微生物-代谢物网络在堆积发酵过程中塑造了初级黑茶的品质

《Food Bioscience》：Microbial-metabolite networks shaping primary dark tea quality during pile fermentation

　　

潘宏静|倪子欣|吴王静|王月飞|周继红

浙江大学农业与生物技术学院茶科学系，杭州，310058，中国

摘要

黑茶是一种具有独特发酵特性的茶叶，因其醇厚的口感和发酵产生的香气而备受推崇。然而，大多数研究都集中在精制阶段，而作为精制基础材料的初级加工阶段却鲜有关于其全面的研究。为填补这一空白，我们结合了超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术和16S rRNA基因测序方法，研究了初级加工过程中的代谢谱变化和细菌群落演替。结果表明，发酵过程中总儿茶素含量增加，非没食子酸酯化儿茶素和没食子酸酯化儿茶素分别增加了39.51%和36.06%；没食子酸的含量在发酵过程中增加了47.06%，并在干燥后进一步积累。多种黄酮苷类物质降解为黄酮、黄酮醇和苷类。在短暂的发酵期间，黄烷-3-醇及其氧化产物的变化并不显著。值得注意的是，发酵12小时后皂苷的含量显著增加。细菌群落的动态变化相对于代谢谱的变化表现出明显的滞后，这表明代谢变化先于并可能驱动了微生物的演替，随后通过微生物组的作用促进了代谢物的重新分配。肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae）成为与关键代谢物高度相关的菌群。分析显示，群落水平上的代谢潜力解释了琥珀酸、蔗糖、烟酰胺和鸟嘌呤成分变化的28%-59%，其中Blautia producta和Siccibacter turicensis等特定菌类及其相关功能基因是主要贡献者。这些发现为未来旨在理解和调控黑茶品质特征的研究提供了系统层面的基础。

引言

黑茶是一种通过微生物发酵生产的茶类，其特点是茶汤颜色较深、口感柔顺，并具有发酵衍生而来的香气。与绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶和红茶不同，黑茶在固定后还会经历微生物转化过程，这一过程塑造了其独特的感官特性（Assad等人，2023年）。黑茶的生产通常包括两个阶段：初级加工和精制。作为一种关键工艺，微生物发酵在不同品种的黑茶中顺序和强度上存在差异。大多数黑茶在初级加工阶段就经历了微生物发酵，例如千两茶、黑砖茶、天建茶和康砖茶；而熟普洱茶和青砖茶则在精制阶段才开始发酵（朱等人，2020年）。

以往的研究主要集中在精制阶段的微生物群落和化学成分上。在真菌中，Aspergillus属在黑茶中普遍存在，其中Aspergillus niger是熟普洱茶中的主要菌种（Fang等人，2008年），而Aspergillus cristatum在福砖茶产品中占主导地位（J. Li等人，2021年）。经过微生物发酵后，普洱茶的茶叶颜色变深、质地变软，茶汤呈现出红棕色；茶多酚、游离氨基酸、茶黄素和茶红素的含量显著下降，同时茶褐素通过氧化聚合形成（X. Q. Chen等人，2022年；Ma等人，2017年）。微生物胞外酶进一步催化没食子酸酯化儿茶素的水解，释放出未酯化的儿茶素和没食子酸（Z. Y. Li等人，2018年）。

相比之下，精制阶段通常持续15-60天，远长于初级加工的12-24小时。由于初级加工时间较短，快速繁殖的细菌可能比真菌发挥更重要作用。此外，整个加工过程中细菌的多样性明显高于真菌的多样性，这突显了细菌与代谢物之间的相互作用（J. Li等人，2022年）。在红茶中，Methylobacterium和Devosia属与没食子酸和槲皮素相关的，而Sphingomonas、Chryseobacterium和Aureimonas属则与山柰酚、茶黄素和茶红素相关（Nurmilah等人，2022年）。某些乳酸菌已被证明能够改善发酵食品的风味和健康益处（Tamang等人，2016年）。由于初级黑茶是精制的基础材料，了解其细菌组成和代谢特征对于全面理解黑茶品质至关重要。

靶向HPLC分析和非靶向UHPLC-MS/MS代谢组学已被广泛用于表征黑茶的化学成分，尽管这些方法难以检测大分子成分（Ma等人，2017年；Zhu等人，2020年）。同时，扩增子测序与代谢组学的结合开始揭示发酵过程中微生物群落与代谢物之间的动态关系（Li等人，2021年）。然而，针对整个初级加工过程的系统性多组学研究仍然有限，代谢变化与微生物变化之间的时间关系仍不明确。

在本文中，我们利用16S rRNA基因测序和UHPLC-MS/MS技术研究了初级加工过程中的代谢谱变化和细菌群落演替。通过整合这些组学数据，我们阐明了细菌群落和代谢物的动态变化，识别出与关键代谢变化相关的细菌，并揭示了塑造黑茶品质的微生物-代谢机制。

节选

茶样

2023年5月，我们从中国浙江省绍兴市新昌县的江南程茂砖茶有限公司的茶园采制了带有1个芽和4片叶的Camellia sinensis新鲜茶叶。茶叶加工过程从采摘开始，随后经过2小时的摊晒自然减压。随后，茶叶在280°C的温度下使用6CST-60旋转固定机（尚阳机械）快速炒制2分钟以停止水分蒸发。

制造过程中的主要化学成分

在PDT（初级黑茶）的加工过程中分析了水分含量、游离氨基酸（WE）以及主要化学成分的含量，包括TP（总糖分）、SS（单糖）、AA（氨基酸）、SP（simple polysaccharides）、GA（甘油酸）、Caf（咖啡因）和儿茶素（图2）。

萎凋和酶失活后，大多数化学成分保持稳定，但SS含量从5.93%下降到4.97%（图2A–C）。在堆积发酵过程中，水分含量和WE分别下降了13.88%和22.35%。SS和SP的含量基本保持不变。

结论

本研究对PDT（初级黑茶）的制造过程中微生物组-代谢动态进行了全面分析，PDT是大多数黑茶产品的原料。通过整合分析主要化学成分、非靶向代谢组学和16S rRNA基因测序，系统地描述了六个关键加工阶段中代谢和细菌谱的共同演变。我们的发现揭示了代谢谱的时间不对称性。

作者贡献声明

潘宏静：撰写初稿、数据可视化、方法设计、数据管理、概念构建。倪子欣：实验设计、数据分析、数据管理。吴王静：结果验证、数据分析。王月飞：项目监督、资源协调、项目管理。周继红：撰写摘要与编辑、项目监督、资金获取、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了浙江省高校的基础研究基金（编号：226-2024-00214）以及云南省茶文化、产业与技术创新团队（编号：2024CX13）的支持。