《Enzyme and Microbial Technology》：Chemiluminescent ELISA based on enzyme-mediated hydrogen peroxide supply
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宋贤宇（Hyun-Woo Song）|金洪来（Hong-Rae Kim）|尹泰敬（Tae Gyeong Yun）|郑相珍（Sang Jin Jung）|林泰洙（Taek Su Lim）|姜民正（Min-Jung Kang）|李多英（Do Young Lee）|田哲哲（Jae-Ch
宋贤宇（Hyun-Woo Song）|金洪来（Hong-Rae Kim）|尹泰敬（Tae Gyeong Yun）|郑相珍（Sang Jin Jung）|林泰洙（Taek Su Lim）|姜民正（Min-Jung Kang）|李多英（Do Young Lee）|田哲哲（Jae-Chul Pyun）
延世大学材料科学与工程系
摘要
酶联免疫吸附测定（ELISA）通常使用辣根过氧化物酶（HRP）来检测发色和化学发光信号。这些探针的酶促氧化需要过氧化氢，而过氧化氢在室温和pH条件下本质上是不稳定的，从而影响测定的重现性和长期储存稳定性。在本研究中，建立了一种利用葡萄糖氧化酶（GOD）/葡萄糖的酶介导的过氧化氢供应方法，作为化学发光ELISA的替代过氧化氢来源。该系统的性能与使用过氧化氢溶液的传统ELISA进行了比较。确定了化学发光ELISA的最佳反应条件，包括GOD和葡萄糖的浓度以及反应时间。使用四种商业ELISA试剂盒（用于检测甲胎蛋白（AFP）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、人类免疫缺陷病毒1/2抗体（HIV-1/2 Ab）和癌胚抗原（CEA）），证明了这种酶介导的过氧化氢供应方法的有效性。基于GOD介导的过氧化氢供应的ELISA检测限（LOD）与传统过氧化氢条件相当，统计一致性很高（|平均偏差| ≤ 0.02，|95%一致性限（LoA）| ≤ 0.15，Spearman’s ρ > 0.96）。
引言
酶联免疫吸附测定（ELISA）由Engvall和Perlmann于1971年首次提出，是一种基于抗原-抗体相互作用高特异性的免疫测定方法，已被用作免疫测定的标准化平台[1]、[2]。ELISA是一种能够检测多种生物分子（包括肽、蛋白质和激素）的分析技术，并已应用于临床诊断、食品安全和环境监测等多个领域[3]、[4]。根据诊断需求和灵敏度要求，采用了不同的报告酶和底物组合来生成发色、荧光或化学发光信号，从而增强了ELISA的灵活性和适用范围。
在ELISA中使用的报告酶中，辣根过氧化物酶（HRP）因其相对较高的稳定性和较低的非特异性结合而最为常用。因此，HRP不仅是免疫印迹和免疫组织化学中的优选酶，也广泛用于各种商业ELISA试剂盒中[5]、[6]。HRP可以氧化多种底物，包括发色底物（如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）和o-苯二胺（OPD）[6]、[7]、荧光底物（如Amplex-Red）[8]、[9]以及化学发光底物（如鲁米诺）[10]、[11]。特别是基于鲁米诺的化学发光ELISA的灵敏度比传统的发色ELISA高出约5到30倍[12]、[13]、[14]、[15]。HRP催化的氧化反应需要过氧化氢（H?O?）的存在，且足够的过氧化氢浓度对于有效生成信号至关重要。然而，过氧化氢不稳定，会随时间自发分解成水和氧气[16]；光照、高温和微量金属离子会加速过氧化氢的分解。
为了克服传统（基于过氧化氢的）ELISA的局限性，人们研究了替代的过氧化氢来源。固体过氧化物（如尿素过氧化氢（CO(NH?)?·H?O?）、过硼酸钠（NaBO?·nH?O）和过碳酸钠（2Na?CO?·3H?O?）可以在溶解时释放稳定的过氧化氢[17]、[18]、[19]。过硼酸钠已被用于即时检测中，通过预先储存在底物垫上并在重新水化过程中逐步释放[17]，而过碳酸钠则作为固体氧化剂在溶液中生成过氧化氢[18]。尽管这些方法减少了处理液态过氧化氢溶液的需要，但仍会产生游离的过氧化氢，高浓度的过氧化氢可能会使HRP失活[19]。封装技术（如将过氧化氢嵌入硅胶干凝胶中以实现湿度触发释放[20]）在制造复杂性和成本方面也存在局限性。
作为一种化学储存方法的替代方案，酶促生成过氧化氢是一种有前景的方法。本研究引入了利用葡萄糖氧化酶（GOD；EC 1.1.3.4）介导的过氧化氢生成方法作为过氧化氢的替代来源（图1）。GOD催化β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖内酯和过氧化氢，随后内酯自发水解生成葡糖酸[21]。由于GOD对葡萄糖具有高底物特异性，对其他单糖的活性可以忽略不计[21]、[22]、[23]。由于其固有的稳定性和易于制备的特性，GOD已被用于各种生物传感器中，包括葡萄糖监测设备[21]、[24]、[25]。当应用于ELISA时，将GOD和葡萄糖加入到底物溶液中可以实现过氧化氢的连续原位生成。这种方法可以在不需要处理液态过氧化氢的情况下进行可靠的HRP反应。
本研究的目的是开发和评估GOD介导的过氧化氢生成方法作为ELISA系统中过氧化氢的来源。优化了关键反应参数（包括酶和底物浓度、反应时间以及温度），以确定是否能够生成足够的过氧化氢以实现高效的HRP催化反应。此外，将GOD介导的过氧化氢生成方法应用于四种不同的商业ELISA试剂盒，测量了改进后ELISA的灵敏度和重现性，从而评估其在实验室条件下的可行性。
部分摘录
材料
葡萄糖（G7520）、葡萄糖氧化酶（GOD；49180）、过氧化氢（30%重量；349887）、辣根过氧化物酶（P8125）和磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（P4809）均购自Sigma-Aldrich（韩国首尔）。Pierce TMB底物试剂盒（34021）和SuperSignal ELISA Femto底物（37074）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。用于检测甲胎蛋白（AFP）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、人类免疫缺陷病毒1和2抗体（HIV-1/2 Ab）的ELISA试剂盒
结果与讨论
已开发出多种类型的ELISA用于分析不同类型的分析物，并使用HRP和AP的酶促反应报告了测定结果。特别是，HRP最常用于ELISA，例如（1）与TMB和OPD作为产色底物的发色反应[6]、[7]，以及（2）以鲁米诺为底物的发光反应[10]、[11]。HRP反应需要过氧化氢作为其反应的必需催化剂。在本研究中
结论
本研究建立了利用GOD/葡萄糖的酶介导的过氧化氢供应方法，作为化学发光ELISA的替代过氧化氢来源，并将其与传统过氧化氢进行了性能比较。确定了GOD介导的过氧化氢生成的最佳条件，适用于发色和化学发光HRP反应。对于发色反应，10 μg/mL的GOD浓度和10 mg/mL的葡萄糖能够生成足够的过氧化氢
CRediT作者贡献声明
田哲哲（Jae-Chul Pyun）：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、资金获取。李多英（Do Young Lee）：监督。姜民正（Min-Jung Kang）：监督。林泰洙（Taek Su Lim）：研究。郑相珍（Sang Jin Jung）：研究。尹泰敬（Tae Gyeong Yun）：研究。宋贤宇（Hyun-Woo Song）：初稿撰写、研究。
