《Experimental Cell Research》：The redox-active CXXC motif of BCAT1 regulates extracellular vesicle biogenesis in U937 macrophages
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詹姆斯·希利尔（James Hillier）|马蒂厄·Y·布鲁内（Mathieu Y. Brunet）|丽贝卡·特里（Rebecca Terry）|乔安妮·惠特克（Joanne Whittaker）|杰玛·奥尔科特（Gemma Allcot）|索菲·C·考克斯（Sophie C.
詹姆斯·希利尔（James Hillier）|马蒂厄·Y·布鲁内（Mathieu Y. Brunet）|丽贝卡·特里（Rebecca Terry）|乔安妮·惠特克（Joanne Whittaker）|杰玛·奥尔科特（Gemma Allcot）|索菲·C·考克斯（Sophie C. Cox）|帕特里夏·埃斯特万（Patricia Esteban）|史蒂文·J·科尔斯（Steven J. Coles）|伊万·沃尔（Ivan Wall）
免疫学与免疫疗法，伯明翰大学，英国伯明翰，B15 2TH
摘要
胞质分支链氨基转移酶1（BCAT1）是一种经典的氨基转移酶，可催化必需氨基酸（包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）的分解。我们之前的研究表明，BCAT1还包含一个具有抗氧化活性的CXXC基序，能够在单核细胞U937系中减少细胞内的活性氧（ROS）。此外，与对照组相比，这些细胞表现出较低的CD14/CD68表达水平，这一表型表明它们偏向于M2型巨噬细胞。鉴于细胞外囊泡（EV）的释放与氧化应激有关，并且人们对使用M1型和M2型巨噬细胞产生的EV进行治疗越来越感兴趣，我们研究了BCAT1的CXXC基序是否能够调节在过表达野生型BCAT1（WT BCAT1）、CXXC基序突变体（CXXS BCAT1）或载体对照组中的EV释放。结果表明，虽然WT BCAT1细胞内的ROS水平显著低于对照组，但在正常（10% FBS）和血清饥饿（0% FBS）条件下，WT BCAT1细胞产生的EV数量显著高于CXXS BCAT1和载体对照组。对CD63/CD81/CD9四聚糖组成的分析显示，大部分产生的EV都是CD63+类型的，血清饥饿进一步增加了CD63+ EV的数量。综上所述，这些数据表明BCAT1及其抗氧化活性CXXC基序可能在巨噬细胞类细胞的EV生物发生过程中发挥新的作用。
引言
细胞外囊泡（EVs）是一类由多种细胞释放的纳米级膜结合囊泡，主要根据大小和细胞来源进行分类[1]。已报道了几种EV亚型，包括大型肿瘤体（1000-10000nm）、凋亡小体（50-5000nm）、微囊泡（100-1000nm）和外泌体（30-150nm）[2], [3]。外泌体通过细胞内多泡体（MVBs）与质膜融合而释放，而微囊泡和凋亡小体则直接从质膜上脱落[4]。近年来，EV因其能够将多种生物活性物质（如脂质、蛋白质和核酸）递送到靶细胞而引起了广泛关注[5]。重要的是，EV的组成反映了母细胞的生理状态，这使它们既可用作疾病生物标志物，也可作为潜在的治疗递送载体[6], [7], [8]。
在巨噬细胞的背景下，EV由于其在调节炎症反应中的作用而受到越来越多的关注。例如，来自抗炎型（M2型）巨噬细胞的EV因其在治疗纤维化和组织修复等炎症性疾病方面的潜力而备受关注[9]。相反，促炎型（M1型）巨噬细胞产生的EV也被认为可能在免疫调节和癌症防御中发挥作用[10]。因此，了解控制巨噬细胞中EV生物发生和组成的机制具有重要的生物学和治疗意义。
细胞的氧化还原状态是EV释放的关键调节因素[11]。例如，血清饥饿会导致线粒体产生的ROS增加，从而促进EV的生物发生[12], [13]。在这种情况下，氧化应激不仅会增加EV的产生，还会改变EV的内容物，激活抗氧化和应激反应通路[14]。例如，在核因子红细胞系2相关因子2（Nrf2）的调控下，抗氧化应激反应会促进超氧化物歧化酶、过氧化还原蛋白和硫氧还蛋白等抗氧化蛋白的表达[14]。Kumar等人使用香烟烟雾冷凝物（CSC）诱导U937细胞发生氧化应激[15]，结果发现促炎细胞因子IL-1β被包装进细胞外囊泡中，接受这些EV的靶细胞显示出IL-1β水平和抗氧化酶的增加。在氧化应激下，细胞的抗氧化防御机制最终会被破坏，处于血清饥饿状态的细胞会经历显著的生存能力下降。例如，单核细胞U937系在48至72小时内生存能力会下降约80%，这限制了长期培养中连续收集EV的可行性[16]。
从机制上看，EV释放的氧化还原调节与控制膜运输和细胞骨架动态的通路相关[13]。例如，ROS已被证明可以直接调节RAS和Rab家族GTP酶的活性，这些GTP酶通过含有“氧化还原敏感”C末端半胱氨酸残基的GXXXXGK(S/T)C基序来调节膜运输[17], [18], [19]。ROS还可以通过氧化还原活性蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的活性间接调节GTP酶的活性[20]。此外，氧化还原敏感蛋白如酪氨酸磷酸酶和硫氧还蛋白也被认为参与了EV的生物发生。最近的研究发现，巨噬细胞中外泌体的释放受到SHP2蛋白脱活的调控[21]。此外，SHP2还受到含有CXXC基序的硫氧还蛋白（Trx）的正向调控，这支持了EV释放是一个氧化还原调控过程的观点[22]。
近年来，胞质分支链氨基转移酶（BCAT1）引起了广泛关注，主要集中在其经典的代谢功能上，即从分支链氨基酸（BCAA）亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸向α-酮戊二酸的可逆转移，从而形成相应的分支链α-酮酸（BCKA）和谷氨酸[23], [24]。然而，BCAT1还包含一个具有抗氧化活性的CXXC基序，其氧化还原中间电位与含有CXXC基序的抗氧化剂（如Trx）相似[25], [26], [27]。我们之前的研究表明，在髓系细胞系U937中过表达BCAT1可以依赖CXXC机制减少细胞内的ROS，并且在分化过程中降低CD14/CD68的表达，表明该细胞更倾向于M2型表型[28]。此外，在神经元细胞模型中的研究表明，BCAT1的CXXC基序依赖于RhoGEF的氧化还原作用，RhoGEF可以调节Rab和Ras GTP酶以及多种细胞骨架蛋白（如微管蛋白、隔膜蛋白和肌球蛋白），这些都与EV的释放有关[25], [29]。鉴于氧化还原信号传导、线粒体代谢和EV生物发生之间的关联，这些发现表明BCAT1可能作为巨噬细胞类细胞中EV产生的调节因子。因此，本研究的目的是利用我们的U937细胞模型系统来探究这一潜在作用[30]。
章节摘录
细胞培养和试剂
U937（ATCC?编号CRL-1593.2TM）单核人髓系白血病细胞系从美国类型培养集（Glasgow, UK）获得。U937细胞在含有1%青霉素/链霉素、10%胎牛血清（FBS）和2 mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中以1 × 105和2 × 106细胞/mL的密度进行培养。细胞在37°C和5% CO2条件下培养。
BCAT1的突变及其在U937细胞中的转导
BCAT1-CXXC基序的定点突变及其在U937细胞中的转导按照先前的描述进行[30]。稳定表达的
U937细胞中BCAT1的过表达
通过qPCR验证了U937细胞中BCAT1的过表达，结果显示WT和CXXS BCAT1的mRNA表达量相比载体对照转基因细胞增加了20-25倍（图1，P<0.0001）。WT BCAT1和CXXS BCAT1的表达没有显著差异，这有助于有效评估BCAT1的酶促/代谢功能及其抗氧化CXXC基序的相对贡献（图1）。
BCAT1表达会减小细胞大小和颗粒度
由于已证明免疫细胞的表型会发生变化
讨论
本研究考察了BCAT1及其抗氧化CXXC基序对髓系细胞系U937细胞中EV释放的影响。这一实验设计基于先前的研究，这些研究表明EV的释放至少部分是由氧化还原过程介导的，并且可以通过血清饥饿诱导，血清饥饿会导致线粒体产生的ROS增加[35]。考虑到我们之前的研究结果，即BCAT1的CXXC基序可以减少细胞内的ROS并提高细胞存活率
CRediT作者贡献声明
伊万·沃尔（Ivan Wall）：负责监督和资助。史蒂文·J·科尔斯（Steven J. Coles）：负责撰写、审阅和编辑、监督、资源提供、方法学设计、资助申请和概念构思。马蒂厄·Y·布鲁内（Mathieu Y. Brunet）：负责撰写、审阅和编辑、方法学设计、实验研究。詹姆斯·希利尔（James Hillier）：负责撰写、审阅和编辑、初稿撰写、实验研究、数据分析、数据整理和概念构思。帕特里夏·埃斯特万（Patricia Esteban）：负责监督和资源提供。杰玛·奥尔科特（Gemma Allcot）：
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