采用非破坏性方法检测藏红花掺假：傅里叶变换红外光谱、可见近红外光谱、数据融合及化学计量学

《Food Control》：Detecting saffron adulteration with non-destructive approaches: Fourier-transform infrared and visible near-infrared spectroscopy, data fusion, and chemometrics

　　奥耶尔·胡拉多·马丁（Oier Jurado Martin）、霍尔迪·克鲁斯·桑切斯（Jordi Cruz Sanchez）、何塞·曼努埃尔·阿米戈（Jose Manuel Amigo）
巴斯克大学（UPV/EHU）分析化学系，西班牙巴斯克地区莱奥亚（Leioa），邮编48940

摘要：
藏红花市场一直受到欺诈行为的困扰，例如用更便宜的物质混合或添加人工色素。为了解决这个问题，人们使用了高效液相色谱或气相色谱结合质谱等色谱技术来灵敏且选择性地检测掺杂物。此外，还采用了薄层色谱（TLC）与紫外-可见光谱法等互补方法。然而，这些技术存在显著缺点，包括需要样品制备、样品破坏，以及在某些情况下使用化学试剂。本文提出了一种综合性的比较方法，结合了多种快速、非破坏性的光谱技术，如傅里叶变换红外光谱（FTIR-ATR）以及可见光和近红外光谱（NIR），并配合适当的化学计量算法。这些方法因其快速、非破坏性的特点、无需样品制备以及易于微型化的优势而显得尤为宝贵。此外，将这些方法结合起来形成的融合模型已被证明在检测掺杂物方面非常有效，准确率可达到90%至100%，预测/测试误差（RSEP）仅为0.56%，R2值高达0.98。

引言
香料在塑造全球各社会的烹饪和文化景观方面一直扮演着重要角色（Jafari-Ghanavati & Saket, 2020）。在众多的香料中，藏红花因其鲜艳的颜色、优雅的香气和细腻的风味而备受推崇。藏红花源自番红花（Crocus sativus）的花柱，常被称为“红色黄金”，广泛应用于从波斯和印度到地中海及更远地区的各种菜肴中（José Bagur et al., 2017; Yildiz & ?eliK, 2025）。根据ISO 3632标准，藏红花中不应含有任何人工色素（José Bagur et al., 2017; Ryparova Kvirencova et al., 2023）。然而，由于生产成本高和市场价值高，藏红花容易受到欺诈、掺杂和假冒的影响。高昂的价格及其有限的种植区域使其成为非法行为的 targets（Ryparova Kvirencova et al., 2023）。历史上，人们常将价格较低、易于获取但外观相似的植物材料混入藏红花中（Petrakis & Polissiou, 2017a）。表1总结了藏红花中最常见的掺杂物（基于Koocheki & Milani, 2020），这些掺杂物包括植物部分和合成化学物质，它们在藏红花的加工或销售过程中被秘密添加（Fernandez, 2004）。藏红花的各种掺假方式引起了生产者和消费者的担忧，因此需要快速检测方法来评估可能的掺假情况及其程度（Petrakis & Polissiou, 2017a）。

色谱技术仍是食品检测欺诈的主要手段（Kumari et al., 2021），通过详细分析藏红花的化学成分，可以可靠地区分纯品和掺假品（Koocheki & Milani, 2020; Kumari et al., 2021）。薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）（通常与质谱或紫外检测器联用）是常用的检测方法（Amirvaresi et al., 2020; Bhooma et al., 2024; Eghbali et al., 2023; Koocheki & Milani, 2020; Morozzi et al., 2019）。例如，Haghighi等人（2007）利用HPLC-UV技术识别了藏红花中的关键色素并评估了外来天然色素的存在。当质谱与TLC或HPLC结合使用时，分析能够提供更全面的信息，从而更准确地了解藏红花的化学成分和整体质量（Guijarro-Díez et al., 2017b, 2017a; Sabatino et al., 2011; Sujata et al., 1992）。然而，这些方法存在实际问题：它们具有破坏性，需要耗时的样品制备（包括提取、过滤和有时还需要衍生化处理），并且依赖于溶剂、色谱柱和参考标准等昂贵的耗材，因此不适合高通量筛查或供应链中的现场检测。此外，它们通常针对一组已知的标记化合物（如 Crocin、picrocrocin 或 safranal），因此可能无法检测到欺诈者使用的新型或变化型掺杂物（Amirvaresi et al., 2020; Koocheki & Milani, 2020; Kumari et al., 2021）。即使样品中不含常见的掺杂物标志物，也可能仍为假冒产品（这是单一检测方法无法完全规避的风险）。这些方法在处理异质或经过最小处理的样品（如与外观相似的植物材料混合的藏红花）时也面临挑战，而此时需要快速、全面的筛查。

与传统的靶向方法相比，振动光谱技术提供了一种快速、非破坏性的替代方案，所需的样品制备工作极少。这些技术不是分离特定化合物，而是捕捉样品的整体“化学指纹”。这种向模式识别的转变使光谱技术在现实世界的筛查和现场检测中变得非常实用。其中，紫外-可见光谱（UV-Vis）因其低成本和简便性而受到青睐。然而，对于藏红花来说，由于其强烈的 crocin 光谱特征容易掩盖许多天然和人工掺杂物的存在，因此其效果有限（Ordoudi et al., 2017; Varliklioz Er et al., 2017）。由于 UV-Vis 对颗粒大小和散射等物理因素敏感，因此在没有高级数据分析的情况下，其独立鉴别能力较弱。

红外技术，如傅里叶变换红外光谱（FTIR-ATR）和中红外光谱（MIR），可以弥补这些不足。通过测量官能团的独特振动，它们能够有效区分真正的藏红花和天然掺杂物（如万寿菊或姜黄），前提是样品需先脱水以防止水分干扰（Kumari et al., 2021; Lee et al., 2015; Petrakis & Polissiou, 2017b; Varliklioz Er et al., 2017）。MIR 和 FTIR 还被成功用于追踪藏红花的地理来源（Elhamdaoui et al., 2022）以及检测细微的欺诈行为（如混合使用陈旧的花柱）（Foschi et al., 2022）。近红外光谱（NIR）通过测量异原子键振动（Pasquini, 2003），能够同时识别多种掺杂物（Shawky et al., 2020）。比较研究表明，当与适当的模型结合使用时，NIR 和 MIR 的检测效果非常可靠（Amirvaresi et al., 2021），而将可视-近红外成像与空间数据结合使用可以进一步提高分类精度（Alighaleh et al., 2023）。拉曼光谱基于非弹性光子散射，能够检测红外技术无法识别的对称化学键，并且具有穿透透明包装的独特优势（Kumari et al., 2021; Wokaun, 1996）。例如，拉曼光谱结合化学计量学可以通过识别藏红花特有的 crocetin 带来鉴定植物基掺杂物（Burgio & Clark, 2001; Varliklioz Er et al., 2017）。

然而，现代光谱技术生成了大量复杂的数据集，仅查看单个光谱带是不够的——尤其是当掺杂物与真品具有相似化学特性时（Cárdenas-Escudero et al., 2023; Naim et al., 2022）。因此，多变量数据分析（如偏最小二乘回归 PLS）和化学计量学至关重要。它们提供了理解这些整体光谱数据的数学框架，即使光谱差异非常微妙或被主要成分掩盖，也能稳健地量化掺杂物（Elhamdaoui et al., 2022; Petrakis & Polissiou, 2017b）。除了依赖单一光谱技术外，数据融合也成为食品认证中的宝贵策略，因为它将互补的光谱信息整合到一个多变量模型中。由于不同技术捕获不同的化学特征（如 MIR 振动、NIR 奇偶次数和可见光范围内的电子跃迁），融合可以提高方法的稳健性、灵敏度和预测性能，尤其是在掺杂物含量低或材料化学性质相似的情况下（Azcarate et al., 2021; Cocchi, 2019）。当低水平融合与变量选择方法结合使用时，还可以减少噪声和共线性，使模型更专注于化学相关的信息，从而更具解释性。

尽管早期研究表明光谱技术在藏红花认证中很有用，但大多数研究要么依赖单一数据集，要么假设融合会自动带来更好的结果。实际上，在植物学上相似的样本中检测细微的欺诈行为仍然具有挑战性。因此，本研究的创新之处在于采用了一种综合性的化学计量方法，详细评估了 FTIR-ATR、UV-Vis 和 NIR 等单独技术，并与 iPLS、VIP 和 s-Ratio 等变量选择方法结合使用的优化模型进行了对比。这种方法旨在确定整合不同光谱域是否能真正带来分析优势，或者是否会引入交叉干扰和冗余噪声。通过在不同实验条件下系统评估这些模型，旨在建立一种稳健的框架，以实现藏红花掺杂物的非破坏性定量，同时最小化变异性来源的干扰。本研究探讨了 FTIR-ATR 和 UV-Vis 光谱与多变量建模结合在检测和量化藏红花掺入辣椒粉和姜黄时的潜力。为此，开发了针对 FTIR-ATR、NIR、可见光以及 NIR-可见光数据集的偏最小二乘回归模型，并研究了低水平数据融合策略，以整合来自不同模式的互补光谱信息。需要注意的是，本研究的目的是提供一种受控的比较评估方法，而不是开发一个通用的工业模型，而是为未来涉及更复杂和具有代表性样本集的研究提供方法论基准。

变量选择方法，包括区间 PLS（iPLS, N?rgaard et al., 2000）、变量重要性投影（VIP, Chong & Jun, 2005）和选择性比率（s-Ratio, Rajalahti et al., 2009），被用于识别最具信息性的光谱区域，并评估融合模型是否优于单一技术模型。选定的光谱区域根据藏红花、姜黄和辣椒粉的特征振动和电子特性进行解读，从而为多变量模型提供化学上的见解，并支持所提出方法的相关性。

样本制备
本研究使用的香料（包括藏红花、辣椒粉和姜黄粉）均购自当地超市。初始购买的藏红花条状物经过纯度认证，证书见补充材料（S1）。藏红花条状物首先被研磨成粉末以制备样品，其他香料则直接购买粉末形式。共准备了16个样品，其中9个样品被掺入了杂质。

如图4所示，纯藏红花的中红外光谱显示出几个与主要成分直接相关的谱带，这些谱带在图5的混合物光谱中仍然可见（Petrakis & Polissiou, 2017b）。Crocins 是 crocetin 的二糖和三糖酯，具有强烈的羰基和酯信号（Field, 2008; Mecozzi et al., 2012; Vollhardt, 2010）。大约在1730–1706 cm-1处的谱带对应于酯类 C=O 酯键。

结论
本研究系统地评估了快速、非破坏性的光谱技术与化学计量学在检测和量化藏红花掺入辣椒粉和姜黄方面的应用。在评估的技术中，FTIR-ATR 结合 PLS 回归被证明是最具信息量和可靠性的分析方法，在整个检测范围内显示出最低的预测误差和最高的线性。这证实了中红外光谱技术的有效性。

作者贡献声明
何塞·曼努埃尔·阿米戈·鲁比奥（Jose Manuel Amigo Rubio）：负责撰写、审稿与编辑、可视化处理、验证、方法论制定、研究设计、资金获取、数据分析、概念化。
霍尔迪·克鲁斯·桑切斯（Jordi Cruz）：负责撰写、审稿与编辑、可视化处理、验证、监督、方法论制定、研究设计、资金获取、数据分析、概念化。奥耶尔·胡拉多·马丁：写作——原始草稿、可视化、方法论、调查、形式分析、数据整理
未引用的参考文献：Laura等人，2011年。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的、可能影响本文研究工作的财务利益或个人关系。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取，具体流程需遵循合理请求原则。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的、可能影响本文研究工作的财务利益或个人关系。

致谢
本研究部分得到了CYTED项目下的RITACI-425RT0173合作项目的支持。