可视化的甘油三酯模拟前药：制备、效应评估及淋巴运输机制研究

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Visualized triglyceride mimetic prodrugs: Preparation, effect evaluation and mechanistic investigation of lymphatic transport

　　**摘要**
通过将甘油三酯结构域与母药结合，制备了具有甘油三酯模拟特性的前药。这种前药能够促进淋巴转运，减少肝脏的首过代谢，并提高母药的口服生物利用度。为了验证其淋巴转运能力，本研究以20-羟基孕酮作为模型母药。通过分子对接技术筛选了合适的荧光染料，并通过化学合成将这些染料稳定地连接到甘油三酯模拟前药的连接臂上。制备出的荧光标记前药能够在体内被可视化追踪，其体内命运通过荧光成像以及细胞和蛋白质水平的检测得到分析。该前药特异性地被十二指肠吸收，并优先积累在肠系膜淋巴结中，从而减少了肝脏的首过代谢。利用Caco-2细胞单层模型进一步证实，前药通过巨噬胞饮作用被肠上皮细胞摄取，在内质网和高尔基体的协同作用下参与乳糜微粒（CM）的组装，随后通过乳糜微粒排出细胞外。本研究的方法无需将药物或荧光探针封装在颗粒递送系统中，即可实现生物转化过程的可视化，为甘油三酯模拟前药的荧光标记提供了实用示例，并为研究具有强首过效应类似药物的体内命运提供了可复制的方法学参考。

**1. 引言**
口服给药是临床治疗中的首选途径，因为患者依从性好且使用方便（Abbas等人，2025年）。然而，低口服生物利用度严重限制了许多药物的临床应用。这一问题在高度亲脂性的药物中尤为明显，这些药物在肠道黏膜的通透性较差（J. Zhao等人，2019年），并且在肝脏首过代谢过程中会有大量药物损失（Lai，2025年）。这些因素已成为限制其口服给药的关键瓶颈。脂质前药策略通过改善母药的吸收特性提供了一种有效的解决方案（Brown和Park，2025年）。在各种脂质前药中，甘油三酯模拟前药因其独特的肠道转运机制而受到广泛关注（Simpson等人，2026年）。其基本设计原理是将甘油三酯的sn-2位置的脂肪酸链替换为目标药物分子，从而形成保留了甘油三酯骨架特征的前药（Yan等人，2023年）。这种结构赋予前药独特的肠道转运能力，使其能够模仿内源性甘油三酯的“水解-再酯化”循环（Tso等人，2025年）。口服后，前药被肠道酶水解为2-单甘油酯中间体，这些中间体随后被肠上皮细胞摄取。在细胞内，前药中间体在脂质合酶的催化下重新酯化，重新形成甘油三酯结构并整合到乳糜微粒中（Gold等人，2025年）。乳糜微粒通过淋巴转运进入全身循环，有效绕过了肝脏的首过代谢，从而提高了母药的口服生物利用度（Xiao等人，2026年）。阐明甘油三酯模拟前药的体内生物转化和淋巴转运过程需要可靠的可视化工具（Wang等人，2025年）。荧光标记是一种成熟的分子追踪技术，非常适合这一目的。其核心原理是通过共价键合或物理吸附将目标分子与含有荧光基团的化合物结合。在特定波长下激发时，这些化合物吸收能量，转变为激发态，并在返回基态时发出特征性的荧光。通过检测荧光分布和强度，可以实时追踪体内的分子动态（Dunst和Tomancak，2019年）。在各种荧光标记材料中，小分子有机染料（Guo等人，2025年），如罗丹明和硼二吡咯甲烯（BODIPYs），在追踪药物的吸收、分布、代谢和排泄过程中表现出良好的潜力。它们的优点包括结构明确、分子量低、合成和修饰简便、批次间一致性高以及优异的生物相容性（Xu等人，2023年）。然而，关于甘油三酯模拟前药研究中荧光标记的报道仍然有限。传统方法是将荧光探针和药物共同封装在颗粒载体中，以实现靶向给药和体内实时追踪。这种方法存在显著缺点：首先，探针和药物之间的理化性质差异可能导致释放不同步，使得荧光信号无法准确反映体内的药物分布；其次，颗粒载体可能改变药物的药代动力学（循环时间、清除率和组织穿透性），导致追踪结果失真。在没有特定载体配方的情况下，大多数研究采用“染料替代”策略，即直接用荧光染料替换活性药物部分来进行前药追踪。例如，有研究将光敏剂辣椒红-α（pyrophorbide-a）连接到多西他赛甘油三酯模拟前药的甘油三酯骨架上进行追踪（Tian等人，2019年）；在霉酚酸甘油三酯模拟前药中，用BDP 558羧酸作为荧光标记（Kochappan等人，2021年）。尽管这种方法可以实现体内前药追踪，但它存在明显局限性：首先，完全替换活性药物部分会破坏前药的原始分子结构，失去母药的结构特征，无法准确反映其真正的理化性质；其次，活性药物的化学结构对肠道水解效率、细胞摄取和淋巴转运特异性有重要影响，因此染料替代可能影响标记的特异性，导致追踪结果无法真实反映药物的体内行为，从而限制了这类研究的转化价值。

孕酮是一种广泛使用的临床孕激素药物。口服后，它通过细胞色素P450系统在肝脏中快速代谢，导致其口服生物利用度低于10%（Simon等人，1993年），严重限制了其口服制剂的临床应用。作为孕酮在体内的主要活性代谢物，20-羟基孕酮（20-DHP）仍具有孕激素活性（Kuhl，2005年；Niepoth等人，2024年）。此外，20-DHP还具有抗芳香化作用，并调节脂质代谢及其他多种生物活性（Nowak，2002年；Pasqualini和Chetrite，2008年；Li等人，2025年；Hinchliffe和Heazell，2026年；Sanhueza等人，2026年）。我们的先前动物和细胞研究表明，20-DHP对子宫内膜增殖具有与孕酮相似的作用（Yan等人，2022年；Cheng等人，2024年），表明其作为新型孕激素的潜力。然而，20-DHP同样在体内经历肝脏首过代谢。幸运的是，与孕酮相比，20-DHP在C-20位置具有羟基，这为其脂质修饰提供了结构优势。因此，我们设计并合成了20-DHP甘油三酯模拟前药。具体来说，我们将20-DHP引入甘油三酯分子的sn-2位置，制备出具有淋巴转运潜力的前药，以提高孕激素的口服生物利用度。值得注意的是，该前药本身没有直接的药理活性，必须通过酶促或化学过程释放才能发挥药理作用。口服后，前药的生物转化包括多个步骤：肠道水解、细胞摄取、乳糜微粒组装和淋巴转运。这一复杂动态过程难以通过高效液相色谱和质谱等传统分析方法进行时空表征。为了解决这一技术挑战，我们创新性地采用了“直接染料结合”荧光标记策略：通过化学合成，将高亲和力的荧光染料（BODIPY FL羧酸）连接到前药的连接臂上，而不对活性药物部分进行替换。这种设计保留了前药的原始分子结构和活性药物的结构特征，同时实现了20-DHP甘油三酯模拟前药的精确荧光标记，从而可以实时追踪其细胞内转运和组织分布。该方法为阐明淋巴转运机制提供了可视化工具，深入探讨了肠道吸收、细胞内处理、乳糜微粒组装和淋巴转运的过程，也为甘油三酯模拟前药的荧光标记技术发展提供了宝贵的实践案例，并为研究其他高度亲脂性药物的体内过程提供了方法学参考。

**2. 材料**
- 3-肾上腺素丙酸购自上海凌福药用研究所有限公司
- 大豆油购自浙江天宇药用油有限公司
- 胎牛血清购自Gibico
- MEM培养基（添加了非必需氨基酸）购自武汉普瑞赛尔生命科技有限公司
- 用于内质网（ER）和高尔基体的红色荧光探针购自上海贝泰美生物技术有限公司
- 溶酶体红色荧光探针购自叶森生物科技有限公司（上海）
- Hoechst 33342荧光探针购自北京索拉博生物科技有限公司
- 甲基-β-环糊精（MβCD）、氯丙嗪（CPZ）、5-(N-乙基-N-异丙基) 阿米洛利（EIPA）、布雷菲丁A（BFA）和巴菲霉素A1（BafA1）购自上海昊源生物医学科技有限公司
- 微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）、载脂蛋白B（ApoB）、囊泡相关膜蛋白（VAMP7）和分化簇36（CD36）、脂肪酸结合蛋白1（FABP1）购自Abcam（上海）贸易有限公司
- 12孔聚碳酸酯膜Transwell板购自康宁公司（美国）
- 苛性磷酸酶（ALP）检测试剂盒购自上海贝泰美生物技术有限公司
- 人异质性上皮结直肠腺癌细胞（Caco-2）购自中国科学院细胞库/干细胞库，使用第45-55代细胞
- 成年雌性昆明小鼠购自新疆医科大学动物实验中心（许可证编号：SCXK (Xin) 2018-0002）
本研究严格遵循“实验室动物护理原则”，所有实验程序和方案均获得了新疆医科大学动物伦理委员会的批准（批准编号：IACUC-JT-20250311-57；项目编号：ZYYD2025ZY18）

**3. 方法**
**3.1. 可可视前药的制备与表征**
**3.1.1. 虚拟筛选**
前药的结合位点是羟基。根据合成路线设计，荧光染料需要具有羧基或卤素基团以实现酯化反应。将配体和水受体的结构绘制并保存为SDF格式，然后使用OpenBabel 3.1.1.1将SDF文件转换为PDB格式。使用AutoDockTools 1.5.7验证配体和水受体的电荷和质子化状态，并导出为PDBQT文件。配体处理包括根原子检测和扭转键分配，随后进行配体-受体对接。使用PyMOL 1.7进行三维结构可视化及结合位点分析，Discovery Studio 2019用于分析受体-配体复合物中的非键合相互作用。常用的荧光染料包括罗丹明、萘酰亚胺、香豆素、BODIPY等，共选择了19种含有羧基或卤素基团的染料（图1），具体包括BODIPY 493/503羧酸、BODIPY R6G羧酸、BODIPY 558/568羧酸、BODIPY FL羧酸、ICG羧酸、Cyanine3羧酸、Cy7羧酸、Cy5羧酸、6-羧基香豆素（CA）、4-(N-(1,8-萘酰亚胺))-N-丁酸（N-BA）、荧光素、罗丹明B、N-丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺（BBN）、N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺（BMB）、罗丹明110、6-罗丹明6G羧酸、6-四甲基罗丹明羧酸和BODIPY TMR羧酸。通过分子对接筛选出高亲和力的荧光染料。

**3.1.2. 化学合成与表征**
1,3-二棕榈酰甘油（1,3-DG）、3-(叔丁基二甲基硅氧基) 戊二酸酐（3-OTBS-GTA）和20-DHP作为起始原料，通过系列化学反应将筛选出的荧光染料连接到20-DHP甘油三酯模拟前药的连接臂上，得到可可视的20-DHP甘油三酯模拟前药。详细合成步骤见补充材料的第1.2节。可可视前药的结构通过红外光谱（IR）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、质子核磁共振光谱（1H-NMR）、碳-13核磁共振光谱（13C-NMR）和高分辨率质谱（HRMS）进行表征。荧光参数（最大激发波长和最大发射波长）通过荧光光谱确定。

**3.1.3. 可可视前药的淋巴转运效应评估**
小鼠随机分为三组：对照组（注射0.2 mL大豆油）、荧光标记前药组（注射20-DHP-C5(-FL)-TG，65 mg/kg）和染料组（注射BODIPY FL羧酸，15 mg/kg，与前药组等摩尔量）。小鼠用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉并去除腹部毛发，然后仰卧在黑色纸板上，使腹部位于相机视野中心。在Ex = 465 nm和Em = 540 nm的条件下进行荧光成像。给药前（0 h）获取空白图像。小鼠清醒后进行胃内给药（0.2 mL），并在给药后2、4和6小时进行成像。成像结束后，处死小鼠并收集包括肠道、肠系膜淋巴结（MLN）、肝脏和肾脏在内的器官。器官用生理盐水冲洗以去除表面血液，然后放置在黑色纸板上进行荧光成像。在取样过程中，分离出肠道各段（十二指肠、空肠、回肠和结肠）。每个肠道段先用4%的甲醛固定，随后进行脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片装裱、DAPI染色并覆盖盖玻片。观察使用激光扫描共聚焦显微镜进行。相关伦理声明见1材料3.2部分。3.2部分关于可视化前药的淋巴运输机制的研究。3.2.1细胞培养Caco-2细胞在添加了20%胎牛血清的完全MEM培养基中培养。当细胞融合度超过80%时进行传代培养。实验使用的是第45-55代细胞。3.2.2细胞摄取和运输过程研究MβCD、CPZ和EIPA分别作为caveolin介导的内吞作用（Barman和Drolia 2024）、clathrin介导的内吞作用（Xian等人2023）和巨噬胞饮作用（Liang等人2025）的特异性抑制剂。Caco-2细胞以2×10^5个细胞/毫升的密度接种在12孔板中，并培养72小时。在37°C下用各抑制剂预处理1小时后（浓度见补充材料第2部分的表S1），再将细胞与64微摩尔的可视化前药共同孵育3小时（具体优化方法见CCK-8检测，详见补充材料）。洗涤后，通过流式细胞术（FCM）分析细胞内荧光强度。BFA、monensin和BafA1分别用于抑制内质网到高尔基体的运输（Zhang等人2024）、高尔基体到细胞外空间的分泌（Talamás-Lara等人2021）和溶酶体酸化（Song和Korolkova 2024）。培养72小时后，将细胞与64微摩尔的荧光前药共同孵育1小时。洗涤后，再加入各抑制剂继续孵育3小时（浓度同上）。最后，洗涤细胞并收集数据进行FCM分析。3.2.3细胞器共定位测定Caco-2细胞以5×10^4个细胞/毫升的密度接种在共聚焦微孔板中，分为三组：空白对照组（培养基）、游离荧光染料组（BODIPY FL COOH (FL)，以及可视化前药组（20-DHP-C5(-FL)-TG，64微摩尔）。孵育3小时后，用细胞器追踪剂（ER-Tracker Red、Golgi-Tracker Red或Lyso-Tracker Red）和Hoechst 33342进行染色（详见补充材料）。洗涤后，立即用LSCM观察细胞。3.2.4 Caco-2细胞单层模型的建立Caco-2细胞用胰蛋白酶处理后重新悬浮至1×10^5个细胞/毫升的浓度。在顶端（AP）加入0.5毫升细胞悬液，在基底侧（BL）加入1.5毫升完全培养基。每2天更新培养基。从第6天开始每2天测量跨上皮电阻（TEER），在第21天获得融合的单层细胞。通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测（AP和BL侧）、Lucifer黄渗透性检测、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）验证该模型（详见补充材料）。3.2.5 可视化前药的细胞内运输机制研究建立的Caco-2细胞单层分为四组：空白对照组（培养基）、游离荧光染料组（BODIPY FL COOH (FL)，64微摩尔），可视化前药组（20-DHP-C5(-FL)-TG，64微摩尔）和阳性对照组（Tripalmitin (TP)，43微摩尔）。孵育12小时后，将细胞在冰上裂解30分钟并间歇性吸取。离心（14,000 rpm，4°C，10分钟）后，收集上清液用BCA法测定蛋白质含量并标准化。蛋白质样品在99°C下用SDS-PAGE加载缓冲液变性10分钟，然后用5%堆积胶和8-12%分离胶进行分离。随后，将蛋白质湿转印到聚 Vancevylideene fluoride (PVDF)膜上，用5%非脂肪牛奶封闭2小时，并在4°C下过夜与一抗孵育（详见补充材料）。室温下与二抗孵育2小时后，使用增强化学发光（ECL）试剂进行荧光检测，并用ImageJ软件定量。3.3 统计分析本研究的所有实验数据均使用IBM SPSS 26.0进行统计分析，实验图表用GraphPad Prism 8.0软件生成。定量数据以平均值±标准差（?x±s）表示，图中的误差条统一表示为标准差（SD）。对于正态分布的定量数据，采用独立双尾t检验进行两组间的比较。对于多组间的比较，首先用Levene检验评估方差齐性：方差齐性的数据采用单因素方差分析（ANOVA），然后进行LSD-t检验进行成对比较；对于方差不齐的数据，采用Brown-Forsythe稳健ANOVA，并进行Games-Howell检验进行事后成对比较。统计显著性标准设定为：p < 0.05表示有统计学差异，p < 0.01表示高度统计学差异，p > 0.05表示无统计学差异。图中的标记 convention 标准化为：p < 0.05，*p < 0.01，**p < 0.001；"ns"表示无显著差异（p > 0.05）。4. 结果4.1 可视化前药的制备和表征基于虚拟筛选，通过分子对接技术表征荧光团与前药结合口袋之间的结合亲和力（图2b）（结合能越低表示结合越强），筛选出了五种对前药连接基团的羟基具有高结合能力的荧光染料（图2a）。按结合能升序排列，分别为：BMB、CA、BODIPY FL羧酸、罗丹明B、BBN、N-BA。据此设计并制备了五种荧光染料标记的20-DHP模拟甘油三酯前药。下载：下载高分辨率图像（368KB）下载：下载全尺寸图像图2. 可视化前药的合成。(a) 虚拟筛选结果。(b) 荧光染料与前药分子共价结合的示意图。合成验证结果显示，BMB和BBN标记的前药未能成功合成，而CA、N-BA和BODIPY FL羧酸标记的目标前药则能顺利获得。体外荧光成像应用发现，CA和N-BA标记的模拟甘油三酯前药由于最大激发和发射波长较短，容易受到生物样本中内源性自荧光的干扰，导致信噪比低，追踪性能不佳。相比之下，BODIPY FL羧酸标记的模拟甘油三酯前药表现出优异的荧光成像兼容性，符合后续生物成像研究的要求。因此，在本工作的机制研究中选择了BODIPY FL羧酸标记的模拟甘油三酯前药作为荧光示踪剂。目标产品的合成路线如图3所示。产物为红棕色油状物质，产率为18%，结构表征数据见补充材料第1.3部分。下载：下载高分辨率图像（475KB）下载：下载全尺寸图像图3. 用CA、N-BA和BDP FL羧酸标记的20-DHP模拟甘油三酯前药的合成路线。4.2 可视化前药的淋巴运输效果评估4.2.1 体内成像体内成像显示，前药组（TG）和游离染料组（FL）的荧光信号模式相似，信号局限于肠道和膀胱（图4）。其他主要器官（如心脏、脾脏、肺）未检测到显著荧光，这可能是由于荧光团的波长不在近红外范围内，限制了其对深层组织的穿透。为了克服这一限制，进行了体外组织成像，以获得更高的分辨率数据，不受体内组织穿透限制。4.2.2 体外组织成像在包括肠道、淋巴结（MLN）、肝脏和肾脏在内的四种组织中，可视化前药组（TG）和游离染料组（FL）的荧光强度存在显著差异，TG组的强度明显高于FL组（图5a）。这表明口服给药的TG在代谢器官中积累更多，具有比FL更强的组织积累能力，证实了其模拟甘油三酯结构对组织分布的优化作用。在肠道吸收后，TG可通过淋巴循环快速运输到MLN，其运输过程与甘油三酯物质的内源性淋巴运输途径高度一致，显示出高效的淋巴趋向性。FL组在MLN中也检测到荧光信号，这可能与大豆油载体有关。作为亲脂性赋形剂，大豆油可以在一定程度上促进脂溶性物质的肠道吸收和淋巴运输，从而使少量FL进入MLN。此外，FL在大豆油中的溶解度较低，在给药时呈悬浮状态，而前药可以在大豆油中形成均匀溶液。这种溶解状态的差异导致FL在肠道的吸收速率明显慢于前药。因此，FL组在MLN的荧光峰值出现在给药后4小时，远低于TG组。在肝脏和肾脏中，TG组在给药后6小时显示出荧光信号的二次增强，可能与前药的代谢过程有关。通过肠道淋巴运输进入系统循环的前药随后会在肝脏进一步代谢。相比之下，FL组总体上没有明显变化，这可能是由于FL被MLN吸收的量极少，直接进入系统循环，导致FL到达肝脏和肾脏的量可以忽略不计。我们关注了胃肠道吸收后前药在MLN和肝脏中的分布。累积荧光分析（图5b）显示，肠道淋巴运输和肝脏代谢同时发生。前药在MLN的积累显著超过肝脏，表明前药主要通过淋巴运输而非直接肝脏摄取。4.2.3 肠道切片结果在四个肠道段（十二指肠、空肠、回肠和结肠）中，TG组的平均荧光强度在三个时间点都显著高于FL组（p < 0.05；图6a），表明前药的吸收效率优于游离染料。在这些段中，TG组在十二指肠和空肠的荧光强度随时间持续下降，而在回肠和结肠则先增加后下降，这与口服药物在肠道中的生理分布过程高度一致。进一步比较不同肠道段（图6b）发现，十二指肠的荧光强度在给药后2小时最高，表明前药在十二指肠中的吸收优先。随后，随着药物的运输和代谢，荧光强度逐渐下降，而在空肠、回肠和结肠中的荧光强度相对稳定或略有波动。4.3 可视化前药的淋巴运输机制研究4.3.1 摄取机制研究EIPA处理使细胞内荧光强度降低了58.1%，与对照组相比（图7a），摄取量显著减少（p < 0.001；图7b）。这些结果表明，巨噬胞饮作用是主要的摄取途径，阻断巨噬胞饮作用会显著减少细胞内前药的积累。MβCD处理仅使荧光强度降低了8.1%（p > 0.05），而CPZ处理则使摄取减少了13.6%（p > 0.05）；这两种差异均不具有统计学意义。这表明，胆固醇依赖性和网格蛋白介导的内吞作用对前药的摄取贡献不大，并且对该过程的影响可以忽略不计。下载：下载高分辨率图像（377KB）下载：下载全尺寸图像。图7. 荧光前药的摄取（a-b）和细胞内运输（c-d）机制。Caco-2细胞在抑制剂处理后的FCM直方图和MFI量化。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

4.3.2 运输过程的研究
为了系统地阐明这种可可视化前药的细胞内运输和胞吐途径，进行了针对关键运输节点的抑制剂实验。与对照组相比，BFA处理（89.7%，p < 0.01）和monensin处理（432.8%，p < 0.001）显著增加了细胞内的荧光强度（图7c-d）。BFA和monensin都阻止了前药向质膜的运输及其随后的分泌，导致细胞内前药的积累。这证实了内质网和高尔基体在前药运输和分泌中的关键作用。

4.3.3 细胞器共定位分析
前药（绿色）和ER-Tracker Red在细胞核周围及整个细胞质中显示出网状共定位，相关性很高（皮尔逊相关系数（PCC）> 0.68（图8a）。相比之下，FL（绿色）则显示出无ER共定位的弥漫分布。前药和Golgi-Tracker Red显示出与高尔基体形态一致的核周共定位（图8b）。FL信号在细胞质中分散，无高尔基体共定位。这一结果证实了前药对内质网和高尔基体的特异性靶向，这与它们在脂质处理和乳糜微粒组装中的关键作用一致。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像。

4.3.4 Caco-2单层模型的建立及其运输机制的研究
4.3.4.1 Caco-2单层模型的建立
Caco-2单层模型高度类似于分化的肠上皮细胞，是体外评估肠道药物吸收的标准工具。该模型具有特征性的微绒毛、刷状缘酶、自发分化和功能性紧密连接。其形态和功能特性与体内肠上皮细胞非常接近（Fogh等人，1977年），因此被广泛用于吸收研究。模型的有效性需要验证其通透性、完整性和极化性。我们采用了多种评估方法。
TEER用于评估单层细胞的完整性。较高的TEER值表示细胞连接更为紧密。TEER值在第二周迅速上升，在第16天后趋于稳定，并在第21天达到835 Ω·cm2（图9a），表明在分化过程中连接逐渐形成。完整的肠上皮细胞限制了大分子的旁细胞运输。

4.3.4.2 可可视化前药的细胞内运输机制研究
相对于对照组，TG组和TP组中MTP、CD36、VAMP7、L-FABP和ApoB48的表达显著上调（p < 0.05；图10），且上调程度相当。这表明前药能够像 Tripalmitin 一样促进与CM相关的蛋白质表达，从而证实了其模拟天然甘油三酯的能力。

5. 讨论
本研究旨在解决无需额外配方即可实现甘油三酯模拟前药可视化的关键问题，从而为研究甘油三酯模拟前药的淋巴运输提供一个可视化工具。本研究采用的方法是通过化学合成将荧光染料稳定地结合到甘油三酯模拟前药的连接结构上，制备出一种可荧光标记且可追溯的甘油三酯模拟前药。随后，以游离染料作为对照，我们评估了该前药的淋巴运输效率并探讨了其可视化机制的原理。
甘油三酯模拟前药能够增强口服吸收的主要原因是它们在胃肠道吸收后优先通过淋巴系统运输，这减少了肝脏的首过代谢，从而提高了全身暴露量和生物利用度（正如我们之前的工作所示（Cheng等人，2024年）。因此，肠系膜淋巴结和肝脏是本研究的主要研究对象。荧光成像显示，与肝脏相比，该前药在肠系膜淋巴结中的分布比例显著更高，这与FL组观察到的主要在肝脏中的积累形成鲜明对比。这些发现不仅验证了甘油三酯模拟前药能够减少肝脏首过效应的假设，还与我们之前的结果高度一致。此外，该前药在肝脏和肾脏等代谢器官中的分布呈现出独特的二次增加，间接证实了其通过淋巴运输的延迟吸收行为。
为了系统地探讨这种可可视化前药的运输机制，我们建立了Caco-2细胞单层模型来模拟肠道上皮屏障，并进行了全面的形态学、生理学和功能评估。结果表明，培养21天的Caco-2单层细胞具有完整的紧密连接、适当的细胞极化性和良好的通透性，因此可以作为研究该前药肠道吸收机制的可靠体外模型。同时，使用天然棕榈酸甘油三酯作为阳性对照，进一步探讨了该前药在肠上皮细胞中介导CM形成的分子机制。
内质网和高尔基体是参与前药细胞内运输的关键细胞器，它们的协同作用构成了定向细胞内运输的核心机制。内质网是前体乳糜微粒（pre-CM）组装的初始场所。ApoB48是一种肠道特异性的载脂蛋白（每个CM含一个），是关键的结构蛋白，而MTP作为其伴侣蛋白以防止其降解（Hooper等人，2025年）。ApoB48随后与富含甘油三酯的颗粒和胆固醇酯结合形成pre-CM。pre-CM的运输依赖于前体乳糜微粒运输囊泡（PCTV），这些囊泡将膳食脂肪输送到周围组织（肌肉、心脏和脂肪组织）（Wong等人，2010年）。PCTV的形成和运输需要VAMP7、CD36、ApoB48和FABP1（图10）。CD36促进CM的形成（Garcia等人，2026年），并调节ApoB48和MTP的表达，同时促进PCTV从内质网出芽。FABP1将脂肪酸和2-单甘油酯运输到内质网进行再酯化，并参与囊泡的组装（Rodriguez Sawicki等人，2017年）。这些蛋白质共同驱动PCTV从内质网出芽。随后，PCTV通过含有VAMP7的SNARE复合体与高尔基体对接和融合（Visser等人，2025年；Vats等人，2026年）。高尔基体作为处理中心，通过糖基化和其他修饰促进CM的成熟（Sesorova等人，2021年）。这种内质网-高尔基体运输-处理轴确保了前药的有序代谢，符合已建立的脂质代谢途径。

6. 结论
本研究成功开发了一种荧光标记的甘油三酯模拟前药，为研究基于甘油三酯的前药的体内运输过程和分子机制提供了一种独特的可视化工具。通过分子对接技术进行虚拟筛选，确定了BDP FL羧酸是最优的荧光染料；随后，通过化学合成将其直接结合到甘油三酯前药的连接结构上。构建的这种可视化前药能够实时动态追踪20-DHP甘油三酯模拟前药的体内生物转化过程，而无需依赖纳米载体的包封。这种可视化前药在小鼠的肠系膜淋巴结中显示出显著的积累，主要通过肠道淋巴途径传输。它有效地减少了肝脏的首过代谢效应，从而显著提高了药物的生物利用度，这完全符合基于甘油三酯的前药的设计理念。进一步使用Caco-2细胞单层模型进行的机制研究表明，该前药通过巨噬胞饮作用被肠上皮细胞内化。在内质网和高尔基体的协同调节下，它参与乳糜微粒的组装和胞吐过程，从而阐明了其通过乳糜微粒途径进行的淋巴运输的核心分子机制。
总之，本研究建立了一种针对甘油三酯模拟前药的可视化标记技术，消除了染料替换或载体包封的需求。它为这类前药的体内动态追踪提供了一种可行且高效的技术解决方案，克服了传统研究方法的局限性。同时，这些发现不仅为具有高首过效应的药物的开发提供了新的见解，还为淋巴靶向输送系统的最佳设计提供了重要的理论和实验基础，具有广泛的应用前景。高晓丽：负责写作、审稿与编辑工作，概念框架构建，项目监督及管理。陈春丽：负责写作、审稿与编辑工作，以及项目资金的筹措。

作者对中央政府地方科技发展引导基金（项目编号：ZYYD2025ZY18）、新疆维吾尔自治区研究生研究与创新项目（项目编号：XJ2024G188），以及中国新疆天山创新团队计划——创新环境建设专项（人才与基地支持）（项目编号：2025D14016）对本研究工作的财政支持表示衷心感谢。

**CRedIT作者贡献声明：**
严书静：负责原始稿件的撰写、数据收集及项目资金的筹措。
李亮云：负责稿件的审稿与编辑工作，以及数据收集。
崔海阳：负责稿件的审稿与编辑工作，以及数据收集。
钟春红：负责稿件的审稿与编辑工作，以及数据收集。
高晓丽：负责项目监督、管理及概念框架的构建。
陈春丽：负责稿件的审稿与编辑工作，以及项目资金的筹措。