综合物理化学分析、代谢组学研究及5-脂氧合酶对接技术：天然成熟刺槐蜂蜜与商业蜂蜜样品的对比研究

《Food Chemistry》：Integrated physicochemical profiling, metabolomics and 5-lipoxygenase docking: a comparative analysis of naturally matured acacia honey versus commercial samples

　　李丽梅|郑振山|钱勋|谭思佳|张家坤|陈永达
中国河北省农林科学院生物技术及食品科学研究所，石家庄 050051

摘要
通过物理化学分析和代谢组学研究，对自然成熟（MH，n=3）和热处理后的商业（CH1–CH3，n=9）金合欢蜂蜜的质量差异进行了表征。自然成熟蜂蜜在品质上表现更为优越（pH值更低，总酚类（TPC）、黄酮类（TFC）和DPPH清除能力更强）。代谢组学分析共鉴定出961种代谢物，其中419–461种在MH和CH之间具有显著差异（VIP≥1，FC≥2/≤0.5）；MH富含酚类、黄酮类和萜类化合物，其中KEGG通路中黄酮类及黄酮醇生物合成通路富集（p<0.05）。综合计算方法和体外实验表明，某些MH中的代谢物能与5-LOX强烈结合，亲和力高于齐留通，并且能够抑制其活性（IC50：72.2±19至291.4±53 μmol/L）。苯乙基咖啡酸、隐氯原酸和咖啡酸可作为蜂蜜的质量标志物。这些发现支持了MH的高品质及其抗炎潜力，有助于其品质认证和功能性食品的开发。

引言
蜂蜜是蜜蜂从花蜜中产生的天然产物。其成熟过程涉及对采集的花蜜进行关键的生化转化。在蜂蜜成熟过程中，工蜂分泌一种复杂的酶混合物，将花蜜转化为成熟的蜂蜜。这一过程中的关键酶促反应是蔗糖（花蜜中的主要二糖）的水解，生成葡萄糖和果糖——蜂蜜的主要碳水化合物成分。同时，蜜蜂通过反刍、酶促消化和蜂巢通风将花蜜的初始水分含量降至20%以下，这一阈值不仅抑制了微生物生长，确保了蜂蜜的长期稳定性，也对应于最佳蜂巢条件下7–15天的最短成熟时间（张等，2021）。然而，漫长的成熟时间会占用本可用于储存和加工额外花蜜的蜂巢空间，从而限制了蜂蜜产量。为解决这一问题，商业生产者通常会采集未成熟的蜂蜜，并采用人工脱水技术，其中最常用的是控制加热结合真空脱水的方法，可将水分降至所需阈值以下，同时延长产品保质期（扎雷等，2019）。

蜂蜜是一种营养价值高的天然产品，含有糖类、有机酸、氨基酸、矿物质、维生素、脂质以及多种植物化学物质，包括多酚和黄酮（帕夫洛娃等，2018）。然而，商业蜂蜜生产中的加热步骤会引发有害的化学反应：不仅促进有害化合物（如羟甲基糠醛HMF）的形成（其含量随温度和时间的增加而上升），还会降解关键营养成分（豪阿姆等，2019），从而直接影响蜂蜜的质量。相比之下，自然成熟蜂蜜（MH）是通过蜜蜂的天然酿造过程产生的（不经过人工加速成熟或脱水处理），只有当蜂巢盖层厚度超过90%时才会被收获——这是成熟完全的自然指标。这种无热处理、由蜜蜂主导的生产方式确保了MH保留了其原始的营养和生物活性成分。热处理对蜂蜜质量的负面影响已有充分文献记载（法拉兹等，2023），但很少有研究结合物理化学分析、代谢组学和分子对接来阐明自然成熟和人工加热如何改变蜂蜜的代谢组和生物活性。目前，关于金合欢蜂蜜的生产过程与其功能特性之间的机械联系尚未得到具体研究，这成为了一个重要的研究空白。

填补这一空白需要全面分析蜂蜜的成分，这需要先进的分析技术。代谢组学在这方面显得尤为强大：与传统方法相比，它能系统分析小分子代谢物（包括氨基酸、有机酸、碳水化合物和脂质），并进行高通量筛选以揭示代谢特征和调控机制。以往的成熟蜂蜜与未成熟蜂蜜之间的代谢组学比较发现了显著差异。例如，成熟菜籽蜂蜜积累更多多酚，这些多酚增强了其抗菌活性和自由基清除能力（郭等，2020）。此外，不同脂肪酸谱的研究揭示了蜂蜜成熟的分子基础（孙等，2021）。Raw马努卡蜂蜜与其粉状产品在不同黄酮类、酚类、萜类、碳水化合物和有机酸方面存在显著差异（伊德里斯等，2024），而热处理或微波处理会损害蜂蜜的抗氧化和抗菌性能（法拉兹等，2023）。然而，这些现有研究要么专注于单一类型的蜂蜜，要么仅分析有限的化合物类别，要么未能区分自然成熟（由蜜蜂代谢驱动）与人工处理的具体影响，导致对金合欢蜂蜜中生产过程、代谢途径调控和生物活性化合物积累之间的机制联系不明确。

除了成分差异外，蜂蜜的生物活性也备受关注，但其关键机制仍缺乏研究。蜂蜜具有多种生物活性，包括抗炎（西尔瓦等，2021）、抗氧化（帕尔马-莫拉莱斯等，2023）、抗菌（尤潘基·米耶莱斯等，2022）和抗癌作用（埃特拉夫-奥斯科伊&纳贾菲，2022），其中多酚在介导这些生物活性中起关键作用（达席尔瓦等，2022）。分子对接是一种基于结构的计算方法，可用于识别蜂蜜中的潜在生物活性化合物。例如，蜂蜜中的植物化学物质（如绿原酸）对与抑郁相关的神经递质和酶具有强结合亲和力（埃希吉阿托尔等，2021）。东马来西亚蜂蜜中的化合物可靶向与动脉粥样硬化相关的蛋白质（阿兹曼等，2023），而乙基苯乙酸和百里酚（蜂蜜成分）可与细胞色素C过氧化物酶相互作用（阿贝斯拉米等，2024）。然而，5-LOX（一种与哮喘、脑缺血、癌症和阿尔茨海默病相关的炎症信号通路中的关键酶）作为蜂蜜衍生物的分子靶点的研究尚不充分。特别是，生产引起的代谢组学变化与5-LOX结合亲和力之间的功能联系尚未建立。值得注意的是，5-LOX催化白三烯合成的限速步骤，这是驱动炎症反应的关键；这一关键作用使其成为本研究的重点对象。此外，以往的蜂蜜相关分子对接研究（阿贝斯拉米等，2024）主要关注非炎症靶点（如细胞色素C过氧化物酶），对5-LOX的关注不足。本研究旨在填补这一研究空白。

为解决这些研究空白，本研究选择了中国石家庄的金合欢蜂蜜作为研究对象，原因有多个：作为中国产量最大、消费最广的单花蜂蜜之一，它具有显著的经济价值和市场需求，在全国养蜂业中占据重要地位。其典型的单花特性（如高花蜜纯度和稳定的化学成分）减少了混合花源带来的干扰。此外，该地区金合欢树稳定的开花条件保证了花蜜输入的均匀性，为自然成熟蜂蜜（MH）与商业蜂蜜（CH）之间的可靠比较奠定了基础。通过物理化学分析、UPLC-MS/MS基代谢组学和分子对接的综合方法，我们旨在定量、机制解析和功能阐释自然成熟与人工脱水如何改变金合欢蜂蜜的代谢组特征和生物活性。具体目标包括：（1）识别MH和CH之间关键差异丰富的代谢物和富集的代谢途径，明确自然成熟和热处理在驱动这些代谢组差异中的作用；（2）研究MH中富集的酚类/黄酮类与5-LOX之间的相互作用，阐明其抗炎潜力。通过建立生产过程、代谢组变化和生物活性功能之间的直接联系，本研究为金合欢蜂蜜的质量评估和区分提供了科学依据，同时也为开发功能性更优的蜂蜜产品提供了支持。

**部分内容**
- **自然成熟金合欢蜂蜜（MH）**：2023年间，从中国石家庄的一个养蜂基地收集了三批自然成熟金合欢蜂蜜，每批来自5至8个意大利蜜蜂群体，在蜂巢中自然成熟90天后，最终水分含量低于18%。所有三批均作为独立的生物重复样本（n=3）进行后续分析。
- **商业金合欢蜂蜜（CH）**：分析了三种代表性的本地品牌商业蜂蜜的物理化学和生物活性指标。商业蜂蜜（CH1–CH3）的pH值（4.76–4.93）显著高于自然成熟蜂蜜（MH，pH=4.32；图1A），这归因于热处理导致的有机酸降解——与先前报道一致（哈尼斯等，2022）。相比之下，MH较强的酸性源于自然成熟90天期间有机酸的积累（吴等，2022），表明生产方法与蜂蜜品质之间存在直接关联。

**结论**
生产方法显著影响金合欢蜂蜜的质量和植物化学成分。自然成熟蜂蜜（MH）在品质参数上表现更优，包括较低的pH值、更高的总酚类/黄酮类含量、更强的淀粉酶活性和抗氧化能力。代谢组学分析显示MH具有独特的代谢特征，富含酚类、黄酮类、萜类和其他生物活性化合物。

**作者贡献声明**
李丽梅：撰写初稿、正式分析、数据整理、概念构思。
郑振山：撰写、审稿与编辑、方法学制定。
钱勋：撰写、审稿与编辑。
谭思佳：撰写、审稿与编辑。
张家坤：撰写、审稿与编辑、资源准备、实验设计。
陈永达：资源准备、实验设计。

**资助来源**
本研究得到了河北省农林科学院博士基金项目的支持 [项目编号C25R1303]。

**未引用参考文献**
AOAC International, 2023
中国标准化管理委员会, 2003

**利益冲突声明**
作者声明无已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

**致谢**
作者感谢河北学术桥技术有限公司在数据处理方面的辛勤支持。