评估儿童分化型甲状腺癌中的钠-碘同向转运蛋白（NIS）

《European Thyroid Journal》：Assessing the sodium-iodide symporter (NIS) in pediatric differentiated thyroid carcinoma

　　保罗·阿隆索·加西亚·阿尔维斯-琼尼奥尔 | 马里奥·卢西奥·阿劳霍 | 佩德罗·尼科劳·内托 | 普里西拉·瓦尔韦尔德 | 希拉·科埃略·索亚雷斯·利马 | 路易斯·费利佩·里贝罗·平托 | 简妮特·玛丽亚·塞鲁蒂 | 费尔南达·瓦伊斯曼
巴西里约热内卢国家癌症研究所（INCA）内分泌科

**背景**
钠-碘同向转运蛋白（NIS）由SLC5A5基因编码，对于碘的吸收以及分化型甲状腺癌（DTC）中放射性碘治疗的疗效至关重要。关于NIS转录与儿童DTC中蛋白质表达之间关系的数据仍然有限。

**方法**
我们进行了一项回顾性队列研究，对象为患有DTC的儿童和青少年患者，通过免疫组化检测肿瘤及邻近非肿瘤甲状腺组织中的NIS蛋白质表达，并通过定量实时PCR检测肿瘤中的SLC5A5 mRNA表达。研究分析了临床、病理学、分子学及治疗相关的变量。

**结果**
我们分析了92名19岁以下诊断为DTC的患者的样本。肿瘤细胞中的NIS水平显著低于邻近非肿瘤细胞（比值比（OR）：106.8；95%置信区间（CI）：30.7–337.5；P < 0.0001）。仅在20/92的肿瘤样本中检测到NIS，而SLC5A5在70个肿瘤样本中均有表达。未发现NIS表达或SLC5A5表达与临床特征、组织学特征、转移、碘-131（I-131）活性或治疗反应之间的关联。尽管肿瘤中的NIS蛋白质表达降低，但大多数患者对放射性碘治疗反应良好。

**结论**
本研究表明，儿童甲状腺肿瘤与邻近非肿瘤组织中的NIS表达存在显著差异，NIS阳性肿瘤的比例低于SLC5A5高表达的肿瘤。NIS蛋白质检测或SLC5A5表达与临床特征、组织学特征、肿瘤侵袭性或治疗反应之间无关联。

**引言**
儿童甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤类型，但在儿童中仍属于罕见疾病（1, 2, 3）。儿童甲状腺癌在发病率、临床表现、病理学特征和分子特性方面与成人甲状腺癌有所不同（4, 5）。与被诊断为分化型甲状腺癌（DTC）的成人相比，患有DTC的儿童和青少年通常表现出更具侵袭性的疾病形式，表现为更广泛的甲状腺外扩展、更多的颈部淋巴结受累（淋巴结转移）和远处转移（6, 7, 8, 9）。有趣的是，尽管具有这些侵袭性特征，死亡率仍然较低，通常低于2%（2, 3）。
患有转移的DTC患者复发风险更高。因此，美国甲状腺协会（ATA）和欧洲甲状腺协会（ETA）建议对中度及高风险组患者进行碘-131（I-131）辅助治疗。这种辅助治疗策略旨在降低疾病相关的复发风险和死亡率，同时便于患者随访（10, 11）。
钠-碘同向转运蛋白（NIS）是一种主要位于甲状腺滤泡细胞基底侧膜上的糖蛋白，由19p13.11染色体上的SLC5A5基因编码。NIS在将碘从血液主动转运到甲状腺细胞中起着关键作用（2 Na+/I），这对甲状腺激素的合成至关重要（12）。
在保留SLC5A5表达的残留或转移性甲状腺肿瘤中，NIS是辅助治疗的重要组成部分，因为它能捕获I-131并通过其β粒子的发射产生的电离作用促进细胞破坏（13, 14）。一些针对成人DTC的研究表明，在某些甲状腺肿瘤细胞中可能检测不到NIS，这可能导致放射性碘耐药性（15, 16, 17, 18）。
针对儿童DTC细胞中NIS或SLC5A5表达的研究较为有限。这项研究至关重要，因为儿童DTC通常比成人DTC更具侵袭性，因此超过三分之二的患者需要辅助治疗（19, 20, 21, 22）。
因此，本研究旨在探讨SLC5A5基因和NIS蛋白质的表达情况，并评估其与临床特征、组织学特征、转移、辅助I-131治疗反应及最终治疗反应（动态风险）之间的关联。

**材料与方法**
这是一项回顾性队列研究，对象为1976至2022年间在巴西一家癌症研究中心（国家癌症研究所 – INCA）被诊断为DTC的儿童患者。在获得国家癌症研究所伦理委员会批准后（CEP/CONEP 2.146.715 和 CAAE 66569517.8.0000.5257），我们对该机构的纸质和电子记录进行了检索，以寻找被诊断为DTC的儿童患者。研究纳入的标准包括：年龄低于19岁、在儿科肿瘤内分泌门诊接受随访、经组织学确诊为DTC、临床数据可解释且保存有肿瘤样本的患者。排除随访时间少于6个月、不愿参与研究或肿瘤样本数量或质量不足以进行分析的患者。
复发风险根据2015年ATA儿童指南进行分类（19）。治疗反应（动态风险）的评估依据成人ATA指南（10）进行，因为目前尚无标准化的方法来评估儿童甲状腺肿瘤的治疗反应。
组织样本取自首次甲状腺切除术时的原发肿瘤组织。首先通过免疫组化（IHC）检测NIS蛋白质表达，随后使用实时聚合酶链反应（qPCR）分析SLC5A5基因表达。

**NIS蛋白质评估**
切片使用市售预处理填充物（ImmunoSlide-EasyPath）制备，切片厚度为3微米，经福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）。DTC样本依次浸泡在二甲苯中（每次5分钟，共3次），然后快速浸入100%、90%、80%和70%酒精中。多余酒精用流动水冲洗3分钟。抗原修复在Trilogy Buffer（Cell Marque）中于98°C下进行30分钟。过氧化物酶阻滞和蛋白质阻滞使用NovoLink Max Polymer Detection Kit（Leica Microsystems，德国）各进行5分钟。样品与多克隆兔抗? SLC5A5（Novolink）以1:2,800稀释度在冰箱中孵育过夜。随后将样品与一抗和多聚酶（Novolink）孵育30分钟。使用DAB显色剂显色3分钟，再用hematoxylin进行复染30秒。去除多余hematoxylin后，将切片浸入70%、80%、90%和100%酒精及二甲苯中。使用香脂封片，在光学显微镜下观察细胞质/膜染色情况。
非肿瘤甲状腺组织和气管组织分别作为阳性和阴性对照。后者取自我们机构的病理档案，收集自与甲状腺疾病无关的手术过程中。
NIS表达记录为阳性或阴性。任何程度的染色都被视为NIS检测阳性。
免疫组化评估由两名熟悉临床数据的独立病理学家独立完成，不一致的结果需共同讨论达成共识。

**SLC5A5基因表达评估**
从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的样本中提取RNA；具体操作为使用Purelink FFPE RNA Kit（Invitrogen）按照制造商说明处理每个样本的一个10 μm厚的切片。RNA样本通过Thermo公司的Nanodrop仪器进行定量。使用SuperScript IV逆转录酶（Invitrogen）从每个样本的1.0 μg RNA合成cDNA。qPCR反应体积为10.0 μL，使用Quantinova SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen，德国）在Rotor-Gene热循环仪上进行。样本重复三次分析。SLC5A5 mRNA的相对水平通过ΔCt方法测定，以GAPDH作为内参基因。
引物序列如下：SLC5A-F 5′ ACCTCATCAAACCTCGGCTG-3′，SLC5A5-R 5′-GATCCGTAGATGAGTGAGAGC-3′，GAPDH-F 5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3′，GAPDH-R 5′ AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。
阳性对照为先前分析的DTC样本，阴性对照为OE19细胞系（不表达功能性NIS）。SLC5A5 mRNA表达记录为阳性或阴性。任何表达的样本（SLC5A5/GAPDH）均视为阳性。RNA完整性通过电泳图和显示28S及18S rRNA峰值的虚拟凝胶确认。

**数据分析与统计**
所有数据和结果均使用Microsoft Excel v.16.0（Microsoft，美国）绘制。统计分析使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software Inc.，美国）。分类变量使用绝对频率和相对频率进行分析。对于连续变量，评估其正态性，并以平均值/中位数、标准差、最小值、最大值和范围表示。非参数数据使用Student’s t检验或单因素ANOVA进行统计显著性检验。对于正态分布的变量，使用卡方（X2）检验或Fisher精确检验。P值<0.05被视为具有统计学意义。

**结果**
1976年至2022年间，共有165名19岁以下被诊断为DTC的患者在本院接受评估。其中92名患者的样本适合本研究。图1详细列出了排除标准。
在92名患者中，62名为女性，诊断时中位年龄为14.8岁（±3.7岁）。患者平均随访时间为8.8年（±6.0年）。
在组织学特征方面，89名为乳头状DTC，3名为滤泡状甲状腺癌，平均肿瘤大小为2.7厘米（±1.7厘米）。诊断时有69/92患者出现颈部淋巴结转移，21/92患者出现远处转移（均为肺转移）。根据儿童ATA指南（19），50/92患者属于高风险组，22名属于低风险组。随访结束时，仅24/92患者仍有肿瘤迹象，而超过一半（45/92）患者无肿瘤，表明治疗反应良好。
辅助治疗方面，平均累计使用的I-131活性为150 mCi（±177.9 mCi），范围为30至900 mCi。21名患者接受了多轮放射性碘治疗（RIT）。表1提供了研究人群的临床、组织学和RIT信息。
**表1. 被诊断为分化型甲状腺癌的儿童患者的临床病理特征、风险评估和治疗结果**
**特征** | **数值**
| **最小值** | **最大值** | **患者数量** |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 诊断年龄（岁） | 14.8 ± 3.7 | 4.7 | 48 |
| 随访时间（年） | 8.8 ± 6.0 | 8.8 | 24.1 |
| 女性性别 | 62 | | |
| 肿瘤类型 | 乳头状 | 89 | |
| 肿瘤大小（厘米） | 2.7 ± 1.7 | 0.5 | 11.0 |
| 淋巴结转移 | 69 | 9 | |
| 远处转移 | 21 | | |
| ATA儿童风险组 | 低风险 | 22 | |
| 中等风险 | 20 | |
| 高风险 | 50 | |
| I-131累积活性（mCi） | 150 ± 177.9 | 30 | 900 |
| 接受多次RIT治疗的患者 | 21 | | |
**随访结束时的治疗反应** | | |
| 极好反应 | 45 | |
| 不完全生化反应 | 6 | |
| 不完全结构反应 | 17 | |
| RIT（放射性碘治疗） | | |

**NIS检测与评估**
共有92名患者的手术组织适合本研究。在邻近非肿瘤甲状腺组织和肿瘤组织中检测NIS蛋白质表达。NIS检测结果存在异质性，染色强度和阳性染色细胞数量均有变化（图2）。NIS检测与SLC5A5表达与临床特征、转移检测、风险评估以及对治疗和放射性碘治疗的反应的关联。`

**空细胞表达检测**
SLC5A5 ? | SLC5A5 +
NIS ? | NIS +
总人数 | 343 | 672
性别 | 0.62 | >0.99
女性 | 232 | 248
男性 | 111 | 424

**淋巴结转移，是** | 26 | 29 | 0.77 | 55 | 14 | 0.56
**远处转移，是** | 89 | >0.99 | 18 | 30 | 0.54
**ATA高风险，是** | 16 | 21 | 0.47 | 41 | 0.45
**良好反应，是** | 16 | 16 | >0.99 | 34 | 11 | 0.54
**结构部分反应，是** | 13 | 12 | 0.60 | 16 | 8 | 0.38
**RIT** | 0.05 | 0.54
**多个（>1）** | 12 | 51 | 93
**唯一** | 20 | 28 | 49 | 15 |

**活性**
>0.99 | 0.38
<150 mCi | 89 | 166
| 150 mCi | 24 | 24 | 52 | 12 |

**NIS，钠-碘转运蛋白；ATA，美国甲状腺协会；RIT，放射性碘治疗；mCi，毫居里。**

**SLC5A5基因表达评估**
在NIS检测后，只有70个肿瘤样本足以评估SLC5A5基因表达。RNA提取的中位浓度为404.9 ng/μL（范围：23.1–2,349.6 ng/μL）。使用260/280 nm比率评估的RNA纯度中位数为1.87（范围：1.28–2.02）。在70个样本中有36个（51.4%）检测到SLC5A5基因表达（表2）。SLC5A5基因表达与NIS蛋白检测之间存在显著差异，根据IHC被认为是NIS+的样本中表达水平更高（P = 0.02）（图3）。

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**图3. SLC5A5表达与NIS蛋白检测的关联。**
图4显示了92名患者特征的热图，包括肿瘤SLC5A5表达、NIS检测以及随访结束时的治疗反应。

**讨论**
本研究在一个最大的单中心儿童甲状腺乳头状癌（DTC）队列中，全面评估了NIS在转录（SLC5A5 mRNA）和蛋白质水平上的情况。我们发现，儿童甲状腺肿瘤中的NIS蛋白检测率显著低于邻近的非肿瘤甲状腺组织（89 vs 20例，P < 0.0001）。尽管SLC5A5 mRNA表达与NIS蛋白检测相关（P = 0.02），但在肿瘤组织中观察到基因表达相对保留而蛋白检测减少的现象。多项研究一致发现，包括儿童DTC在内的甲状腺癌中NIS检测率降低（23, 24）。在儿童人群中，NIS检测率似乎随年龄变化，年龄较小的儿童比青少年更低，这可能会影响肿瘤生物学特性和对放射性碘治疗的反应（25）。这些与年龄相关的差异可能部分解释了儿童DTC观察到的异质性临床行为。
肿瘤中NIS蛋白检测减少可能反映了转录后调节受损、糖基化改变、细胞内运输缺陷或蛋白质降解增加。最近的实验数据表明，NIS的功能主要依赖于正确的膜定位和翻译后修饰，而不仅仅是转录调节。这些机制在儿童甲状腺肿瘤中可能特别重要，因为这些肿瘤通常显示出与成人DTC不同的分子和表观遗传特征。
表观遗传调控也在NIS表达中起重要作用。SLC5A5启动子区域内的CpG岛过度甲基化与甲状腺肿瘤（包括儿童肿瘤）中NIS检测减少有关，可能是甲状腺肿瘤发生的早期事件（26）。这一观察支持了同时评估SLC5A5基因表达和蛋白检测的合理性。
迄今为止，尚未广泛探讨儿童甲状腺癌中SLC5A5 mRNA表达与NIS蛋白检测之间的关系。尽管文献广泛讨论了SLC5A5表达及其在乳头状甲状腺癌中的预后意义，但大多数数据来自成人队列。一些研究报告了甲状腺肿瘤中NIS mRNA和蛋白水平之间的差异。Suh等人（27）发现，在成人PTC中，SLC5A5 mRNA表达与SLC2A1负相关，与SLC2A4正相关。Trouttet-Masson等人（28）报告说，尽管在大约50%的功能减退甲状腺肿瘤中可以检测到NIS转录本，但NIS蛋白经常无法检测到，这表明存在转录后失调或蛋白质成熟受损。此外，Peyrottes等人（29）认为，在某些甲状腺肿瘤中观察到的细胞内NIS染色可能反映了非特异性抗体结合，而不是真正的功能性蛋白质表达，这意味着这些癌症中的实际NIS水平较低。Tavares等人（30）进一步表明，SLC5A5表达降低与DTC中NIS在血浆膜上的定位减少有关，并与更大的肿瘤侵袭性和常见的癌变改变（包括BRAF、RAS和TERT突变）相关。
总体而言，这些研究表明，甲状腺癌中NIS mRNA表达与蛋白检测之间的差异可能源于转录和转录后改变、蛋白质定位受损以及免疫组化评估的技术限制。这一观点在临床上具有重要意义，因为目前正在研究旨在恢复NIS表达和功能的新靶向和重新分化疗法。这些方法旨在重新启用以前被归类为放射性碘抵抗的肿瘤的放射性碘摄取，从而可能允许使用I-131进行再治疗（31）。
尽管儿童DTC通常比成人DTC病状更严重，超过75%的病例需要辅助放射性碘治疗，但我们的研究中观察到的NIS蛋白检测率较低，这可能表明对辅助I-131治疗完全反应的儿童患者比例低于传统预期。与先前的报告（22, 32, 33, 34）一致，只有大约一半的队列在随访结束时达到良好反应，而92名患者中有24人在平均随访8.8年后仍有持续的结构性疾病。重要的是，没有观察到与疾病相关的死亡。
我们的发现与成人DTC数据以及包括Patel等人（35）的开创性工作一致，这些工作证明了NIS表达与儿童和青少年临床结果之间的关联。然而，同时评估同一儿童肿瘤中NIS转录和蛋白定位的研究仍然很少。我们的数据扩展了现有知识，表明SLC5A5转录的保留并不一定转化为可检测或功能相关的儿童DTC中的NIS蛋白表达。
尽管免疫组化检测到的NIS蛋白水平较低，但许多儿童患者对放射性碘治疗有良好反应。这一明显的矛盾可以通过肿瘤内的异质性、亚克隆肿瘤群体中功能性NIS的部分保留或尽管总体蛋白表达较低但仍具有足够的碘摄取能力来解释。这些观察结果支持放射性碘治疗在儿童DTC中的持续临床有效性，同时也强调了将静态免疫组化评估作为功能性碘摄取替代指标的局限性。
这项研究存在固有的局限性，包括其回顾性设计、单中心设置、用于SLC5A5分析的肿瘤样本数量有限，以及免疫组化和基于PCR的方法敏感性不同。此外，并非所有病例都系统地进行了功能成像相关分析。尽管如此，鉴于儿童DTC的罕见性，我们的队列提供了可靠的描述性和转化数据，并支持未来需要多中心研究整合分子、表观遗传和功能成像方法的必要性。
虽然没有儿童研究专门探讨NIS评估在新兴靶向治疗中的作用，但对儿童DTC中NIS表达和分子特征的更深入了解可能有助于识别最有可能从重新分化策略中受益的患者。NIS评估也可能有助于估计此类治疗后的成功消融可能性。
总之，本研究强调了儿童甲状腺肿瘤与邻近非肿瘤组织之间NIS表达的显著差异，NIS阳性肿瘤的比例低于SLC5A5高表达的肿瘤。未观察到NIS蛋白检测或SLC5A5表达与临床特征、组织学、肿瘤侵袭性或治疗反应之间的关联。这些发现应被视为假设生成的，并强调了进行前瞻性、多中心研究的必要性，以更好地定义儿童甲状腺癌中的碘处理情况并推进个性化治疗策略。

**利益声明**
FV是Bayer、Exelixis、Ipsen、AstraZeneca和Lilly的演讲者，也是这些公司临床试验的主要研究者。其他作者没有需要声明的利益冲突。
**资助**
本工作由FAPERJ编号E_10/2016E的Vaisman F资助。

**作者贡献声明**
PAGAJ：撰写——原始草稿（主导）和数据收集。MLCA：数据收集（平等），撰写。PNN：概念化（支持），正式分析（平等），撰写和方法学（主导）。SCSL、LFRP、JMC：审查和编辑（平等）。PV：撰写——审查和编辑（平等）。FV：概念化（主导），撰写——原始草稿（支持），撰写——审查和编辑（平等）。