晚春和初夏，受温度影响显著（Richter-Boix等人，2006年）。像Discoglossus galganoi这样栖息在湿流动性较强的环境中的两栖动物特别容易受到变态延迟的影响，如果水源在蝌蚪完成发育前干涸，可能导致大规模死亡（Chandler等人，2017年）。像Discoglossus galganoi这样的物种特有的快速幼体发育周期与水文周期紧密相关；任何延迟变态的化学压力都可能加剧这些影响。这种生活史策略在自然条件下具有适应性，但在某些情况下可能使它们更容易受到干扰发育过程或生长过程的化学物质的伤害。相比之下，生活在稳定水域中的物种（如Pelophylax perezi）面临慢性低剂量暴露的风险，且农药在体内的积累几率更高（Brodeur等人，2022年）。

两种广泛使用的农药——氟吡呋喃（flupyradifurone）和2,4-D——凸显了当前评估两栖动物农药毒性的挑战。氟吡呋喃（Sivanto? Prime）是一种丁烯内酯类杀虫剂，作为新烟碱类杀虫剂的替代品，通过作用于尼古丁型乙酰胆碱受体（nAChRs）诱导目标昆虫的麻痹和死亡（Bartlett等人，2018年）。尽管研究表明氟吡呋喃的急性毒性低于传统新烟碱类杀虫剂，但其对非目标两栖动物的影响仍知之甚少（Jerez等人，2022年）。由于尼古丁型乙酰胆碱受体在脊椎动物中具有进化保守性，慢性暴露可能导致神经、发育和行为方面的问题，即使剂量低于致死剂量（Glaberman等人，2019年）。氟吡呋喃的持久性和系统性特征引发了对其在富含两栖动物的生态系统中长期积累和影响的担忧。另一方面，2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）是全球应用最广泛的除草剂之一，主要用于农业、林业和住宅区的阔叶杂草防治（Zaller，2020年）。尽管一些监管机构认为2,4-D对两栖动物“基本无毒”，但实验室研究表明，暴露于实际环境浓度下会导致蝌蚪存活率降低、生长受阻和游泳速度下降（Pavan等人，2021年；Triana Velásquez和Bernal Bautista，2025年）。这些亚致死性效应可能增加捕食风险、降低竞争能力并削弱生理恢复力，最终影响整个种群（Relyea，2006年）。已公布的2,4-D对无尾两栖动物蝌蚪的96小时半数致死浓度（LC50）因物种和制剂不同而介于100至400 mg/L之间（Triana Velásquez和Bernal Bautista，2025年），说明实际环境浓度下的急性致死性远高于这一范围。目前尚未公布氟吡呋昂针对两栖动物的具体LC50值。在农业区附近的地表水中，2,4-D的浓度通常在ng/L至低μg/L之间，但在施用后可能会产生μg/L至低mg/L的短暂峰值；在直接喷洒或点源污染情况下，浓度可能达到几mg/L甚至更高（Lewis等人，2016年）。由于氟吡呋喃的广泛应用时间较短，环境监测数据较为有限，但在常规使用条件下，地表水中的浓度通常低于0.1 mg/L，施用后可能会出现短暂高峰。由于两栖动物经常接触到农药混合物，其叠加或协同效应是一个重要但研究不足的问题，特别是在农业领域，经常使用多种农药或混合活性成分的制剂。例如，两栖动物可能同时暴露于2,4-D和其他除草剂（如草甘膦类制剂），从而产生协同毒性作用（Peluso等人，2022年）。

本研究调查了商业制剂氟吡呋喃（Sivanto? Prime）和2,4-D（Primma? Dos）对两种伊比利亚两栖动物（Discoglossus galganoi和Pelophylax perezi）的发育和存活的长期多剂量影响。通过系统监测从早期幼体阶段到完全成熟个体的存活率、生长和发育情况，本研究旨在：（1）评估不同发育阶段对这些化合物的物种特异性敏感性；（2）识别传统急性毒性测试无法发现的慢性亚致死性影响（如生长抑制、变态延迟、发育异常）；（3）评估杀虫剂和除草剂暴露之间的潜在相互作用，包括叠加或协同毒性效应；（4）为改进监管风险评估提供实证数据，倡导在农药审批过程中纳入两栖动物。基于这些生态差异，我们提出了以下假设：
（H1）Discoglossus galganoi对这两种化合物的敏感性高于Pelophylax perezi，因其生理可塑性较低且依赖于快速幼体发育以避免干燥；另一种假设（H1-alt）认为Pelophylax perezi较长的幼体期可能增加了累积的毒性暴露，从而使其具有相似或更高的敏感性。
（H2）2,4-D的发育影响可能比氟吡呋喃更强，因其已知会干扰调节两栖动物变态的甲状腺和视黄醇信号通路；另一种假设（H2-alt）认为氟吡呋喃通过作用于保守的尼古丁型乙酰胆碱受体，也可能产生类似的神经发育效应。
（H3）两种化合物的联合暴露可能产生叠加或高于叠加（协同）的效应，特别是在Discoglossus galganoi中；另一种假设（H3-alt）认为如果解毒途径相同，混合物效应可能减弱毒性负担。

**2. 材料与方法**
**2.1. 研究物种和卵收集**
我们选择了两种原产于伊比利亚半岛的无尾两栖动物——Discoglossus galganoi（伊比利亚彩蛙）和Pelophylax perezi（伊比利亚绿蛙），因为它们的生活史策略和对农业化学品的敏感性不同。Discoglossus galganoi在短暂存在的池塘中繁殖，其快速幼体发育使其在水生阶段特别容易受到环境压力的影响；而Pelophylax perezi则生活在较为稳定的水域中，幼体期较长，从而更易长期暴露于水生污染物。我们在野外收集了处于Gosner发育阶段8–10期的卵（Gosner，1960年），并将卵连同水源一起运送到位于雷阿尔城El Chaparrillo的ISC实验设施。胚胎被分离后置于FETAX溶液中（Dawson & Bantle，1987年），每48小时更换一次培养液。实验条件为23±1°C，光照周期为14:10小时。孵化后，蝌蚪每周喂食六次TetraMin?颗粒和Sera Micron?（约2%生物量）。

**2.2. 实验设计和农药暴露**
我们对每种物种分别进行了两次独立的长期暴露实验。Pelophylax perezi暴露于单一农药（Sivanto? Prime，含有20%的氟吡呋喃），而Discoglossus galganoi暴露于两种农药及其混合物：Sivanto? Prime和Primma? Dos（后者含有2%的2,4-二氯苯氧乙酸）。实验前几天从当地经销商处购买了这些制剂产品。为了明确起见，本文后续均使用活性成分的名称。
在Pelophylax perezi的实验中，暴露从Gosner阶段31开始（即后肢芽出现时），蝌蚪暴露于不同浓度的氟吡呋喃（0.01、0.1、1、10和100 mg/L），同时设有一个不含农药的对照组（FETAX溶液）。每个处理组重复三次，每个重复组包含5只蝌蚪，饲养在6升的水族箱中。氟吡呋喃在使用前立即配制成FETAX溶液，并每周更换两次处理水以保持稳定的暴露条件。在达到变态高潮期（Gosner阶段42）时，即前肢出现时，将个体转移到含有150毫升FETAX溶液的单独容器中，该溶液中不添加杀虫剂。容器略微倾斜，以便动物能够接触到水和干燥的表面。每天监测动物的情况，直到变态完成（Gosner阶段46），此时尾巴完全吸收，然后通过浸入缓冲的三卡因甲磺酸盐（MS-222；6克/升，用1摩尔氢氧化钠中和）进行安乐死。

在D. galganoi实验中，杀虫剂处理从Gosner阶段25（自由游动的幼虫）开始，在收集后进行12天的培养期。蝌蚪被分配到十二个处理组中：五个2,4-D浓度组（0.03、0.3、3、30和100毫克/升），两个flupyradifurone浓度组（10和100毫克/升），四个组合处理组（0.3或30毫克/升的2,4-D × 10或100毫克/升的flupyradifurone），以及一个无杀虫剂的对照组。每个处理组重复三次，每个重复组中有十个蝌蚪，置于6升的水族箱中。2,4-D和flupyradifurone都在使用前用FETAX溶液配制。处理过的水每周更换两次。在达到变态高潮期后，将个体转移到与P. perezi实验中相同的单独容器中，直到变态完成，然后采用相同的程序进行安乐死。不同物种之间的实验设计差异反映了它们不同的发育速率和生活史特征。D. galganoi实验在较早的发育阶段（Gosner 25 vs. P. perezi的Gosner 31）开始，以涵盖该物种自然更快的幼虫发育过程，而之前的12天培养期允许在收集卵后8-10阶段的胚胎继续发育。D. galganoi实验中蝌蚪的密度较高（每个水族箱10只 vs. P. perezi的5只），这是因为在Gosner阶段25时，这种物种的体型明显小于P. perezi的蝌蚪，因此在暴露开始时每个水族箱的总生物量相当。尽管不同的起始阶段引入了物种之间的固有不对称性，限制了绝对效应大小的直接比较，但这种设计旨在涵盖每个物种的生态相关发育窗口，并允许在整个幼虫到幼体的转变过程中进行测试。

这些实验中使用的暴露浓度（0.01-100毫克/升）旨在涵盖环境相关水平和最坏情况。较低范围（0.01-3毫克/升）反映了农业径流和邻近湿地中报告的浓度，而较高范围（10-100毫克/升）模拟了如杀虫剂喷洒过量或点源泄漏等急性污染事件。由于水更换频率很高，我们没有确认水族箱中的杀虫剂浓度。据报道，2,4-D和flupyradifurone在水系统中的平均降解时间分别为7.7天和31.4天（Lewis等人，2016年），这表明在每48小时更换一次水的情况下，化合物浓度保持稳定。

在两个实验中，每天都监测存活情况，并在发现死亡动物时立即将其从水族箱中移除。在幼虫发育期间，每周在水族箱水更换时对动物进行两次称重和测量。来自同一水族箱的蝌蚪被放入干净干燥的培养皿中并一起称重；然后从上方拍摄蝌蚪的照片，并使用ImageJ软件处理图像以计算个体从吻部到尾部的长度（SVL），随后计算每个水族箱的平均SVL。当个体达到变态高潮期和变态完成时，也使用相同的程序测量体重和SVL，尽管在这种情况下所有测量都是针对单个个体的。体重和SVL后来被用来计算身体条件指数（BCI = [质量（克）/ SVL（毫米）3] × 100；Fulton，1902）。

2.3. 终点和统计分析

在幼虫期间，每日监测累积存活率，并使用Kaplan–Meier估计量和成对对数秩检验（Holm调整）进行分析。当个体达到变态高潮期时将其视为删失值。存活到变态高潮期和完成期的情况进一步使用泛线性混合效应模型（GLMMs）进行分析，并拟合二项错误分布和对数链接。固定效应包括P. perezi的flupyradifurone浓度和2,4-D浓度，以及D. galganoi的flupyradifurone浓度及其交互作用。水族箱作为随机截距。

通过每个水族箱的平均身体条件指数（BCI）来评估幼虫生长，每周测量两次，直到第一个变态个体出现。使用线性混合效应模型（LMMs）分析BCI随时间的变化，将天数（自暴露开始以来的天数，作为连续协变量）作为协变量，并采用上述相同的固定效应结构。在变态高潮期开始之后没有分析生长数据，因为将变态中的个体转移到单独容器中会逐渐减少每个水族箱中的动物数量，从而引入非随机的平均BCI值偏差（较早达到高潮期的个体可能在状况上系统性地不同于较晚变态的个体）。

对于BCI在变态期间的变化，进行了两种补充分析。首先，所有达到高潮期的个体都被纳入一个具有Gamma分布和对数链接的GLMM中，使用与生存模型相同的固定效应和随机效应结构。其次，为了比较变态高潮期和完成期的BCI，只使用完成变态的个体。该模型也假设了Gamma分布和对数链接，并将阶段（一个具有两个水平的分类变量：变态高潮期和变态完成期）作为固定效应，将个体作为随机截距以解释重复测量。

使用Gamma分布的GLMMs分析达到变态高潮期的时间（自实验开始以来的天数），采用与生存模型相同的固定效应和随机结构。

在D. galganoi实验中，使用包括2,4-D浓度、flupyradifurone浓度及其交互作用的二项GLMM来评估畸形发生率，将水族箱和个体作为随机截距。为了评估畸形对存活的影响，还拟合了一个额外的GLMM，将畸形状态作为固定效应，以及杀虫剂浓度和水族箱及个体作为随机截距。由于在P. perezi实验中没有观察到发育畸形，因此没有对该物种进行这种分析。应该注意的是，这种分析反映了实验室条件，在这些条件下没有捕食和种内竞争；在自然环境中，这些选择力量具有影响，因此畸形相关的存活劣势可能比这里观察到的要大得多。

所有模型最初都拟合了完整的固定效应和随机截距集。然后应用反向模型选择，基于似然比检验（对于随机效应）和赤池信息量准则（对于整体模型拟合）比较来移除非显著项。即使不显著，也始终保留杀虫剂浓度，以确保测试处理效应。当随机项不会改善模型拟合时，改用非混合模型（GLMs或LMEs）。当更复杂的模型获得了更低的AIC但包含非显著交互项时，出于简单性的考虑，保留较简单的模型作为选定的模型。

对于所有选定的模型，使用最小显著差异（LSD）事后检验进行处理水平之间的成对比较。在包含2,4-D × flupyradifurone交互作用的模型中，对复合处理因子（将浓度合并成处理组）进行比较，以便于解释对比结果。

所有统计分析都是在R v4.4.2（R Core Team., 2024）中使用的，使用了survival、lme4、glmmTMB、car、lmerTest和emmeans包。

2.4. 生物伦理考虑

所有实验和程序都获得了卡斯蒂利亚-拉曼查自治区政府（Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha）的批准（授权参考编号11-2023），根据西班牙立法（RD 53/2013第3条），该机构是动物实验的主管机构。

3. 结果

3.1. Pelophylax perezi实验

3.1.1. 存活率

Kaplan-Meier生存分析显示，暴露于最高浓度flupyradifurone（100毫克/升）的蝌蚪的存活率显著低于所有其他处理组（图1），包括对照组（Χ2 = 25.56，df = 5，p = 0.0001）。在对照组与低于100毫克/升的任何flupyradifurone处理组之间没有发现累积存活率的显著差异。

图1. 在76天的实验期间，暴露于六种不同浓度flupyradifurone（0 [对照]、0.01、0.1、1、10和100毫克/升）的Pelophylax perezi蝌蚪的Kaplan–Meier生存曲线。y轴表示随时间的存活比例。曲线上的步骤表示死亡事件。刻度标记（+）表示被插入的观察值，即达到变态高潮期并被转移到单独容器中的个体；它们的存活时间记录到转移时刻。

用于分析达到变态高潮期存活率的模型显示了flupyradifurone处理的显著效应（表1）。与我们所观察到的幼虫存活情况一致，事后LSD成对比较表明，暴露于100毫克/升flupyradifurone的存活率显著低于对照组（p < 0.005），仅为6.7%，而所有其他处理的存活率在40%到73%之间（图2）。在对照组与低于100毫克/升的处理组之间没有发现显著差异。用于分析达到变态完成期的GLM没有检测到显著的总体处理效应（表1）。

表1. 选定的模型用于评估flupyradifurone暴露对Pelophylax perezi存活率、身体条件（BCI）和发育时间的影响。对于每个因变量，列出了候选模型及其相对于最低AIC值的ΔAIC。选定的模型（?）代表了在拟合优度和简洁性之间取得平衡的最佳支持模型。在GLMM/LMM显示出随机效应方差估计接近零（~0）的情况下，选择了没有随机效应的更简单GLM/LM作为最佳支持模型，因为随机效应解释的额外变异可以忽略不计。对于幼虫BCI（ΔAIC = 0.49），接近零的水族箱方差证实了选择更简单模型的合理性，尽管AIC差异很小。

因变量 | 模型 | AIC | ΔAIC | 固定效应 | 选定模型的结果 | 随机效应方差 |
|------|------|------|-------|------------|-------------------|
| 达到变态高潮期的存活 | GLMM: ~ Flupyradifurone + (1|Aquarium) | 118,952 | Flupyradifurone: χ2(5) = 11.75, p = 0.038 | Aquarium: ~0 |
| 达到变态高潮期的存活 | GLMM: ~ Flupyradifurone | 116,950 | ?Flupyradifurone: χ2(5) = 19.82, p = 0.001 | 4?? |
| 达到变态完成期的存活 | GLMM: ~ Flupyradifurone + (1|Aquarium) | 106,892 | Flupyradifurone: χ2(5) = 6.02, p = 0.304 | Aquarium: ~0 |
| 达到变态完成期的存活 | GLMM: ~ Flupyradifurone | 104,890 | ?Flupyradifurone: χ2(5) = 7.21, p = 0.205 | 3 |
| 随时间变化的幼虫BCI | LMM: ~ Flupyradifurone × Day + (1|Aquarium) | -1442,280,49 | Flupyradifuronet: χ2(5) = 9.39, p = 0.095 | Flupyradifurone×Day: χ2(5) = 13.44, p = 0.020 | Aquarium: 3.12e-07 |
| 随时间变化的幼虫BCI | LM: ~ Flupyradifurone × Day | -1442,770 | ?Flupyradifurone: χ2(5) = 9.40, p = 0.094 | Day: χ2(1) = 0.002, p = 0.963 | 8 |
| 变态高潮期的BCI | LM: ~ Flupyradifurone + (1|Aquarium) + (1|Individual) | -302,637 | 1,65Flupyradifurone: χ2(5) = 1.05, p = 0.958 | Aquarium: 1.86e-06 | Individual: ~0 |
| 变态高潮期与完成期的BCI | LM: ~ Flupyradifurone | -374,280 | ?Flupyradifurone: χ2(5) = 1.21, p = 0.943 | 6 |
| 变态高潮期与完成期的BCI（仅包括存活个体） | LMM: ~ Flupyradifurone × Stage + (1|Aquarium) + (1|Individual) | -434,841 | 40,18Flupyradifurone: χ2(5) = 1.62, p = 0.899 | Stage: χ2(1) = 22.18, p < 0.001??? | Flupyradifurone×Stage: χ2(5) = 0.67, p = 0.984 |
| 达到变态高潮期的天数 | GLMM: ~ Flupyradifurone + (1|Aquarium) + (1|Individual) | 333,570 | ?Flupyradifurone: χ2(5) = 5.09, p = 0.405 | 1Aquarium: 0.018 | 0 |
| 个体 | 0.018 | 8 | 下划线字母表示存活率显著不同的处理组（p < 0.05）；由于没有处理对完成期存活率有显著影响，因此没有显示处理之间的成对比较 |

3.2. 生长和身体条件

用于评估随时间变化的幼虫BCI的模型显示，flupyradurone处理的效应边缘不显著（p < 0.1），而flupyradurone × 天的交互作用具有统计学意义（表1），表明不同处理组的BCI轨迹随时间有所不同。事后检查模型估计显示，暴露于100毫克/升flupyradurone的幼虫在第24天的BCI接近显著较低（p = 0.061），表明在最高浓度下可能存在晚期生长抑制效应（图S1）。

用于评估flupyradurone对P. perezi在变态高潮期BCI影响的模型显示，处理水平之间没有显著差异（表1）。当将变态高潮期和完成的生物体质量指数（BCI）包含在同一个模型中时，我们发现阶段对动物状况有显著影响（BCI = [质量 / SVL3] × 100；预计从高潮期到完成期，由于尾部质量的吸收而BCI会下降，而体长变化相对较小，从而降低了质量:SVL3的比例），但flupyradifurone处理或处理与阶段的交互作用没有显著影响（表1），这表明在所有暴露组中，变态过程中的状况下降是一致的（图S2.3.3）。3.3 变态高潮时间 Flupyradifurone暴露对达到变态高潮的时间没有显著影响（表1）（图S3.3.4 Discoglossus galganoi实验 3.4.1 生存 Kaplan-Meier生存曲线和成对对数秩检验显示，2,4-D和flupyradifurone的暴露显著影响了D. galganoi幼体的生存概率（图3）。在100 mg/L的2,4-D处理中，24小时内就发生了完全死亡。与对照组相比，暴露于100 mg/L flupyradifurone（p = 0.0302）和30 mg/L 2,4-D + 10 mg/L flupyradifurone混合物处理后也出现了显著的生存率下降。尽管Kaplan-Meier生存曲线在视觉上表明30 mg/L 2,4-D处理和30 mg/L 2,4-D + 100 mg/L flupyradifurone混合物处理的生存概率降低，但统计结果并未显示出显著差异。这种差异可能是由于晚期死亡的发生以及被审查观察结果的影响（在Kaplan-Meier分析中，达到变态高潮的个体被视为被审查的事件，即它们的观察时间记录到转移至单独容器为止；当晚期死亡集中在产生较少到达高潮个体的高剂量组时，导致被审查事件的减少，从而降低了检测幼体生存曲线差异的统计功效）。下载：下载高分辨率图像（301KB）下载：下载全尺寸图像图3. Discoglossus galganoi蝌蚪暴露于不同浓度的(a) 2,4-D单独，(b) flupyradifurone单独，或(c) 两种物质组合后的Kaplan–Meier生存曲线。y轴表示随时间变化的存活个体比例。曲线上的步进表示死亡事件。刻度标记（+）表示被审查的观察结果，即那些达到变态高潮并转移到单独容器中的个体；它们的观察时间记录到转移的时刻。在GLMM模型中评估达到变态高潮的生存情况时，2,4-D浓度有显著的总体影响，而flupyradifurone没有（表2）。然而，在100 mg/L flupyradifurone处理中记录到显著更高的死亡率（图4）。如生存曲线的视觉观察所示，模型显示包含30 mg/L 2,4-D的处理显著降低了幼体的生存率（p = 0.0003）。对于完成变态的生存，GLMM模型输出显示2,4-D和flupyradifurone浓度有显著影响（表2）。事后比较显示，这两种杀虫剂的所有处理水平，无论是单独使用还是组合使用，都导致变态成功率低于对照组（图4）。这种降低反映了变态高潮后个体饲养期间的死亡；所有未能完成变态的个体都在完全吸收尾部之前死亡。表2. 选定的模型用于评估2,4-D、flupyradifurone及其组合对Discoglossus galganoi的生存、身体状况（BCI）、发育时间和畸形发生率的影响。对于每个因变量，列出了候选模型及其AIC值和相对于最低AIC模型的ΔAIC值。选定的模型（?）代表了在拟合优度和简洁性之间取得平衡的最佳支持的模型：当一个更复杂的模型获得了较低的AIC值但包含非显著的交互项时，保留了更简单的模型作为选定模型。~0表示参数空间边界附近或处的随机效应方差估计，表明该模型在鱼缸内的变异可以忽略不计。因变量 模型 AIC ΔAIC 选定的固定效应和结果随机效应方差 达到变态高潮的生存 GLMM: ~ 2,4-D x Flupyradifurone + (1|Aquarium) 171,294,232,4-D: χ2(5) = 0.00, p = 1.000 Flupyradifurone: χ2(2) = 2.16, p = 0.3402,4-D × Flupyradifurone: χ2(4) = 1.85, p = 0.764Aquarium: 2.804 达到变态高潮的生存 GLMM: ~ 2,4-D + Flupyradifurone + (1|Aquarium) 167,060?2,4-D: χ2(5) = 13.17, p = 0.0218?Flupyradifurone: χ2(2) = 2.84, p = 0.2422Aquarium: 3.645 完成变态的生存 GLMM: ~ 2,4-D x Flupyradifurone + (1|Aquarium) 346,2502,4-D: χ2(5) = 15.56, p = 0.008??Flupyradifurone: χ2(2) = 5.47, p = 0.0652,4-D × Flupyradifurone: χ2(4) = 2.51, p = 0.642Aquarium: ~0 完成变态的生存 GLMM: ~ 2,4-D + Flupyradifurone + (1|Aquarium) 366,6420,39?2,4-D: χ2(5) = 34.02, p < 0.001???Flupyradifurone: χ2(2) = 7.95, p = 0.0188?Aquarium: 0.5397 幼体BCI随时间变化 GLMM: ~ Day × 2,4-D x Flupyradifurone + (1|Aquarium)-978,980Day: χ2(2) = 50.82, p < 0.001???2,4-D: χ2(1) = 0.43, p = 0.5100Flupyradifurone: χ2(1) = 0.12, p = 0.7317Day × 2,4-D: χ2(2) = 17.54, p < 0.001???Day × Flupyradifurone: χ2(2) = 0.06, p = 0.96902,4-D× Flupyradifurone: χ2(1) = 0.03, p = 0.8670Day × 2,4-D × Flupyradifurone: χ2(2) = 1.26, p = 0.5324Aquarium: 0.000968 幼体BCI随时间变化 GLMM: ~ Day + 2,4-D x Flupyradifurone + (1|Aquarium)-970,468,52?Day: χ2(2) = 33.23, p < 0.001???2,4-D: χ2(5) = 28.77, p < 0.001???Flupyradifurone: χ2(2) = 1.02, p = 0.6013Aquarium: 0.001694 变态高潮期的BCI GLMM: ~ 2,4-D x Flupyradifurone + (1|Aquarium)-2001,951,732,4-D:: χ2(1) = 8.42, p = 0.004Flupyradifurone: χ2(1) = 0.94, p = 0.3312,4-D×Flupyradifurone: χ2(1) = 0.28, p = 0.595Aquarium: 0.0033 变态高潮期的BCI GLMM: ~ 2,4-D + Flupyradifurone + (1|Aquarium)-2003,680?2,4-D: χ2(1) = 7.83, p = 0.0051??Flupyradifurone: χ2(1) = 0.64, p = 0.4231Aquarium: 0.0033 变态高潮期与完成期的BCI（仅包括存活个体）GLMM: ~ 2,4-D x Flupyradifurone x Stage + (1|Aquarium) + (1|Individual)-3400,192,782,4-D: χ2(1) = 11.11, p < 0.001???Flupyradifurone: χ2(1) = 1.34, p = 0.2468 Stage: χ2(1) = 4249.78, p < 0.0012,4-D ×Stage: χ2(1) = 9.28, p = 0.002Flupyradoflupyradone×Stage: χ2(1) = 12.69, p < 0.001Individual: 0.0166239Aquarium: 0.000765 变态高潮期与完成期的BCI（仅包括存活个体）GLMM: ~ 2,4-D x Stage + Flupyradoflupyradoflupyrone x Stage + (1|Aquarium) + (1|Individual)-3402,980?Stage: χ2(1) = 4345.15, p < 0.0012,4-D: χ2(1) = 13.28, p < 0.001Flupyradoflupyradoflupyrone: χ2(1) = 1.01, p = 0.3142,4-D × Stage: χ2(1) = 9.23, p = 0.0024Flupyradoflupyradoflupyrone × Stage: χ2(1) = 11.37, p < 0.001Individual: 0.0166386Aquarium: 0.0007729 达到变态高潮的天数 GLMM: ~ 2,4-D × Flupyradoflupyrone + (1|Aquarium) + (1|Individual)-3141,70?2,4-D: χ2(1) = 105.63, p < 0.001Flupyradoflupyradoflupyrone: χ2(1) = 0.19, p = 0.6592,4-D × Flupyradoflupyradoflupyrone: χ2(1) = 15.20, p < 0.001Individual: 3.585e-02Aquarium: 1.932e-02 畸形频率 GLMM: ~ Treatment + (1|Aquarium) + (1|Individual)163,50?2,4-D: χ2(4) = 51.07, p < 0.001???Flupyradoflupyradoflupyrone: χ2(1) = 2.42, p = 0.120Individual: 3.28e-07Aquarium: 7.65e-01 与畸形相关的完成变态生存 GLMM: ~ malformed + (1|Aquarium) + (1|Individual)327,420?畸形（是/否）: χ2(1) = 12.75, p = 0.0004???Individual: 7.904e-09Aquarium: 8.720e-01 下载：下载高分辨率图像（184KB）下载：下载全尺寸图像图4. Discoglossus galganoi个体在变态高潮期和完成期的平均生存比例（±标准误差），涉及单独暴露于2,4-D（0.03–100 mg/L）或flupyradifurone（10和100 mg/L）的农药处理，以及两种化合物的组合。数据代表每种处理三个重复鱼缸的平均值（每个重复鱼缸10只蝌蚪）。星号表示在每个发育阶段与对照组有显著差异的处理（p < 0.05），基于使用估计的边际均值进行成对比较。3.5 生长和身体状况 检查幼虫阶段BCI的模型显示，Day对BCI有显著影响，表明身体状况在幼虫发育过程中发生了变化。2,4-D暴露也对BCI有显著影响，而flupyradifurone没有显著影响（表2）。事后成对比较显示，暴露于30 mg/L 2,4-D的幼体，无论是单独使用（p = 0.0448）还是与10 mg/L（p = 0.0051）或100 mg/L flupyradifurone（p = 0.0042）组合使用时，其BCI显著低于对照组。这些影响在第七天就已经可以检测到，表明对农药暴露的响应中生长抑制迅速开始（图5）。相比之下，较低浓度的处理（例如0.03或0.3 mg/L 2,4-D或10 mg/L flupyradifurone）在这段时间内没有显示出与对照组有统计显著差异。下载：下载高分辨率图像（187KB）下载：下载全尺寸图像图5. Discoglossus galganoi幼体在第一周发育期间（第1、4和7天）的平均身体状况指数（BCI = [质量/SVL3] × 100），在不同浓度的2,4-D和flupyradifurone下。数据代表每天每种处理的平均BCI（±标准误差），跨重复鱼缸平均。由于第一天就完全死亡，因此排除了100 mg/L 2,4-D组。在变态高潮期，GLMM显示2,4-D浓度对BCI有显著的负影响，而flupyradifurone没有显著影响（表2）。事后比较显示，单独暴露于30 mg/L 2,4-D的幼体BCI低于对照组（p = 0.0315，图S4）。与P. perezi类似，包括D. galganoi在变态高潮期和完成期的BCI的GLMM模型显示了阶段的显著影响（表2），在完成期BCI显著降低。此外，模型显示了2,4-D的BCI、阶段与2,4-D浓度之间的交互作用以及阶段与flupyradifurone之间的交互作用（表2）。尽管如此，基于LSD风格的事后比较，在完成变态期间没有检测到处理组之间的BCI有统计学上的显著差异（所有p > 0.08）。3.6 变态高潮时间 2,4-D暴露显著影响了D. galganoi的发育时间（表2），较高浓度延迟了变态（图6）。对照组达到变态高潮的平均（±SD）时间为14.3 ± 2.0天。在30 mg/L 2,4-D及其与flupyradifurone的组合下观察到了最长的延迟，导致变态高潮时间从20.5天到37.5天不等。在10 mg/L或100 mg/L添加flupyradifurone并未显著改变2,4-D的效果，尽管30 mg/L 2,4-D + 100 mg/L组比30 + 10 mg/L组发育稍快（p = 0.0038），并且与30 mg/L 2,4-D组相当（p = 0.9642）。此外，在3 mg/L 2,4-D下也观察到了中等的延迟（17.2 ± 3.8天）。下载：下载高分辨率图像（128KB）下载：下载全尺寸图像图6. 小提琴图示说明了Discoglossus galganoi在所有农药处理下达到变态高潮的天数分布。每个点代表每个鱼缸的平均值（±SE），小提琴的宽度反映了该发育范围内观察的相对密度。相反，在暴露于低浓度2,4-D（0.03–0.3 mg/L）的个体中观察到更快的发育，无论是单独使用还是与flupyradifurone组合使用，以及在单独暴露于flupyradifurone的个体中也观察到这种情况。0.3 mg/L 2,4-D和100 mg/L flupyradoflupyrone的加速在统计上是显著的，而0.03 mg/L 2,4-D、10 mg/L flupyradoflupyrone和0.3**讨论**

我们的研究结果表明，长期暴露于除草剂2,4-D和杀虫剂氟吡呋喃对两栖动物的发育和生存产生了影响，并且不同物种之间存在差异。在D. galganoi中，高浓度的2,4-D会延缓变态过程并增加畸形和死亡率，而低浓度的2,4-D（0.3 mg/L）和氟吡呋喃（100 mg/L）则会加速变态。相比之下，P. perezi的反应较为有限，其主要表现为在变态高峰期出现晚期死亡，尤其是在最高测试浓度下。

**5. 氟吡呋喃对不同物种的特异性影响**

P. perezi和D. galganoi对氟吡呋喃暴露的不同反应反映了这两个物种在生态和生理上的关键差异。尽管P. perezi表现出一定的抗性——其显著影响主要限于在最高浓度下的晚期死亡——但D. galganoi的表现更为严重，包括变态加速和变态高峰期死亡率增加。像D. galganoi这样的物种通常在短暂存在的池塘中繁殖，它们的幼体期较短，生理可塑性有限，因此在接触毒素时更容易受到发育障碍的影响（Boone & Semlitsch, 2002）。相比之下，具有较长幼体期、更强生长适应性和更广泛生态位的兩栖动物往往具有更强的解毒酶活性和较低的皮肤通透性，这使得它们对奈酮类系统性杀虫剂等环境污染物具有更高的抵抗力（Hopkins, 2007）。这些生态动态在地中海气候条件下尤为重要，因为像D. galganoi这样的两栖动物依赖于短暂的水文周期来完成幼体发育，并面临着池塘干涸的强烈选择压力。在这种情况下，即使是中等程度的发育时间或能量分配中断也可能导致与栖息地可用性的不同步，最终降低变态后的存活率和种群补充率（Richter-Boix et al., 2006）。

D. galganoi对氟吡呋喃的敏感性增加也可能与其调节应激反应的内分泌和神经发育途径有关。在我们的研究中，作为适应高度季节性环境的物种，D. galganoi在100 mg/L浓度下表现出更早的变态现象，而在10 mg/L浓度下也有这种趋势。这种由应激引起的变态现象是由干旱、温度升高和化学物质暴露等不利条件引发的，已在文献中有详细记录。它主要受下丘脑-垂体-肾（HPI）轴和下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴之间的神经内分泌反馈调控，这些轴调节着启动和促进变态所必需的皮质酮和甲状腺激素水平（Paul et al., 2022, Rousseau et al., 2021）。亚致死性应力因素可以放大这种相互作用，促使早期变态，虽然有助于逃避危险，但会减少个体大小和变态后的存活率（Burraco & Gomez-Mestre, 2016）。

除了内分泌介导的发育变化外，观察到的一些效应也可能与氟吡呋喃本身的神经毒性作用有关。这种化合物与其他丁烯内酯类杀虫剂一样，主要作用于烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs），导致持续的兴奋性信号传导和随后的生理紊乱（Nauen et al., 2015）。尽管大多数研究集中在其 against 害虫的效果上，但nAChRs 在包括两栖动物在内的脊椎动物中都是保守的，它们参与神经肌肉协调、神经发育和激素调节（Malhotra et al., 2021, Piner Benli, 2024）。在发育阶段这些途径的紊乱可能会影响摄食、运动或神经内分泌反馈，可能引发过早变态或减缓生长。这些神经发育效应可能与内分泌应激反应共同作用，有助于解释我们观察到的加速变态现象。

**5.1. Discoglossus galganoi 对 2,4-D 暴露的敏感性**

在测试的农药中，除草剂2,4-D对D. galganoi的影响最为显著，在高浓度（100 mg/L）下会导致急性死亡，在较低、环境可行的暴露浓度（≤3 mg/L）下则表现出广泛的亚致死性发育效应。这些观察结果与Rhinella arenarum的研究结果一致，其中暴露于草甘膦和2,4-D混合物的幼体显示出显著的死亡率和发育异常，这突显了早期生命阶段对农药混合物的高度敏感性（Peluso et al., 2022）。含有2,4-D的制剂也被证明会在其他南美物种中引起死亡率、生长抑制和形态异常，例如Physalaemus albonotatus（Curi et al., 2019）和P. cuvieri（Santos et al., 2024）。这些研究进一步表明，尽管2,4-D等除草剂通常被认为对非目标动物物种的危害性小于杀虫剂，但它们会对两栖动物产生强烈的发育毒性，尤其是在敏感的发育窗口期。此外，Brühl等人（2011）强调，两栖动物的早期水生阶段经常与农药施用时期重叠，导致直接喷洒和受污染的径流造成更高的暴露风险。

D. galganoi还表现出明显的发育紊乱，尤其是后肢畸形，这些畸形与2,4-D暴露密切相关。这些畸形往往导致变态失败，因此应被视为一种潜在的死亡形式。这种性质的畸形表明调节骨骼形态发生（包括肢芽模式和骨化）的途径出现了紊乱。此外，高剂量2,4-D组在达到变态高峰期的时间上有明显延迟，表明2,4-D还干扰了关键发育转变的时机。

虽然2,4-D主要是一种合成生长素，但它及其制剂可以干扰甲状腺和类视黄醇信号通路，延缓变态并影响肢体发育（Curi et al., 2019, Fort et al., 2000）。在D. galganoi中，这些紊乱可以解释即使存活且没有明显畸形的个体也出现变态延迟的现象，这意味着可能存在一种不一定伴有解剖缺陷的内分泌干扰。

2,4-D的毒理学特征高度依赖于其制剂形式，因为商业除草剂产品通常含有表面活性剂和助剂，这些成分可以显著增强其生物学效应。这些添加剂提高了生物利用度，增强了膜渗透性，并可能本身具有毒性。重要的是，我们的研究使用了商业2,4-D制剂（Primma? Dos），而不是纯活性化合物，这突显了在实际暴露情景中制剂效应的相关性。

这些亚致死性发育效应——尤其是肢体畸形、变态延迟和变态后状态受损——特别令人担忧，因为它们可能导致潜在的死亡率和长期的健康成本。然而，传统的毒理学检测方法通常在暴露期提前终止检测，无法捕捉到这些效应。例如Amphibian Metamorphosis Assay (AMA)或extended AMA (eAMA)等短期检测在关键的变态转变之前就结束了（例如Gosner阶段42-46），而许多发育紊乱就发生在这一时期。这种时间上的不匹配可能导致对生态风险的严重低估。相比之下，如Larval Amphibian Growth and Development Assay (LAGDA)这样的长期检测方法能更准确地检测整个幼体阶段的发育时间、存活率和形态异常（经济合作与发展组织OECD, 2015）。我们的结果强调了在常规监管测试中使用考虑变态期间效应的方法的重要性，以确保风险评估的准确性。

**5.2. 农药混合物的联合效应**

在D. galganoi中，2,4-D是发育紊乱的主要驱动因素，而氟吡呋喃则产生了相对较小的影响。在较低浓度下，联合暴露的结果各不相同：单独使用0.3 mg/L的2,4-D或100 mg/L的氟吡呋喃时观察到早期变态；0.3 mg/L的2,4-D与100 mg/L的氟吡呋喃联合使用时接近显著加速；相比之下，高剂量组合（30 mg/L的2,4-D）则显著延迟了变态。这些效应与HPI轴的应激激活一致，这可能会导致过早变态。虽然这种反应可能有助于逃避有毒的水生环境，但它会带来显著的能量和生理成本，包括体型减小和变态后存活率降低（Burraco et al., 2017, Fonseca Pe?a et al., 2022）。

这种权衡的生态后果已有充分记录，但混合物效应高度依赖具体情境，受化学物质种类、剂量比和物种敏感性的影响。例如，在Rhinella arenarum中，暴露于草甘膦和2,4-D混合物的情况下就观察到了协同毒性（Peluso et al., 2022）。从机制上看，这些相互作用可能源于多种作用模式，包括甲状腺和皮质类固醇通路的内分泌紊乱以及对细胞色素P450等解毒系统的竞争。Pavan等人（2021）发现，草甘膦-2,4-D混合物在南美两栖动物中引起了行为、形态和遗传毒性效应。

鉴于农业景观中的两栖动物繁殖栖息地经常通过径流和喷洒漂移暴露于农药混合物，这些发现具有重要的生态意义。组织残留分析证实，从农业區捕获的野生青蛙体内存在多种共存的农用化学品，表明在敏感的幼体阶段存在慢性暴露（Brodeur et al., 2022）。实验研究一致表明，即使在亚致死浓度下，这些混合物也会引起协同或不可预测的反应（Peluso et al., 2022）。我们的结果突显了混合物毒性的生态相关性以及联合评估农药的必要性。

**5.3. 对监管风险评估的启示**

我们的研究结果表明，需要修改当前的农药风险评估（ERA）框架，以考虑两栖动物的特定脆弱性。现有的监管协议主要依赖于鱼类和水生无脊椎动物等替代物种，强调急性致死终点（例如LC??），而很大程度上忽略了在两栖动物中常见的复杂亚致死性和发育紊乱现象——包括变态延迟、形态异常以及共存农药之间的不良相互作用。欧洲食品安全局等监管机构已经明确承认了这些局限性，并呼吁在生态风险评估中使用与两栖动物相关的协议（EFSA Panel on Plant Protection Products and their Residues PPR et al., 2018）。我们的结果支持并扩展了这些建议，证明了常用的除草剂和杀虫剂（如2,4-D和氟吡呋喃）可以对幼体发育和生存产生加成和非加成效应，正如我们在D. galganoi中观察到的那样。同时，Fonseca Pe?a等人（2022）报告了在现实环境条件下，本地两栖动物对农药的亚致死性和发育毒性，强调了这些评估端点的生态有效性。Johnson等人（2016）也指出了两栖动物生态毒理学中慢性效应和生命周期特定数据的关键空白，指出传统框架往往缺乏捕捉细微但生物学上重要的结果的分辨率。对于栖息在地中海和其他季节性短暂生态系统中的物种来说，这一空白尤其令人担忧，因为它们的幼体发育时间与栖息地水文周期紧密相关，从而直接影响种群补充和持续性。

为了应对这些不足，ERA系统必须向生态背景化的方法发展。两栖动物具有一系列独特的生理和生命史特征——如双相发育、激素调节的变态以及对水文周期敏感的栖息地的生态依赖性——这些特征在当前的替代模型中未能得到充分体现。准确的农药评估需要采用长期幼体检测方法，如OECD的Larval Amphibian Growth and Development Assay (LAGDA)，以捕捉累积和随时间变化的发育效应。此外，未来的监管范式应整合敏感的亚致死终点——如发育速率、变态成功率、肢体畸形和变态后身体状况——以及传统的致死性指标。评估混合物毒性和内分泌介导的紊乱同样至关重要，因为农药相互作用通常通过共同的分子途径（如甲状腺和皮质类固醇轴）起作用，产生复杂的非加成效应。风险评估还应根据生命阶段、生态位和繁殖策略来分层考虑脆弱性，以考虑物种间的暴露和恢复力差异。

**未引用的参考文献（测试编号231（无日期）**

**CRedI作者贡献声明**

Pedro Peiró：调查、正式分析。Ortiz Manuel：写作－审查与编辑、资源管理、项目管理、方法论、调查、资金获取、概念化。González Samuel：写作－原始草稿、可视化、方法论、调查、正式分析、概念化。