广覆盖的靶向UPLC-MS/MS代谢组学和转录组学联合分析揭示了五种猕猴桃品种中与MYB基因相关的活性酚类化合物的变异情况

《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Integrated widely targeted UPLC-MS/MS metabolomics and transcriptomics reveal MYB-linked variation in bioactive phenolics across five kiwifruit varieties

　　段明正|常洁瑜|何世荣|李园桥|陈从静|陆婷芬|段金瑞|段宪德|库尔班·阿里|杨顺强|穆罕默德·朱奈德·拉奥
中国云南贵州高原生态农业与生物多样性高级研究所，昭通大学，昭通657000

**摘要**
猕猴桃（Actinidia spp.）因其具生物活性的植物化学物质而受到重视，然而不同种类和品种间的酚类代谢物研究仍不充分。通过使用广泛靶向的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）代谢组学方法，我们对五种猕猴桃品种（包括Actinidia chinensis‘SunGold’、‘Guichang’（野生种）和Actinidia arguta‘Danyang flat’ DY、‘Maolvfeng’）中的酚类物质进行了分析。共鉴定出190种酚类代谢物。其中，‘Danyang flat’ DY品种显著积累了木脂素和香豆素（如cleomiscosin C，log?FC值为14.09，高于‘SunGold’品种），以及schizandriside等化合物，并展现出最强的自由基清除能力。多元分析证实了品种间的明显分组，并确定了一些Variable Importance in Projection (VIP) > 1.0的化合物在分离过程中起关键作用。物种特异性的MYB转录因子表达与这些酚类物质谱型相关，表明其积累存在遗传调控基础。 pathway分析表明，遗传背景影响了特定酚类物质的生成路径：‘A. arguta’更倾向于产生木脂素/香豆素，而‘SunGold’则富含黄酮类化合物。这些结果为培育营养价值更高的猕猴桃品种提供了代谢和转录层面的线索。

**1. 引言**
猕猴桃（Actinidia spp.）作为一种营养价值高的水果，因其独特的风味、鲜艳的颜色以及卓越的营养和功能性而受到全球认可。除了富含维生素C外，猕猴桃还含有多种生物活性酚类化合物，这些化合物对其感官品质和功能性有着重要贡献（Zhang et al., 2020）。酚类物质在决定果实颜色、涩味和苦味方面起着核心作用，同时还具有强大的抗氧化、抗炎和心脏保护作用（Moysidou et al., 2024）。在食品化学领域，了解猕猴桃中酚类代谢物的多样性和调控机制对于优化其营养价值及指导育种策略至关重要（Moysidou et al., 2024）。现有研究主要关注黄酮类和酚酸等酚类化合物（Moysidou et al., 2024; Yu et al., 2020），但这些化合物并不能完全涵盖猕猴桃中的所有酚类物质。新兴研究表明还存在其他酚类亚类，如香豆素、木脂素和芪类，但它们的分布和功能尚不明确（Li et al., 2024; Yu et al., 2020; Zhang et al., 2020）。此外，大多数研究集中在Actinidia chinensis（黄色果肉）和Actinidia deliciosa（绿色果肉）品种上，而对具有独特代谢和感官特性的‘A. arguta’品种了解较少。这些物种间的遗传多样性可能是导致酚类成分差异的重要因素，但缺乏全面的比较代谢组学研究（Li et al., 2024）。在分子水平上，植物中酚类化合物的生物合成受到转录因子的严格调控，其中MYB家族起着关键作用（Rao & Zheng, 2025）。MYB转录因子调控苯丙素途径中结构基因的表达，从而影响黄酮类、酚酸及相关代谢物的积累（Rao, Duan et al., 2025; Rao & Zheng, 2025）。最新研究强调了转录因子在连接植物应激反应和代谢调控中的核心作用（Liu et al., 2024）。在多种果树中，MYB调节因子与色素沉着、抗氧化能力和应激反应的变化有关（Duan et al., 2025）。尽管已有猕猴桃的基因组资源，但关于MYB转录因子在酚类生物合成中的功能研究仍有限。初步的转录组学研究发现了可能与黄酮类和木质素途径相关的MYB候选基因（Mao et al., 2024; X. Wang et al., 2021），但其表达模式对不同猕猴桃品种间酚类多样性的影响仍需进一步探讨。阐明这些调控关系对于通过遗传调控提高酚类含量和功能至关重要。

猕猴桃中酚类代谢物的多样性不仅具有学术意义，还对营养价值、抗氧化能力和消费者吸引力具有直接影响（Barzegar et al., 2025; Duan et al., 2026; Zhang et al., 2020）。酚类化合物有助于清除活性氧、调节肠道微生物群并影响采后稳定性（Guo et al., 2026; Zhang et al., 2020）。近期比较研究表明，红色果肉的‘A. chinensis’‘Hongyang’和紫色果肉的‘A. arguta’‘Mini Amethyst’品种中黄酮类化合物的浓度和多样性更高，从而提升了其营养价值（Yu et al., 2020）。野生猕猴桃品种往往具有独特的化学特性，尤其是黄烷-3-醇类化合物的积累（Asadi et al., 2024）。从食品化学角度来看，理解酚类组成与抗氧化活性之间的相互作用有助于设计具有优化功能特性的功能性食品和营养补充剂。这种差异由关键生物合成基因（如F3H、UFGT等）及相关转录因子（如bHLH和MYB10）的差异表达调控，这些基因调节酚类生物合成途径（Asadi et al., 2024）。因此，酚类谱型可作为品种区分和质量评估的生化标志物，为改善感官和营养特性的育种计划提供重要依据。整合代谢组学和转录组学方法有助于揭示控制酚类生物合成和积累的复杂调控网络。

尽管研究兴趣日益增加，但对不同猕猴桃品种中酚类成分的全面了解仍不完整。现有文献缺乏对多种猕猴桃物种和品种间酚类亚类的系统比较分析，也未明确酚类变异的遗传基础及其相关的MYB基因。这种知识空白限制了利用天然酚类多样性培育优良品种的能力。解决这一挑战需要结合代谢组学和基因表达分析的方法，将代谢表型与调控机制联系起来。本研究旨在通过使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）系统，系统地分析五种猕猴桃品种（代表A. chinensis和A. arguta）的酚类代谢物，实现以下目标：（i）全面分析含黄酮类、酚酸、香豆素和木脂素的酚类代谢物；（ii）比较A. chinensis和A. arguta之间的酚类积累模式，揭示物种特异性代谢特征；（iii）研究MYB基因表达与酚类谱型之间的关联，确定关键调控因子；（iv）探讨酚类组成与自由基清除能力之间的关系，找出影响功能的差异代谢物。通过整合代谢组学和转录组学分析，本研究旨在揭示猕猴桃中酚类多样性的机制，并为营养导向的育种提供分子基础，从而推动食品化学领域的发展。

**2. 材料与方法**
**2.1. 猕猴桃样品制备**
我们分析了五种猕猴桃品种：LC（‘Maolvfeng’）、WL（野生种）、GC（‘Guichang’）、SG（‘SunGold’）和DY（‘Danyang flat’）。这些品种分别属于Actinidia chinensis（GC、WL、SG）和Actinidia arguta（LC、DY）两个物种。选择成熟度一致且无物理损伤或病虫害的果实，所有果实均经过相同的采后处理：先用清水清洗以去除表面杂质，然后放在无菌纱布上风干。用无菌手术刀小心去除果皮，仅保留果肉。每种品种的果肉混合后研磨成 uniform 的果泥，每品种制备三个独立生物重复样本。将部分果泥包裹在铝箔中制成小球，放入预冷的离心管中并贴上标签，随后将离心管浸入液氮中快速冷冻2–5分钟直至完全固化。所有样本保存在-80°C的冷冻箱中以备后续代谢分析。

**2.2. 化学品和试剂**
所有化学品和溶剂均采用分析级或HPLC级。用于DPPH●自由基清除测定的试剂包括DPPH（1,1-二苯基-2-吡啶肼，CAS 1898-66-4）和标准品Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基铬花酸），样品提取使用80%（v/v）甲醇进行。UPLC-MS/MS代谢组学分析使用的试剂包括HPLC级乙腈、甲醇和甲酸（Merck KGaA，德国达姆施塔特）。超纯水使用Milli-Q纯水系统（Millipore，美国贝德福德）制备。内标2-氯苯丙氨酸（纯度98%，CAS 14091–11-3）购自J&K Scientific Ltd（北京）。代谢物提取使用含1 ppm内标的70%（v/v）甲醇，色谱分离使用水（A）和乙腈（B）作为流动相，两者均添加0.1%（v/v）甲酸。

**2.3. DPPH●自由基清除测定**
通过测量猕猴桃样品清除DPPH（1,1-二苯基-2-吡啶肼）自由基的能力来评估其自由基清除能力（Dudonne et al., 2009）。选择DPPH测定作为评估自由基清除能力的标准快速方法，因为它能体现总酚类含量与自由基清除能力的功能相关性；本研究的主要重点是代谢组学和转录组学分析，因此未进行FRAP等辅助测定。提取过程中，将约0.1克新鲜样品研磨并过筛（40目），再用1毫升80%甲醇提取。80%甲醇是常用的溶剂，适用于体外抗氧化实验中的植物组织提取（Dudonne et al., 2009）。提取过程在60°C下超声处理30分钟，然后离心12,000 rpm 10分钟，收集上清液进行分析。将150 μL提取液与150 μL DPPH工作液混合，在黑暗中25°C孵育30分钟，再次离心后测定上清液的吸光度。使用Trolox标准曲线进行定量。DPPH●自由基清除能力按以下公式计算：
DPPH●自由基清除能力 = (0.351 × (清除率 % – 0.7084) / W) × D
其中W为样品的新鲜重量（克），D为稀释倍数。

**2.4. 广泛靶向UPLC-MS/MS代谢组学分析**
使用UPLC-MS/MS系统（Wuhan Metware Biotechnology Co., Ltd.）对五种猕猴桃品种的酚类代谢物进行广泛靶向分析。每种品种制备三个独立生物重复样本。新鲜果实冻干后研磨成细粉，取30毫克粉末用1500 μL冷却后的70%甲醇溶液提取，其中加入2-氯苯丙氨酸（1 ppm）作为内标。提取后旋涡混合并离心，上清液通过0.22 μm过滤器过滤进行分析。混合每个品种和重复样本的提取液制成质量控制（QC）样品，每6次注射后分析一次以评估仪器稳定性。色谱分离在Agilent SB-C18柱（2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm）上进行，温度设置为40°C，流动相为水（A）和乙腈（B），两者均添加0.1%甲酸，流速为0.35 mL/min，梯度洗脱程序如下：0–1分钟，5% B；1–9分钟，5–95% B；9–11分钟，95% B；11–11.1分钟，5% B；11.1–14分钟，5% B重新平衡。注射顺序在所有样本间随机分配，以减少系统偏差。质谱检测使用QTRAP? 6500+系统进行，该系统配备了电喷雾离子化源，可同时以正负两种模式（ESI+/?）工作。离子喷雾电压分别设定为5500 V（正模式）和-4500 V（负模式），源温度为500°C。仪器在单位分辨率（0.7 Da FWHM）下运行，适用于Q1和Q3的多个反应监测（MRM）模式，每个跃迁的停留时间为20 ms。数据采集采用了多个反应监测（MRM）模式，并根据Metware数据库（MWDB）确定的代谢物特异性跃迁和优化碰撞能量进行。应用了预设的MRM算法来监测定义保留窗口内的每个跃迁（Chen等人，2013年）。通过将代谢物的MS/MS谱和保留时间与MWDB中的数据进行匹配来鉴定代谢物。所有鉴定的多酚类物质及其分子式、MRM跃迁、CAS编号和鉴定置信度水平均记录在补充表S1中。根据代谢组学标准倡议（MSI）和COSMOS指南，化合物的注释被划分为1级、2级或3级：1级（MS/MS和保留时间匹配得分≥0.7），2级（匹配得分0.5–0.7），3级（Q1、Q3、保留时间、去聚类势和碰撞能量均匹配）。每种代谢物的具体级别列在补充表S1中。相对定量基于标准化峰面积，并经过了内标和样品重量的调整；没有计算半定量值（例如，各类酚类的总浓度）。

2.5. RNA测序和转录组数据分析
使用Trizol试剂（Invitrogen，北京，中国）从猕猴桃果肉样本中分离总RNA（每个品种三个生物学重复样本）。RNA的完整性和浓度通过Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，加州圣克拉拉）进行评估。文库构建和RNA测序由Berry Hekang Biotech（北京，中国）完成。按照制造商的协议，使用NEBNext Ultra? RNA Library Prep Kit（NEB，马萨诸塞州伊普斯威?）制备测序文库。配对末端测序（2 × 150 bp）在Illumina HiSeq 2500平台上进行（Illumina，上海，中国）。使用Cutadapt（v1.18）和FastQC（v0.11.8）对原始读段进行过滤，以去除接头序列和低质量读段，确保质量控制。使用HISAT2（v2.1.0）将清洁后的读段与Actinidia chinensis（Red5 v3；可访问地址：https://kiwifruitgenome.org/）的参考基因组对齐。基因表达水平通过StringTie（v2.1.3）以每百万映射读段中的转录片段数（FPKM）进行量化。使用Cuffdiff（v2.2.1）进行品种间的差异表达分析，阈值设为|log?(fold change)|≥1且*p*<0.05。基因的功能注释参考了多个数据库，包括京都基因组与基因组百科全书（KEGG）、基因本体（GO）、Pfam、Swiss-Prot、NCBI非冗余蛋白质序列（Nr）和同源基因组簇（KOG/COG）。GO富集分析使用GOseq R包（v2.18.0）进行，该软件应用了Wallenius非中心超几何分布。KEGG通路富集分析通过KOBAS 2.0完成。对于转录因子（TF）分析，将注释的基因集与Plant Transcription Factor Database（PlantTFDB v5.0）进行比对，以识别MYB家族成员。原始RNA-seq数据已上传至中国国家基因组库（CNGB），项目号为CNP0008694。

2.6. 无监督和有监督统计分析
2.6.1. 无监督多变量分析
为了探索五种猕猴桃品种间的代谢差异，首先对标准化代谢物数据进行了单位方差缩放，然后使用R语言中的stats包（v3.5.1）进行了无监督主成分分析（PCA），以可视化样品的整体聚类情况。所有代谢物在样本间的丰度模式也通过层次聚类分析（HCA）进行了研究，结果使用R语言中的circlize包（v0.4.15）以圆形热图的形式呈现（Chanana等人，2020年；Chong & Xia，2018年）。通过应用双阈值标准|log?FC|≥1.0和p值<0.05（来自Student's t检验），并进行假发现率（FDR）校正（Colquhoun，2014年），鉴定出各品种对之间的差异代谢物。使用R语言中的fmsb包（版本0.7.3，R版本4.2.0）生成了可视化前20个显著变化酚类化合物的雷达图。为了功能解释这些结果，使用差异代谢物数据生成了代谢物分类气泡图和分类散点图，结合了分类级别、log?FC值和显著性指标（ggplot2 v3.4.0，R v4.2.2）。对于关键的差异代谢物，根据|log?FC|值创建了前20种化合物的条形图以供可视化（ggplot2 v3.3.0，R v3.5.1）。使用CombinedHeatmap v2.12.0（R v4.2.0）分析了差异代谢物之间的成对相关性并进行可视化（Chong & Xia，2018年）。对于目标生化特性（如酚类化合物、自由基清除能力）的比较，使用Duncan的多重范围检验确定品种间的显著差异，显著性设为p<0.05。使用在线EVenn平台（https://www.bic.ac.cn/EVenn/#）创建了维恩图，以展示比较组间的共有和独特代谢物（Yang等人，2024年）。
2.6.2. 有监督正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）
正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）作为一种有监督的多变量方法被用来最大化五种猕猴桃品种之间的分离度，并识别出负责区分不同品种的代谢物（Thévenot等人，2015年）。该模型将代谢物数据（X矩阵）中的预测变异与物种标签（Y矩阵）相关联的部分与正交（非预测）变异区分开，从而提高了模型的可解释性。作为输入数据使用了经过Log?变换和均值中心化的相对定量数据。分析在R统计环境（版本3.5.1）中的MetaboAnalystR包（版本1.0.1）中进行。模型构建采用默认参数。模型质量通过解释方差参数R2X（X矩阵）和R2Y（Y矩阵）以及预测参数Q2进行评估。当Q2>0.5时，认为模型具有稳健性。通过随机打乱类别标签创建零模型来进行排列检验（n=200次），如果原始Q2值高于所有排列模型的Q2值，则认为模型具有显著性（Eriksson等人，2013年）。在投影中的变量重要性（VIP）得分>1.0的代谢物被视为对组间分离有显著贡献的代谢物。

3. 结果
3.1. 酚类代谢物的多样性和品种积累模式
广泛的目标代谢组学分析在五种猕猴桃品种中鉴定了190种酚类代谢物（图1A）。酚酸是最丰富的类别（58种化合物），其次是木脂素（48种）和香豆素（45种）。黄酮类化合物包括多个亚类，主要是黄酮（10种）、黄酮醇（8种）和黄烷酮（7种）。
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图1. 五种猕猴桃品种中的酚类代谢物组成：LC（A. arguta ‘Maolvfeng’）、WL（野生A. chinensis）、GC（A. chinensis ‘Guichang’）、SG（A. chinensis ‘SunGold’）和DY（A. arguta ‘Danyang flat’）。(A) 每个主要酚类类别中鉴定的代谢物数量。(B–E) （B）黄酮类、(C) 木脂素、(D) 香豆素、(E) 酚酸、(F) 总酚类（y轴表示化合物峰面积之和）以及(G) DPPH●自由基清除能力（μg TE/g FW）的含量。数值为平均值±标准误差（n=3）。不同的小写字母表示品种间的显著差异（Duncan检验，p<0.05）。
比较分析显示了各品种间酚类化合物的相对丰度存在明显差异（图1B–E）。‘SunGold’（SG）的总黄酮含量最高（图1B）。相比之下，A. arguta品种‘Danyang flat’（DY）在木脂素（图1C）和香豆素（图1D）的积累量上显著高于其他A. chinensis品种。在A. chinensis品种中，WL的木脂素和香豆素积累量高于GC和SG。SG和DY的酚酸含量也显著高于其他品种（图1E）。DY还具有最高的总酚类含量（图1F）和最强的DPPH●自由基清除能力（613.4 μg TE/g FW），其次是WL、LC、SG和GC（图1G），表明酚类含量与自由基清除能力之间存在明显关联。这些结果揭示了不同的酚类特征：SG富含黄酮类化合物，而DY则是木脂素和香豆素的显著积累者，并且具有整体的强自由基清除能力。
3.2. 代谢指纹清晰区分物种和品种
多变量分析显示五种猕猴桃品种之间存在显著的代谢差异，这主要由物种差异驱动。A. arguta（DY）与A. chinensis品种之间的成对比较显示出最多的差异代谢物，其中DY与GC之间的差异代谢物数量为151种（图2A）。相比之下，同一物种内的比较（例如，DY与LC）仅发现了67种差异代谢物，表明它们之间的代谢关系更为密切。维恩图显示有七种在所有比较中都存在的酚类代谢物（图2B）。PCA捕获了总方差的53.8%（PC1）和18.3%（PC2），在PC1上清晰地将A. arguta（DY, LC）与A. chinensis品种（GC, SG, WL）区分开（图2C）。相关性分析显示生物重复样本间的强正相关，证实了该方法的高可重复性（图2D）。HCA进一步展示了不同的积累模式：DY中高度丰富的代谢物组主要包含木脂素和香豆素，而SG中的另一组富含黄酮类化合物（图3）。这些结果表明，物种是代谢差异的主要决定因素，且在重复样本间具有高可重复性，为识别特定品种的酚类特征奠定了坚实的基础。
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图2. 多变量分析揭示了五种猕猴桃品种间的物种级代谢分离：LC（A. arguta ‘Maolvfeng’）、WL（野生A. chinensis）、GC（A. chinensis ‘Guichang’）、SG（A. chinensis ‘SunGold’）和DY（A. arguta ‘Danyang flat’）。(A) 九对比较中的差异代谢物计数（上调、下调、无变化、未检测到）。(B) 五种比较组间共有和独特差异代谢物的维恩图。(C) PCA得分图显示了品种聚类情况，以及PC1和PC2得分的箱线图；星号表示组间显著差异。(D) 相关性矩阵，右边上是皮尔逊系数热图，左边下方是选定代谢物对的散点图。
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图3. 五种猕猴桃品种中190种酚类代谢物的层次聚类分析（HCA）热图：LC（A. arguta ‘Maolvfeng’）、WL（野生A. chinensis）、GC（A. chinensis ‘Guichang’）、SG（A. chinensis ‘SunGold’）和DY（A. arguta ‘Danyang flat’）。行代表Z-score标准化的代谢物，列代表生物重复样本。PP1-PP40化合物的名称记录在补充表S3中。颜色渐变（从绿到红）表示相对丰度的从低到高。聚类显示了品种间的明显代谢物积累模式。（关于图中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。）
3.3. 有监督OPLS-DA验证分离并识别关键鉴别代谢物
构建并验证了一个有监督的OPLS-DA模型，以严格区分五种猕猴桃品种的酚类特征。该模型表现出极佳的拟合度和预测可靠性，具有高的解释方差（R2X, R2Y, P<0.005）和预测参数Q2>0.5（图4A）。通过200次排列检验确认了其稳健性，所有排列后的Q2值均显著低于原始模型的值（图4B），表明没有过拟合。OPLS-DA得分图显示了明显的品种分离，主要沿第一个预测组分2（t[1]，9.3%的方差）进行，而第二个正交组分2（to[1]，62.2%的方差）有效地将两种A. arguta品种（DY, LC）与三种A. chinensis品种（GC, SG, WL）区分开（图4C）。这种有监督的分离与先前的无监督分析结果一致。相应的S-图指出了对这种区分起主要作用的代谢物，其中在投影中变量重要性（VIP）>1.0的化合物用红色突出显示（图4D）。这些关键的鉴别标志物包括特定的酚酸、木脂素和黄酮类化合物，明确刻画了每个品种的独特代谢特征。因此，OPLS-DA模型不仅验证了物种和品种之间的稳健代谢分离，还识别出了一组可靠的化学标志物，可用于质量评估和选育。
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图4. 正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）验证了品种间的分离，并识别了关键的鉴别代谢物。分析了五种猕猴桃品种的酚类特征：LC（A. arguta ‘Maolvfeng’）、WL（野生A. chinensis）、GC（A. chinensis ‘Guichang’）、SG（A. chinensis ‘SunGold’）和DY（A. arguta ‘Danyang flat’）。(A) 模型验证指标（R2X, R2Y, Q2）显示了有效的预测性能（Q2>0.5）。(B) 排列检验（n=200）确认了模型的稳健性，所有排列后的Q2值（红色）均低于原始模型。（C) 分数图显示了沿预测组分（t[1]）的清晰品种分离；椭圆表示95%的置信区间。（D) S-图指出了有影响力的代谢物；VIP>1.0的化合物用红色突出显示。该模型证实了品种间的显著差异，并确定了特定的可靠化学标志物。（关于图中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。）3.4. 雷达图分析显示A. arguta中的木脂素和香豆素富集。对前20种差异代谢物的雷达图分析揭示了不同品种间的显著调控模式（图5）。种间比较显示了最明显的效果：LC（A. arguta）与GC和SG的雷达图几乎重叠，木脂素和香豆素显著上调（例如，schizandriside Wbwn004958，fraxin MWSmce025；log?FC高达10.7）（图5A，表1）。相比之下，种内比较（LC与DY，均为A. arguta）显示了对称的模式，表现为相互上调/下调（图5B，红色），而A. chinensis品种间的比较则显示出中等程度的、特定于品种的形状（图5C）。下载：下载高分辨率图像（583KB）下载：下载完整尺寸图像图5. 雷达图分析突出了A. arguta中木脂素/香豆素的极端种间差异。通过对五种猕猴桃品种（LC（A. arguta ‘Maolvfeng’）、WL（野生A. chinensis）、GC（A. chinensis ‘Guichang’）、SG（A. chinensis ‘SunGold’）和DY（A. arguta ‘Danyang flat’）进行成对比较，展示了20种显著改变的酚类化合物的分布情况：每个轴代表一种化合物，距离中心的距离表示其相对值。（A）LC与GC（红色）和LC与SG（蓝色）。（B）LC与DY（红色）和LC与WL（蓝色）。（C）GC与SG（红色）和SG与WL（蓝色）。（D）DY与GC（红色）和DY与WL（蓝色）。雷达图形状表明，种间差异比种内变异更为明显。（关于图中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。）表1. 猕猴桃品种间20种显著差异的酚类代谢物：LC（A. arguta ‘Maolvfeng’）与GC（A. chinensis ‘Guichang’）以及LC与SG（A. chinensis ‘SunGold’）的比较。序列号索引化合物类别LC与GCLC与SG倍数变化Log2FC类型倍数变化Log2FC类型1Wbwn004958Schizandriside木脂素1660.810.7上调306.88.3上调2Lmmn003041Isolariciresinol-9’-O-xyloside木脂素1497.910.5上调277.48.1上调3PDN042905G(8-O-4)Fa硫酸盐酚酸964.99.9上调155.57.3上调4MWSmce025Fraxin香豆素932.59.9上调164.07.4上调5Walp005894Cleomiscosin CCoumarins710.39.5上调4599.112.2上调6HJN054Secoisolariciresinol-9’-O-xyloside木脂素538.49.1上调130.77.0上调7Rfp026803-O-β-D-glucosyl-esculetin?Coumarins231.67.9上调107.56.7上调8Cmsn002480Secoisolariciresinol-9’-O-glucoside木脂素183.87.5上调34.85.1上调9Wdbn0053283,3’-Bis(3,4-dihydro-4-hydroxy-6,8-dimethoxy-2H-1-benzopyran)木脂素157.17.3上调29.14.9上调10Lmbn001162Cichoriin?Coumarins124.97.0上调81.36.3上调11PDN2400194-O- beta -D-glucosyl-daphnetin?Coumarins118.26.9上调83.66.4上调12MWStz526Daphnin?Coumarins117.96.9上调61.85.9上调13mws1015Esculin?Coumarins116.46.9上调75.16.2上调14pmb0382O-Feruloyl 4-hydroxycoumarinCoumarins102.36.7上调102.36.7上调15mws1150Echinacoside酚酸71.16.2上调71.16.2上调16Jmwn0021172,6-dimethoxybenzene-1,4-diol 1-O-β-D-glucopyranoside酚酸30.04.9上调177.47.5上调17Walp003242Isofraxidin 7-O-glucosylglucosideCoumarins46.25.5上调46.25.5上调18Rfmb26201Syringaresinol-4’-O-(6″-acetyl)glucoside木脂素42.55.4上调42.55.4上调19Waptp034096-Hydroxy-7-Methoxychromanon?Coumarins0.041?4.6下调0.008?6.9下调20pmb0618Hesperetin-8-C-glucoside-3’-O-glucosideFlavanones0.030?5.0下调0.003?8.2下调序列号索引化合物类别LC与DYLC与WLF倍数变化Log2FC类型倍数变化Log2FC类型1Lazn003953Erythro-Guaiacylglycerol-β-dihydroconiferyl Ether glucoside木脂素0.48?1.05下调25.294.66上调2Lhkp101525Apiosylskimmin (Adicardin)Coumarins1.560.65不显著22.334.48上调3pmb26017-Hydroxycoumarin-O-rhamnosideCoumarins0.75?0.42不显著17.674.14上调4Lmmn001894Demethylwedelolactone-3-O-glucosideCoumarins15.653.97上调15.653.97上调5Zmdp0082966-prenylapigeninFlavones11.573.53上调11.573.53上调6MWSmce4434-HydroxyderricinChalcones0.22?2.18下调7.912.98上调7Walp0039181-O-p-Coumaroylsedoheptulose酚酸6.792.76上调6.792.76上调8Zmxn0038747,8-Dihydro-Buddlenol BLignans0.12?3.06下调5.392.43上调9PDP0308782-(3,4-dihydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy-4H-chromen-4-oneFlavones7.872.98上调3.611.85上调10Lhmp121010Olivil Monoacetate木脂素0.08?3.71下调3.521.81上调11Lhhp102923(7′R,8′R)-7′8’-dihydro-7′-(5′-hydroxy-3′-methoxphenyl)-3-methoxy-8′-methyl-1-(E)-propenylbenzof-uran木脂素0.08?3.69下调0.19?2.41下调12Waptp034096-Hydroxy-7-Methoxychromanon?Coumarins0.09?3.40下调0.17?2.57下调13WaYn0021462-(Hydroxymethyl)Phenyl 2-O-Beta-d-Glucopyranosyl-Beta-D-Glucopyranoside酚酸0.28?1.83下调0.15?2.71下调14Zbsn004665VitexinFlavones0.10?3.32下调0.14?2.85下调15Lajp004824MedicarpinglucosideIsoflavone0.08?3.65下调0.14?2.86下调16mws1422(?)-EpiafzelechinFlavanols0.11?3.18下调0.12?3.04下调17pmb0108Feruloyl syringic acid酚酸0.06?4.17下调0.09?3.45下调18MWS20145Eriodictyol-7-O-glucosideFlavones0.07?3.84下调0.08?3.64下调19Wbtn0043811,3,6,8-tetrahydroxy-2,5-dimethoxyxanthen-9-oneFlavonoids0.18?2.49下调0.07?3.75下调20mws1013EsculetinCoumarins0.10?3.39下调0.06?4.15下调**表示异构体。**最不对称的轮廓出现在DY与GC的比较中：Walp005894（cleomiscosin C，log?FC 11.4）、MWSmce025（fraxin，10.9）、Lmmn003041（isolariciresinol-9′-O-xyloside，10.4）、Wbwn004958（schizandriside，10.3）和PDN042905（G(8-O-4)Fa sulfate，9.9）（图5D，红色）。DY与WL的比较在较低幅度上呈现出相似的模式（图5D，蓝色）。总体而言，雷达分析证实了物种层面的差异决定了主要的代谢框架，A. arguta品种（尤其是DY）表现出木脂素和香豆素的极端上调，而品种选择则以更温和的方式微调了这些轮廓。3.5. ‘Danyang flat’（DY）的酚类谱型相对于‘SunGold’（SG）富含木脂素和香豆素。为了解析高酚含量的A. arguta品种DY的独特代谢特征，与其商业品种A. chinensis SG进行了目标比较。类别显著性分析显示，木脂素和香豆素是这两个品种间变化最显著的酚类群体（图6A）。这些类别显示出最强的统计显著性（?log??(p-value)）和最高的VIP分数，用明显的向上指的三角形表示在DY中的显著上调。这种类别特异性的富集在气泡图中进一步详细说明（图6B），该图显示了在特定子类中的最显著上调，特别是呋喃木脂素和简单香豆素苷。在log?FC轴上位置较高的大气泡直观地证实了DY对这些化合物的特异性积累。下载：下载高分辨率图像（407KB）下载：下载完整尺寸图像下载：下载高分辨率图像（364KB）下载：下载完整尺寸图像图6. ‘Danyang flat’（DY，Actinidia arguta）与‘SunGold’（SG，Actinidia chinensis）猕猴桃之间的差异酚类谱型。(A) 基于类别的代谢物显著性。代谢物类别根据-log10(p-value)绘制；三角形表示上调/下调（VIP按大小缩放），点表示无显著变化。(B) 类别特异性调控的气泡图，代谢物按子类（x轴）和log2(FC)（y轴）排列；气泡大小反映显著性，颜色代表主要类别。(C) 按绝对log2(FC)排名的前20种代谢物；缩写名称（用“...”表示）在表2中列出。条形显示DY与SG之间的倍数变化方向和幅度（红色＝上调，绿色＝下调）。**关于图中颜色参考的解释，请参阅本文的网页版本。**这种差异的程度通过前20种差异代谢物量化（图6C和表2）。值得注意的是，其中19种在DY中显著更丰富。列表主要由VIP > 1.17的木脂素和香豆素主导，这确认了它们作为关键判别因素的作用（表2）。香豆素cleomiscosin C（Walp005894）表现出最显著的上调，倍数变化为17,484（log?FC 14.09）。其他主要贡献者包括香豆素fraxin（MWSmce025，log?FC 8.35）和木脂素olivil monoacetate（Lhmp121010，log?FC 8.08）以及isolariciresinol-9’-O-xyloside（Lmmn003041，log?FC 7.97）。在DY中下调的唯一代谢物是酚酸衍生物feruloylsinapoyltartaric acid（Lmhn003801，log?FC ?7.32），这更典型地属于SG的谱型（图6C）。这种比较分析明确表明，DY的代谢独特性在于其特定木脂素和香豆素生物合成途径的强有力、协调的上调，形成了与商业主导的SG根本不同的酚类特征。表2. DY（A. arguta ‘Danyang flat’）与SG（A. chinensis ‘SunGold’）猕猴桃品种之间前20种差异酚类代谢物。序列号索引化合物类别IVIPP值倍数变化Log2FC类型1Walp005894Cleomiscosin CCoumarins1.1710.00817,484.3914.09上调2MWSmce025FraxinCoumarins1.1710.000326.888.35上调3Lhmp121010Olivil MonoacetateLignans1.1710.006269.938.08上调4Lmmn003041Isolariciresinol-9’-O-xylosideLignans1.1710.002250.597.97上调5Wbwn004958SchizandrisideLignans1.1710.001226.177.82上调6Jmwn0021172,6-dimethoxybenzene-1,4-diol 1-O-β-D-glucopyranoside酚酸1.1710.001196.087.62上调7PDN042905G(8-O-4)Fa硫酸盐酚酸1.1700.002152.317.25上调8PDN2400194-O- beta -D-glucosyl-daphnetin?Coumarins1.1710.001148.737.22上调9Lmbn001162Cichoriin?Coumarins1.1710.000141.387.14上调10pmb0382O-Feruloyl 4-hydroxycoumarinCoumarins1.1710.003136.557.09上调11mws1015Esculin?Coumarins1.1700.000130.077.02上调12MWStz526Daphnin?Coumarins1.1710.004115.506.85上调13mws1150Echinacoside酚酸1.1650.055115.456.85上调14Rfp026803-O-β-D-glucosyl-esculetin?Coumarins1.1700.009111.266.80上调15Lmjp002764Umckalin (7-hydroxy-5,6-dimethoxycoumarin)Coumarins1.1680.02195.616.58上调16Wdbn0053283,3’-Bis(3,4-dihydro-4-hydroxy-6,8-dimethoxy-2H-1-benzopyran)Lignans1.1710.00188.616.47MYB表达与代谢物丰度之间的强相关性突显了转录调控在苯丙素物质流动分配中的作用，其中MYB家族成员作为分子开关，指导碳流向途径的特定分支。这种调控模块化在其他水果作物中也观察到类似现象，例如苹果和蓝莓，不同的MYB亚群分别调控木质素、黄酮类化合物和香豆素的生物合成（G. He等人，2023年；Thakur和Vasudev，2022年）。在DY中发现以木质素和香豆素为主的表型对食品化学和人类营养具有重要意义。木质素如异愈创木酚和丁香木酚衍生物是公认的植物雌激素，具有抗氧化、抗炎和心脏保护作用（Osmakov等人，2022年）。它们还被肠道微生物群转化为肠木质素，后者具有益生元和调节激素的作用（Burgberger等人，2025年；Osmakov等人，2022年）。香豆素类化合物包括 Fraxin、daphnin 和 cleomiscosin C，具有强大的自由基清除和抗炎活性，一些研究还指出它们可以调节葡萄糖代谢和血管功能（Kumari等人，2023年；Singh等人，2025年）。DY中这些化合物的高丰度使其具有作为功能性食品的潜力，具有广泛的营养健康价值。与通常与猕猴桃相关的以黄酮类为中心的抗氧化特性相比，DY中的木质素/香豆素富集代表了独特的植物化学特性，扩展了猕猴桃属植物的功能多样性。此外，木质素和香豆素之间的协同抗氧化作用可能解释了DY中观察到的异常高的DPPH●自由基清除能力（图1G），因为这些化合物可以通过氧化还原循环相互再生自由基中间产物（Burgberger等人，2025年；Singh等人，2025年）。除了营养价值外，鉴定出的关键区分性代谢物（VIP > 1.0；图4D）及其相关的MYB调控因子为靶向育种和代谢工程提供了双生物标志物框架。OPLS-DA和PCA模型中观察到的强烈物种间差异证实了酚类成分是猕猴桃属植物分类的可靠化学标志物。这些生物标志物可用于培育具有定制植物化学特性的品种——要么富含木质素/香豆素以提升营养和功能性，要么富含黄酮类以增强色泽和感官吸引力。将代谢组学和转录组学标志物整合到育种流程中符合精准园艺的当前趋势，即基于代谢物质量指标进行基因组选择（Duan等人，2025年；Rao、Wang等人，2025年；Razzaq等人，2022年）。类似的育种策略也被提出用于提高作物的抗逆性和营养价值（Z. He等人，2024年）。此外，这里鉴定出的MYB候选基因是功能性验证和潜在CRISPR介导的调控的目标，以微调猕猴桃中的酚类生物合成。尽管目前的研究为MYB相关的代谢分化提供了令人信服的证据，但仍存在一些局限性需要考虑。虽然转录组学相关性在统计上很显著，但仍需通过基因过表达或沉默进行功能验证以确认调控因果关系。我们没有对鉴定出的MYB基因进行RT-qPCR验证；然而，RNA-seq数据的高重复性和强烈的代谢物相关性支持了观察到的表达模式。未来的研究应包括基于qPCR或CRISPR的功能测定来验证这些MYB调控因子。此外，代谢组学数据基于相对定量；对关键木质素和香豆素的绝对定量将增强营养学解释的准确性。我们还意识到，由于猕猴桃苯丙素途径中的许多关键酶基因尚未被表征，且本研究的重点是鉴定MYB调控因子，因此未系统整合结构酶基因表达与代谢物谱型。这是未来研究的一个有价值方向。未来的研究应结合酶活性测定、 promoter分析以及亚细胞定位研究，以阐明精确的调控机制。将分析扩展到更多猕猴桃种质资源可以进一步阐明该属内酚类特化的进化轨迹。虽然DPPH测定提供了可靠的自由基清除能力指标，但它是一种体外化学方法。细胞抗氧化活性测定将提供更为生理相关的见解，这类分析已计划在未来研究中进行。

**5. 结论**
总体而言，本研究建立了MYB转录调控与猕猴桃属物种特异性酚类代谢之间的联系。‘Danyang flat’品种展示了以木质素/香豆素为主的代谢策略，具有出色的自由基清除能力，而‘SunGold’品种则表现为以黄酮类为主的表型。这些发现不仅加深了我们对苯丙素分配的生化理解，还强调了未充分利用的‘A. arguta’种质作为功能性食品开发和育种创新生物活性化合物来源的潜力。未来的研究应重点关注候选MYB调控因子的功能验证、下游酶动力学的阐明以及环境对酚类流动的调控作用。这种综合性方法将加速设计出基于代谢信息的高价值猕猴桃品种的育种策略。

**作者贡献**
概念构思：M.D.、S.Y. 和 M.J.R.；方法学：M.D. 和 J.C.；软件：M.D.、S.H. 和 M.J.R.；调查：M.D.、J.C.、S.H.、Y.L.、M.T.、C.C.、T.L.、J.D.、S.Y.、Q.A. 和 X.D.；原始稿撰写：M.D. 和 M.J.R.；审阅和编辑：所有作者；监督：M.D.、S.Y. 和 M.J.R.；资金获取：M.D.、Q.A. 和 S.Y.。所有作者均已阅读并同意手稿的最终版本。

**CRediT作者贡献声明**
段明正：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、可视化、资源管理、方法学、调查、资金获取、数据分析、概念构思。
常杰宇：可视化、验证、资源管理、方法学、数据分析。
何仕荣：可视化、验证、资源管理、方法学、数据分析。
陈园桥：可视化、验证、资源管理、方法学、数据分析。
卢婷芬：可视化、验证、软件使用、调查、数据管理。
段金瑞：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、软件使用、资源管理、调查。
段西安德：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、软件使用、调查。
Qurban Ali：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、调查、资金获取、数据管理、概念构思。
杨顺强：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、调查、数据管理。

**资金信息**
本研究得到了阿拉伯联合酋长国提供的博士后气候行动资助（#12S140）、青年和中年学术及技术人才储备项目（资助编号202305AC160057）以及云南人才支持计划青年人才项目（资助编号210604199008271015）的共同支持。

**未引用参考文献**
Rao等人，2025年