《Enzyme and Microbial Technology》：Enhanced activity and operational stability of recombinant acetylxylan esterase from Aspergillus nidulans immobilized on amino-functionalized magnetic nanoparticles
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Gabriela Souza Alves Picciarelli | Diandra de Andrades | Douglas Poleto de Oliveira | Valdemiro Pereira Carvalho Júnior | Marita Gimenez Per
Gabriela Souza Alves Picciarelli | Diandra de Andrades | Douglas Poleto de Oliveira | Valdemiro Pereira Carvalho Júnior | Marita Gimenez Pereira | Robson Carlos Alnoch | Maria de Lourdes Teixeira Moraes Polizeli
巴西圣保罗大学里贝朗普雷图医学院生物化学与免疫学系，Bandeirantes，Av. 3900，Monte Alegre，14040-900，里贝朗普雷图，SP
摘要
乙酰木聚糖酯酶是一种辅助酶，能够水解乙酰化木聚糖中乙酰基的酯键，属于碳水化合物酯酶家族。本研究旨在评估将来自Aspergillus nidulans的重组乙酰木聚糖酯酶（AxeAN）固定在不同载体上，以改善其催化性能和操作稳定性。制备并表征了三种基于琼脂糖的聚合物载体、一种合成的磁性纳米颗粒以及两种商业基质。傅里叶变换红外光谱证实了通过化学修饰引入的功能基团，而X射线衍射验证了纳米颗粒中的结晶磁铁矿（Fe?O?）结构。透射电子显微镜显示出粒径不均匀的平均直径为166纳米，并确认了其磁响应性。AxeAN成功固定在功能化载体上。对于氨基功能化载体，固定效率超过95%，其中Glyoxyl-agarose-(3-aminopropyl)triethoxysilane（GA-APTES-Nano）和GA-APTES-Nano?载体的活性恢复率超过200%。相比之下，Iminodiacetic acid agarose和glyoxyl-agarose的固定效率较低且保留性能较差。热稳定性实验表明，APTES-Nano和APTES-Nano?在60°C长时间孵育后仍保持高达90%的残留活性，而戊二醛活化的衍生物则稳定性较低。这些结果证明，氨基功能化的磁性纳米颗粒，尤其是GA-APTES-Nano，作为酶固定的坚固、可重复使用的平台具有优越的性能，具有广泛的应用潜力。
引言
乙酰木聚糖酯酶（AXE；EC 3.1.1.72）是一种辅助酶，能够催化木聚糖链中乙酰基的水解，从而促进木质纤维素生物质的降解。通过去除这些乙酰基，AXE增强了半纤维素酶（如木聚糖酶）的活性，促进了可发酵糖的释放，这对于第二代生物燃料的生产至关重要。在综合生物炼制厂的背景下，AXE不仅因提高糖化效率而受到关注，还因有助于半纤维素成分的增值而符合循环经济原则。除了在生物质脱乙酰化中的作用外，AXE在食品、纸浆和造纸工业中也具有重要意义，因为它们可以改植物多糖。此外，AXE在功能性寡糖和定制生物材料的制备中也有潜在应用，进一步拓展了它们的工业价值[1]，[2]。
酶被广泛认为是高效的生物催化剂，在温和且环境友好的条件下具有高区域选择性和对映选择性[3]。然而，自由酶的大规模应用常常受到操作不稳定性、易变性及有限重复使用性的限制，这增加了工艺成本[4]。为了克服这些挑战，酶的固定已成为一种有效的策略，以提高催化稳定性、促进酶的回收并实现生物催化剂的回收利用，从而扩大AXE的应用范围。共固定策略的潜力在于将AXE与其他半纤维素酶结合，以实现协同效应、提高催化效率和过程强化。
酶的固定涉及通过物理或化学相互作用将酶限制或附着在不可溶性材料上，从而产生可从反应介质中轻松分离的异质性生物催化剂[5]，[6]。载体的选择至关重要，取决于酶的物理化学性质和预期应用。理想的载体应具有高表面积、化学和机械稳定性、低毒性以及促进有效酶-载体相互作用的功能基团[4]，[5]，[7]。
在最通用的基质中，琼脂糖衍生物支持多种耦合方式，包括共价、离子或可逆相互作用，通过选择性表面功能化实现[8]，[9]。近年来，磁性纳米颗粒（MNPs）由于其高比表面积、易于磁回收以及大规模操作的潜力而受到越来越多的关注[10]，[11]，[12]，[13]。这种方法属于纳米生物催化学的更广泛领域，该领域探索纳米级载体以改善酶的性能、稳定性和过程整合。用硅烷（如(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）对MNPs进行功能化，然后进行戊二醛（GA）活化，可获得结合离子和共价相互作用的多功能表面，通常可以提高酶的稳定性[14]。
关于载体性质和表面化学如何影响AXE性能的比较研究仍较少，尽管已有大量关于AXE生物化学及其与木聚糖酶协同作用的研究[15]，但尚未有研究专门针对Aspergillus nidulans。先前的研究报告了将来自Bacillus subtilis [16]和Aspergillus ficcum [17]的重组AXE固定在壳聚糖涂层磁性纳米颗粒和改性氧化石墨烯上的研究。B. subtilis AXE在固定后保留了约80%的催化活性，在60°C下保持70%的活性3小时，并在10次重复使用后仍保留75%的活性[16]。同样，A. ficcum AXE衍生物在10次循环后仍保留了约50%的初始活性[17]。目前尚未有系统比较天然、合成和纳米结构载体用于固定Aspergillus nidulans重组AXE的研究。
因此，本研究调查了不同载体（天然、合成和纳米结构）的合成、功能化、表征和评估，以用于固定来自Aspergillus nidulans的重组乙酰木聚糖酯酶（AxeAN）。对这些固定衍生物的催化效率、热稳定性和操作稳定性以及重复使用性进行了评估，以确定适用于生物质转化和生物燃料生产的坚固、可回收的生物催化剂。
章节节选
试剂和材料
环氧氯丙烷、亚氨基二乙酸（IDA）、乙二胺和三氧化二铁（II, III）（~97%）、ρ-硝基苯乙酸（ρ-NPA）、桦木木聚糖（~90%）、山毛榉木木聚糖（~90%）、燕麦芯木聚糖（~75%）、5-(羟甲基)呋喃（99%）和呋喃（99%）均从Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）购买。Precision Plus Protein?标准品和Bradford蛋白测定试剂来自Bio-Rad Laboratories（美国赫拉克勒斯）。Superdex 75 10/300 GL和Q FF-Hiprep柱来自GE
红外光谱 – FTIR
FTIR光谱证实了所有载体的成功功能化（图1）。对于基于琼脂糖的载体（图1A和B），在1641 cm?1处观察到特征吸收带，对应于羟基的ν(O–H)伸缩；在1370 cm?1处观察到甲基的ν(C–H)伸缩；在1059 cm?1处观察到与琼脂糖结构中的醚键的ν(C-O-C)伸缩相关。另外，在1252、930和890 cm?1处观察到环氧环的吸收带
讨论
琼脂糖最初在碱性条件下用环氧氯丙烷活化以引入环氧基团。这些基团的部分水解导致二醇的形成，随后引入了额外的功能基团，如氨基和羧基。FTIR光谱证实了这些基团的存在，与先前的研究结果一致[42]，[43]。
基于MNP的载体的振动光谱（图1，图2）进一步确认了这一点
结论
本研究表明，来自A. nidulans的重组乙酰木聚糖酯酶（AxeAN）成功固定在各种天然、合成和纳米结构载体上。在所有测试的基质中，氨基功能化的磁性纳米颗粒——特别是GA-APTES-Nano——表现出最佳性能，具有高固定效率（>95%）、增强的催化活性（活性恢复率高达285%）、出色的热稳定性（在60°C下的半衰期为180分钟）以及优秀的
CRediT作者贡献声明
Polizeli Maria de Lourdes Teixeira de Moraes：写作 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、项目管理、研究、资金获取、数据分析、概念化。Robson Carlos Alnoch：写作 – 初稿编写、可视化、验证、软件应用、方法学、研究、资金获取、数据分析、概念化。Marita Gimenez Pereira：写作 – 初稿编写、可视化、验证、软件应用
致谢
本工作得到了圣保罗州研究基金会（FAPESP，项目编号2013/50892-3和2023/01547-5）和科学技术发展委员会（CNPq，项目编号406838/2013-5）的资助。CNPq还提供了Ciência sem Fronteiras para MGP计划（项目编号242775/2012-8）的支持。MLTMP是CNPq的研究员（项目编号310340/2021-7）。RCA获得了CNPq（项目编号：151187/2023-1）和FAPESP（项目编号：2023/09627-8）的研究奖学金；DA也获得了FAPESP的奖学金（项目编号：
